Name: Monitorización a largo plazo de las tasas de consumo de oxígeno en cultivos epiteliales de pigmento retiniano altamente diferenciados y polarizados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprende a medir tasas de consumo de oxígeno en cultivos de epitelio pigmentario retiniano altamente diferenciados usando el dispositivo Resipher. Este método permite monitoreo prolongado bajo condiciones óptimas de cultivo celular.

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Agradecemos a los Dres. Daniel Hass y Jim Hurley por la idea de probar la solubilidad delO2 en medios nuevos frente a medios condicionados como control. Agradecemos a la Dra. Magali Saint-Geniez por su aporte editorial sobre el manuscrito. Agradecemos a Scott Szalay de Instrument and Electronic Services Core, Kellogg Eye Center, por adaptar la cámara de hipoxia con el cable USB Resipher. No se utilizaron fondos federales para la investigación de HFT. El Núcleo de Servicios Electrónicos cuenta con el apoyo de la EY007003 P30 del Instituto Nacional del Ojo. Este trabajo cuenta con el apoyo de una subvención departamental sin restricciones de Investigación para Prevenir la Ceguera (RPB). J.M.L.M. cuenta con el apoyo de la Iniciativa James Grosfeld para la Degeneración Macular Relacionada con la Edad Seca, la Fundación E. Matilda Ziegler para Ciegos, una subvención del banco de ojos Eversight, una subvención K08EY033420 del Instituto Nacional del Ojo y el apoyo de Dee y Dickson Brown, así como de la Fundación David y Lisa Drews Discovering Hope. D.Y.S. cuenta con el apoyo del Programa Scientia de la UNSW. L.A.K. cuenta con el apoyo del Premio Iraty, Monte J. Wallace, Michel Plantevin, una beca R01EY027739 del Instituto Nacional del Ojo y el VR220059 de Actividad de Adquisición de Investigación Médica del Ejército del Departamento de Defensa.

Nuevo sistema de monitorización de OCR para cultivos de EPR diferenciados

<ol><li>Shu, D. Y., Butcher, E., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT+and+EndMT%3A+emerging+roles+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">EMT and EndMT: emerging roles in age-related macular degeneration.</a> Int J Mol Sci. 21 (12), 4271(2020).</li>
<li>Shu, D. Y., Lovicu, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+transdifferentiation%3A+the+dark+force+in+ocular+wound+healing+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast transdifferentiation: the dark force in ocular wound healing and fibrosis.</a> Prog Retin Eye Res. 60, 44-65 (2017).</li>
<li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retina+metabolism+and+metabolism+in+the+pigmented+epithelium%3A+a+busy+intersection%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retina metabolism and metabolism in the pigmented epithelium: a busy intersection.</a> Annu Rev Vis Sci. 7, 665-692 (2021).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+RPE+mitochondria+energetics+leads+to+subretinal+fibrosis+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Deficient RPE mitochondria energetics leads to subretinal fibrosis in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2420(2023).</li>
<li>Hansman, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+the+retinal+pigment+epithelium+by+cytokines+associated+with+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of the retinal pigment epithelium by cytokines associated with age-related macular degeneration.</a> Biosci Rep. 44 (4), BSR20231904BSR20231904(2024).</li>
<li>Li, K. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+pyruvate+kinase+M2+activity+as+a+therapy+in+a+primary+RPE+cell+culture+model+of+proliferative+vitreoretinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of pyruvate kinase M2 activity as a therapy in a primary RPE cell culture model of proliferative vitreoretinopathy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 62 (8), 2213(2021).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+stem+cells-based+replacement+therapy+for+retinal+pigment+epithelium%3A+in+vitro+differentiation+to+in+vivo+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Progress in stem cells-based replacement therapy for retinal pigment epithelium: in vitro differentiation to in vivo delivery.</a> Stem Cells Transl Med. 12 (8), 536-552 (2023).</li>
<li>Wilson, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+distribution+and+vascular+injury+in+the+mouse+eye+measured+by+phosphorescence-lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Opt%22%5BJournal%5D)">Oxygen distribution and vascular injury in the mouse eye measured by phosphorescence-lifetime imaging.</a> Appl Opt. 44 (25), 5239-5248 (2005).</li>
<li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium+depth+influences+O2+availability+and+metabolism+in+human+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Medium depth influences O2 availability and metabolism in human RPE cultures.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (14), 4(2023).</li>
<li>Shu, D. Y., Butcher, E. R., Saint-Geniez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+PGC-1%CE%B1+drives+metabolic+dysfunction+in+TGF%CE%B22-Induced+EMT+of+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Suppression of PGC-1α drives metabolic dysfunction in TGFβ2-Induced EMT of retinal pigment epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (9), 4701(2021).</li>
<li>Shu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimethyl+fumarate+blocks+tumor+necrosis+factor-alpha-driven+inflammation+and+metabolic+rewiring+in+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dimethyl fumarate blocks tumor necrosis factor-alpha-driven inflammation and metabolic rewiring in the retinal pigment epithelium.</a> Front Mol Neurosci. 15, 896786(2022).</li>
<li>Ng, P. Q., Saint-Geniez, M., Kim, L. A., Shu, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+metabolomic+signatures+of+TGF%CE%B22+and+TNF%CE%B1+in+the+induction+of+retinal+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolites%22%5BJournal%5D)">Divergent metabolomic signatures of TGFβ2 and TNFα in the induction of retinal epithelial-mesenchymal transition.</a> Metabolites. 13 (2), 213(2023).</li>
<li>Kar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choriocapillaris+impairment+is+associated+with+delayed+rod-mediated+dark+adaptation+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Choriocapillaris impairment is associated with delayed rod-mediated dark adaptation in age-related macular degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (12), 41(2023).</li>
<li>Curcio, C. A., Kar, D., Owsley, C., Sloan, K. R., Ach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%2C+a+mathematically+tractable+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration, a mathematically tractable disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (3), 4(2024).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+study+of+retinal+pigment+epithelial+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Experimental models for study of retinal pigment epithelial physiology and pathophysiology.</a> J Vis Exp: JoVE. (45), e2032(2010).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platform+for+assessing+outer+segment+fate+in+primary+human+fetal+RPE+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures.</a> Exp Eye Res. 178, 212-222 (2019).</li>
<li>Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triphasic+developmentally+guided+protocol+to+generate+retinal+pigment+epithelium+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells.</a> STAR Protoc. 3 (3), 101582(2022).</li>
<li>Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+spare+respiratory+capacity%3A+Mechanisms%2C+regulation%2C+and+significance+in+non-transformed+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells.</a> FASEB J. 34 (10), 13106-13124 (2020).</li>
<li>Rosenfeld, P. J., Trivizki, O., Gregori, G., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+the+hemodynamic+model+of+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">An update on the hemodynamic model of age-related macular degeneration.</a> Am J Ophthalmol. 235, 291-299 (2022).</li>
<li>Fitch, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+bioenergetics+in+primary+human+retinal+pigment+epithelial+cells+using+high-resolution+respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of bioenergetics in primary human retinal pigment epithelial cells using high-resolution respirometry.</a> J Vis Exp: JoVE. (192), (2023).</li>
<li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Mol Vis. 24, 425-433 (2018).</li>
<li>Grumbine, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+and+assessing+various+tissue+and+cell+types+of+the+eye+using+a+novel+pumpless+fluidics+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system.</a> J Vis Exp: JoVE. (197), (2023).</li>
<li>Mu, C., Shearer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+measuring+respiratory+function+of+mitochondria+in+frozen+colon+tissue+from+rats%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for measuring respiratory function of mitochondria in frozen colon tissue from rats.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102560(2023).</li>
<li>Rocha, D. S., Manucci, A. C., Bruni-Cardoso, A., Kowaltowski, A. J., Vilas-Boas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+and+robust+method+to+evaluate+metabolic+fluxes+in+primary+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical and robust method to evaluate metabolic fluxes in primary pancreatic islets.</a> Mol Metab. 83, 101922(2024).</li>
<li>Kanaan, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystine%2Fglutamate+antiporter+xCT+controls+skeletal+muscle+glutathione+redox%2C+bioenergetics+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Cystine/glutamate antiporter xCT controls skeletal muscle glutathione redox, bioenergetics and differentiation.</a> Redox Biol. 73, 103213(2024).</li>
<li>da Veiga Moreira, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+metabolic+therapy+restrains+in+vivo+ovarian+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Methylene blue metabolic therapy restrains in vivo ovarian tumor growth.</a> Cancers. 16 (2), 355(2024).</li>
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</ol>

Richard A. Bryan y Kin Lo son empleados de Lucid Scientific, que fabrica el sistema Resipher.

El metabolismo mitocondrial del EPR desempeña un papel fundamental en la patogénesis de las enfermedades comunes de la retina que causan ceguera, como la DMAE y la RVP. El modelado del metabolismo mitocondrial del EPR in vitro permite aislar su estado metabólico del de los tejidos circundantes, además de someter al tejido a diferentes agresiones que simulan la enfermedad de forma controlada. Este modelado in vitro del metabolismo mitocondrial del EPR se ha visto facilitado por el advenimiento de cultivos primarios humanos de alta fidelidad y de iPSC-EPR que alcanzan el estado de diferenciación y la polaridad adecuados necesarios para aproximarse estrechamente al EPR in vivo. Si bien el monitoreo de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) en tales cultivos es un método ideal para monitorear el metabolismo mitocondrial, la configuración para el monitoreo de OCR a menudo impide el crecimiento de cultivos en las condiciones necesarias para un EPR altamente polarizado y completamente diferenciado. Aquí, describimos Resipher como un sistema novedoso para monitorear el metabolismo mitocondrial de RPE a través de la evaluación a largo plazo en tiempo real de OCR en cultivos de RPE altamente diferenciados y polarizados.
Se han utilizado otros métodos para monitorizar el OCR en el RPE. El analizador Seahorse XF está diseñado para monitorizar el OCR durante cortos periodos de tiempo con manipulaciones agudas de la función mitocondrial. Sin embargo, los ensayos de caballito de mar requieren que las células se cultiven en placas personalizadas, que no son propicias para soportar una alta polaridad y diferenciación de RPE21. Calton, Vollrath y sus colegas adaptaron el Seahorse para la evaluación de cultivos de EPR altamente diferenciados cultivados en soportes microporosos cortando la membrana microporosa en pedazos y colocándolos en la placa del caballito de mar, pero este método solo funciona para el monitoreo a corto plazo y en el punto final de los cultivos, ya que las células no tienen acceso al CO2 Durante el ensayo, el ensayo solo se puede realizar en condiciones no estériles, y el corte del soporte microporoso inducirá la muerte y la disfunción de la parte del borde del soporte microporoso con el tiempo22. El Barofuse es un sistema de perfusión sin bomba en el que se pueden cargar en el sistema de perfusión tiras de EPR cultivadas en soportes microporosos, lo que permite monitorizar el OCR en tiempo real23. De manera similar a la configuración modificada para el caballito de mar por Calton, Vollrath y sus colegas, las principales limitaciones de la evaluación del EPR con Barofuse son la necesidad de cortar los soportes microporosos y la naturaleza a corto plazo del punto final del ensayo. El Oxygraph también está diseñado para cambios cinéticos rápidos en OCR en respuesta a manipulaciones metabólicas24. No se ha utilizado para cultivos de EPR y sufriría las mismas limitaciones para evaluar cultivos de EPR altamente polarizados y diferenciados que el caballito de mar y el Barofuse.
A diferencia de estos otros métodos, el sistema de OCR descrito aquí permite la monitorización del OCR mientras el RPE se cultiva en placas/sustratos de cultivo celular estándar en condiciones estándar con medios de RPE estándar en una incubadora de CO2 de cultivo celular estándar, lo que proporciona un sondeo fácil y conveniente de cultivos de RPE altamente diferenciados y polarizados. Además de generar datos sobre los cambios de OCR en tiempo real por parte del sistema, esas mismas celdas se pueden utilizar para ensayos adicionales al final del período de monitoreo de OCR. Esto permite experimentos muy flexibles en los que el efecto de una intervención sobre el OCR se prueba repetidamente durante un período de semanas (por ejemplo, la inducción de RPE EMT en la Figura 5) o en los que se puede probar la recuperación a largo plazo de una intervención (por ejemplo, la recuperación del desacoplamiento mitocondrial en la Figura 3) o en los que se pueden monitorizar los cambios metabólicos en cascada en respuesta a una intervención inicial (por ejemplo, los efectos del suero en el OCR una vez que se agotan los nutrientes del medio en la Figura 2). El sistema de OCR en este documento es particularmente conveniente para medir el OCR en cultivos de RPE altamente polarizados y diferenciados. Tales cultivos son funcionalmente postmitóticos, con empaquetamiento apretado y pigmentación pesada. Esto significa que cada pocillocontiene números de celda casi idénticos, lo que evita la necesidad de normalizar el OCR con el número de celda para la mayoría de los experimentos. Incluso cuando se requiere la normalización al número de células, la fuerte pigmentación del EPR y los bordes celulares bien demarcados permiten que la normalización ocurra con un recuento de células simple no invasivo basado en imágenes de campo claro. Para los experimentos que involucran RPE indiferenciado y proliferación de RPE, como los experimentos de EMT en la Figura 5, se hace necesario normalizar el OCR por pocillo al número de células para saber qué es el OCR "por célula".
Fuera del campo de la retina, el sistema se ha empleado para estudiar la respiración celular y la actividad metabólica en varios tipos de células, incluidas las células de los islotes pancreáticos25, el músculo esquelético26, el cáncer de ovario27, los cardiomiocitos28 e incluso organismos completos, como C. elegans29. El monitoreo en tiempo real y a largo plazo de OCR utilizando el sistema de OCR descrito aquí reveló información clave sobre los cambios bioenergéticos y la disfunción mitocondrial en estos diversos modelos de enfermedades.
El sistema Resipher tiene limitaciones. El método para determinar el OCR es fundamentalmente diferente al analizador Seahorse, BaroFuse u Oxygraph. Requiere el establecimiento de un gradiente de O2 para calcular el OCR, y el gradiente puede tardar horas en establecerse. Por lo tanto, los experimentos cinéticos rápidos, posibles en los otros sistemas, no son posibles con este sistema. Además, a diferencia de los otros sistemas, Resipher no tiene ningún puerto de inyección para la entrega rápida de moléculas pequeñas o la recolección de metabolitos. En su lugar, se debe retirar la tapa de detección en una campana de cultivo celular, y se deben introducir fármacos o sustituir los medios, junto con la recogida manual de los metabolitos que se van a analizar.
Para establecer y solucionar problemas de un experimento mediante el sistema de OCR descrito en este documento, se recomienda lo siguiente. En primer lugar, minimice la evaporación. Recordemos que el gradiente de O2 en la columna de medios por encima de la monocapa RPE depende en gran medida de la altura de la columna9, y el sistema calcula el OCR en función del gradiente de O2 . Por lo tanto, si hay una marcada disminución de la columna de medios durante el experimento debido a la evaporación, el gradiente de O2 cambiará, afectando las lecturas de OCR. Mantener llena la bandeja de agua de la incubadora es fundamental, pero también se sugiere que el agua se coloque en todos los pozos no utilizados de la placa de 96 pocillos. Además, los pozos en el borde de la placa tienen tasas de evaporación más altas, por lo que estos pozos se dejan vacíos de células en los experimentos típicos presentados anteriormente. El sensor de humedad del sistema OCR puede ayudar a controlar la humedad de la incubadora. En la Figura 8A, la caída de la humedad durante el experimento sugiere que la bandeja de agua de la incubadora está vacía. A medida que la evaporación se acelera en el pozo, las lecturas de concentración de O2 para el pozo aumentarán más y eventualmente se "mantendrán estables" a la concentración de O2 atmosférico (~ 200 μM) (Figura 8A).
En segundo lugar, confirme que el "sándwich" del sistema OCR esté ensamblado correctamente. Los puntos de contacto metálicos en la parte inferior del dispositivo y la parte superior de la tapa de detección deben estar limpios, sin residuos que impidan el contacto completo. El dispositivo y la tapa de detección deben colocarse completamente al ras y alineados uniformemente en la placa de 96 pocillos sin ninguna inclinación. El cable USB que conecta el dispositivo al hub no debe estar en tensión, lo que puede resultar en un par del "sándwich" y una restricción del movimiento adecuado del dispositivo.
En tercer lugar, asegúrese de que el dispositivo y los sensores de la tapa de detección estén calibrados. En la Figura 2B se detalla cómo comprobar rápidamente el correcto funcionamiento del sensor al comienzo de cada experimento. En cuarto lugar, asegúrese de que un pozo en particular no muestre un OCR atípico antes de la manipulación experimental. Después de asegurarse de que los sensores funcionen, determinar los valores de OCR de referencia para todos los pocillos con celdas puede ayudar a determinar si ciertos pocillos contienen celdas enfermas. La Figura 8B muestra varios pozos que se someten a una evaluación de OCR de referencia, en la que el pozo de color azul muestra claramente una OCR más baja (y, por lo tanto, una alta concentración deO2 ). Este pozo es un caso atípico y debe excluirse de la manipulación experimental.
Quinto, minimice las manipulaciones ambientales durante las lecturas activas de OCR. El gradiente deO2 es muy sensible a los cambios de temperatura, humedad, niveles deCO2 de la incubadora y presión atmosférica. La apertura de la puerta de la incubadora afecta significativamente a estos factores, causando interrupciones temporales en las lecturas de OCR hasta que el gradiente deO2 de la columna de medios vuelve al equilibrio (Figura 8C). Los parámetros que afectan al OCR se pueden monitorear en la interfaz en línea del sistema en la pestaña "Entorno" (Figura 8A).
En sexto lugar, determine el volumen de medios óptimo para el experimento. Si bien un volumen insuficiente del medio puede crear artefactos debido a la evaporación excesiva (consulte la primera medida de solución de problemas anterior) o al agotamiento prematuro de los nutrientes en el medio, el volumen excesivo del medio limita la disponibilidad de O2 para la monocapa del RPE, lo que desencadena la hipoxia9. La Figura 7 es una captura de pantalla de la calculadora en línea disponible para determinar el efecto del volumen del medio en la concentración deO2 en la monocapa RPE. El OCR máximo posible para un volumen de medios determinado se muestra en la Figura 9A. Si la tasa de OCR para un experimento dado utilizando un volumen dado se aproxima a la tasa mostrada en la Figura 9A, entonces la concentración de O2 en la monocapa RPE se acerca a la anoxia (0%) y se necesita un volumen de medio más bajo. En general, los experimentos que involucran procesos mitocondrialmente intensivos en el cultivo de EPR deben tener volúmenes de medios no mayores de 75 μL por 96 pocillos.
Séptimo, realizar una normalización adecuada para aislar los efectos de una intervención experimental en el OCR. Dado que los diferentes pozos pueden tener un OCR de referencia diferente, es fundamental obtener lecturas de OCR de referencia para cada pocillo antes de una intervención experimental. Reste el OCR de referencia del OCR después de la intervención experimental para obtener el "OCR Delta", que demuestra el efecto de la intervención experimental en el OCR. El método para obtener el "OCR Delta" se muestra en la Figura 3 y la Figura 9B. Si uno está interesado en los efectos de una intervención experimental sobre la capacidad de otra intervención experimental para inducir OCR, se necesita un paso de normalización adicional, el "OCR Delta-Delta". Este ejemplo se ilustra en la Figura 9B, donde la capacidad del palmitato (una intervención experimental) para inducir un aumento del OCR (mediante la inducción de la β-oxidación) depende del tipo de medio para el cultivo del EPR (una segunda intervención experimental).
Por último, minimice el riesgo de contaminación. El sistema monitorea el OCR mediante la introducción de un sensor de oxígeno en el medio por encima de las células. Esto aumenta el riesgo de infección. Las caídas inesperadas en el OCR durante el experimento o un OCR inesperadamente bajo al comienzo del experimento podrían ser signos de una infección. Las placas deben ser monitoreadas activamente para detectar infecciones bajo un microscopio de cultivo celular. La contaminación cruzada entre placas de 96 pocillos podría ocurrir si se reutiliza una tapa de detección. Para minimizar dicha contaminación cruzada, se debe sumergir toda la tapa en etanol al 70% durante 20 minutos para la descontaminación después de realizar un experimento, antes de volver a utilizar la tapa de detección en un nuevo experimento (ver sección 1.2.15 del protocolo).
En conclusión, se presenta un protocolo para la monitorización a largo plazo en tiempo real del metabolismo mitocondrial en cultivos de EPR de alta fidelidad mediante la evaluación del OCR utilizando un sistema novedoso llamado Resipher. Se puede utilizar para numerosas aplicaciones en cultivos de EPR altamente polarizados y diferenciados, en particular, sondeando las propiedades metabólicas fisiológicas del EPR aislado, así como el metabolismo alterado del EPR en modelos in vitro de enfermedad de la retina, incluidos AMD y PVR.

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa de células epiteliales funcionalmente postmitóticas altamente polarizadas que forman una barrera entre los fotorreceptores sensibles a la luz en la retina y su circulación sanguínea, un lecho capilar denominado coriocapilar. Al igual que el papel de las neuronas de soporte de la glía, el EPR lleva a cabo innumerables funciones para apoyar a los fotorreceptores, incluida la fagocitosis de los segmentos externos de los fotorreceptores, el transporte de nutrientes y el apoyo metabólico de los fotorreceptores, y la secreción de factores de crecimiento esenciales, todos críticos para mantener la función visual.
La degeneración del EPR subyace a varios trastornos degenerativos comunes de la visión. En la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), una de las causas más comunes de pérdida de visión incurable en el mundo, el EPR muere y, por lo tanto, los fotorreceptores suprayacentes sufren una degeneración secundaria. En la vitreorretinopatía proliferativa (PVR), el EPR, en cambio, sale de su estado postmitótico normalmente inactivo, proliferando y desdiferenciándose en un estado mesenquimal (la llamada transición epitelial a mesenquimal [EMT]) con alteraciones en su metabolismo. La desdiferenciación del EPR provoca una pérdida del apoyo del EPR a los fotorreceptores, al tiempo que desencadena un estado más fibrótico. Esto da lugar tanto a la degeneración de los fotorreceptores como a la cicatrización inducida por el EPR, que desencadenan la pérdida de la visión 1,2.
Una parte importante del apoyo del EPR a los fotorreceptores es metabólica, y la desregulación metabólica es un factor crítico en numerosas enfermedades de la retina, incluidas la DMAE y la RVP. El EPR sirve como barrera reguladora entre los fotorreceptores y su fuente de oxígeno y nutrientes, la coriocapilar. Por lo tanto, lo que el EPR elige metabolizar frente a lo que el EPR elige pasar de la coriocapilar a los fotorreceptores gobierna en gran medida el metabolismo y la supervivencia de los fotorreceptores. Numerosos estudios han demostrado que el EPR depende en gran medida del metabolismo mitocondrial para su salud normal, y que los fotorreceptores dependen en gran medida de la glucólisis3. Esto ha introducido el concepto de estados metabólicos complementarios y entrelazados entre los fotorreceptores y el EPR. Específicamente, el EPR reduce su metabolismo de los sustratos metabólicos fotorreceptores preferidos y, en su lugar, utiliza los subproductos del metabolismo de los fotorreceptores combinados con los metabolitos que los fotorreceptores no consumen. En enfermedades como la RVP y la DMAE, la evidencia sugiere fuertemente que el EPR se vuelve más glucolítico y menos dependiente del metabolismo mitocondrial; este cambio hacia la glucólisis RPE puede privar a los fotorreceptores de los metabolitos que necesitan, desencadenando la degeneración 4,5,6. Dado lo interdependientes que son el metabolismo del EPR y los fotorreceptores y el grado de alteración del metabolismo que subyace a la enfermedad de la retina, existe un gran interés en modelar y manipular el metabolismo del EPR con fines terapéuticos.
Si bien el estudio del metabolismo mitocondrial del EPR in vivo es ideal, muchos aspectos del metabolismo mitocondrial del EPR solo se pueden investigar prácticamente en un sistema de cultivo in vitro. En las últimas décadas se han realizado avances significativos hacia los cultivos de EPR de alta fidelidad, hasta el punto de que los cultivos de EPR más cuidadosamente preparados se utilizan ahora para la terapia de reemplazo celular en ensayos clínicos en humanos7. Para mantener estos cultivos de alta fidelidad, el EPR debe cultivarse en sustratos particulares en medios particulares durante meses antes de la experimentación. Con estas condiciones, los cultivos de EPR se diferencian y polarizan al máximo, aproximándose al EPR in vivo. Desafortunadamente, actualmente no hay ningún equipo disponible que pueda medir el metabolismo mitocondrial específicamente a partir del RPE in vivo. Si bien la monitorización del oxígeno de la red capilar de la retina se ha logrado in vivo utilizando oximetría de resonancia paramagnética electrónica (EPR)8, esto no es posible para el análisis de RPE. Las diferencias entre el metabolismo del EPR in vivo e in vitro no están bien descritas, pero se ha demostrado que los cultivos de EPR tienen una alta actividad mitocondrial, similar al EPR in vivo 3,9, lo que sugiere que se puede obtener información significativa sobre el metabolismo mitocondrial del EPR utilizando cultivos de EPR de alta fidelidad.
Dado que todo metabolismo mitocondrial conduce al consumo de oxígeno, la medición de las tasas de consumo de oxígeno (OCR) del EPR es un indicador fiel del metabolismo mitocondrial. La medición del OCR en cultivos de EPR ha sido difícil, ya que las condiciones que promueven la máxima polarización y diferenciación del EPR a menudo impiden mediciones precisas de OCR a largo plazo con las técnicas disponibles actualmente, como el analizador de caballitos de mar. En este documento de métodos, se presenta un dispositivo novedoso, denominado Resipher (en lo sucesivo denominado "el sistema"), que permite la medición continua de OCR durante semanas en RPE cultivado en condiciones que promueven al máximo la polarización y la diferenciación. La facilidad con la que este sistema puede medir el OCR en condiciones de cultivo de RPE que promueven al máximo la diferenciación y polarización del RPE es única entre los dispositivos de medición de OCR existentes.
Este documento proporciona consejos y trucos para usar el sistema con cultivos RPE, seguido de una demostración de dos aplicaciones particulares. En primer lugar, la EMT RPE, que imita la PVR, se desencadena por la exposición al factor de crecimiento transformante beta (TGFβ)1,10,11,12. El sistema se utiliza para monitorizar cómo evoluciona el metabolismo del RPE durante el proceso de EMT. En segundo lugar, se explora el papel de la hipoxia en el metabolismo del EPR utilizando este sistema. La hipoxia es un contribuyente importante a la patogénesis de la DMAE, ya que la coriocapilar se adelgaza con la edad13,14. La combinación de este sistema con cámaras de hipoxia permite modelar el metabolismo mitocondrial alterado del EPR con la sutil hipoxia que acompaña al envejecimiento. Por último, se presenta una calculadora en línea que utiliza datos de Resipher para permitir determinar si los cultivos de EPR se encuentran en condiciones hipóxicas, normóxicas o hiperóxicas. Esta información es fundamental para sacar conclusiones sobre el metabolismo del EPR a partir de estudios de cultivo in vitro de EPR.

<table><tbody><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>#25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-triyodo-L-tironina sal sódica</td><td>Sigma</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>32 canales Tapa Resipher</td><td>Lucid Scientific</td><td>NS32-101A para Falcon</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A de streptomyces sp.</td><td>Sigma</td><td>A8674-25MG</td><td>Inhibidor del Complejo III de la cadena de transporte de electrones</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>Sigma</td><td>SML1760-5MG</td><td>Agente de desacoplamiento para aumentar la respiración mitocondrial</td></tr><tr><td>DMSO, grado de cultivo celular</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D4540-100ML</td><td>Vehículo para la reconstitución de fármacos mitocondriales</td></tr><tr><td>Sustratos de recubrimiento de matriz extracelular: Synthemax II-SC</td><td>Corning</td><td>#3535</td><td>Matriz extracelular para hfRPE</td></tr><tr><td>Sustratos de recubrimiento de matriz extracelular: Vitronectina</td><td>Gibco</td><td>A14700</td><td>Matriz extracelular para iPSC-RPE</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920-10MG</td><td>Agente de desacoplamiento para aumentar la respiración mitocondrial</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (Bio-Techne S11550H)</td><td>Bio-Techne</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona-Ciclodextrina</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de hipoxia</td><td>Embrient Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>N1 Suplemento de medios</td><td>Sigma</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>Solución de aminoácidos no esenciales</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>sensor de O2</td><td>Tecnología Sensit o Detectores forenses</td><td>P100 o FD-90A-O2</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TGF humano recombinante y beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>100-35B</td><td>Factor de crecimiento transformante beta-2 para inducir la transición epitelio-mesenquimal</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma</td><td>R8875-1G</td><td>Inhibidor del complejo I de la cadena de transporte de electrones</td></tr><tr><td>Placa compatible</td> con el sistema <td>Corning</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; MEM (Modificación Alfa de los Medios de Eagle)</td><td>Corning</td><td>15-012-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorización a largo plazo de las tasas de consumo de oxígeno en cultivos epiteliales de pigmento retiniano altamente diferenciados y polarizados

Long-term Monitoring of Oxygen Consumption Rates in Highly Differentiated and Polarized Retinal Pigment Epithelial Cultures

El metabolismo mitocondrial es fundamental para el funcionamiento normal del epitelio pigmentario de la retina (EPR), una monocapa de células de la retina importante para la supervivencia de los fotorreceptores. La disfunción mitocondrial del EPR es una característica distintiva de la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la principal causa de ceguera irreversible en el mundo desarrollado, y de la vitreorretinopatía proliferativa (RVP), una complicación cegadora de los desprendimientos de retina. Las condiciones degenerativas del EPR han sido bien modeladas por sistemas de cultivo de EPR que están altamente diferenciados y polarizados para imitar el EPR in vivo . Sin embargo, el monitoreo de las tasas de consumo de oxígeno (OCR), un indicador de la función mitocondrial, ha sido difícil en dichos sistemas de cultivo porque las condiciones que promueven la polarización y diferenciación ideal del RPE no permiten mediciones fáciles de OCR. 
Aquí, presentamos un sistema novedoso, Resipher, para monitorear OCR durante semanas a la vez en cultivos de EPR bien diferenciados mientras se mantiene el EPR en sustratos de crecimiento óptimos y medios de cultivo fisiológicos en una incubadora de cultivo celular estándar. Este sistema calcula el OCR midiendo el gradiente de concentración de oxígeno presente en los medios por encima de las células. Discutimos las ventajas de este sistema sobre otros métodos para detectar OCR y cómo configurar el sistema para medir OCR en cultivos de RPE. Cubrimos consejos y trucos clave para usar el sistema, precaución sobre la interpretación de los datos y pautas para solucionar problemas de resultados inesperados. 
También proporcionamos una calculadora en línea para extrapolar el nivel de hipoxia, normoxia o hiperoxia que experimentan los cultivos de RPE en función del gradiente de oxígeno en los medios por encima de las células detectadas por el sistema. Finalmente, revisamos dos aplicaciones del sistema, midiendo el estado metabólico de las células EPR en un modelo de PVR y entendiendo cómo el EPR se adapta metabólicamente a la hipoxia. Anticipamos que el uso de este sistema en cultivos de EPR altamente polarizados y diferenciados mejorará nuestra comprensión del metabolismo mitocondrial del EPR, tanto en estados fisiológicos como de enfermedad.

Presentamos un novedoso dispositivo para medir las tasas de consumo de oxígeno (OCR) en cultivos epiteliales de pigmento de retina (EPR). El dispositivo puede medir el OCR durante semanas seguidas en RPE cultivado en placas de cultivo celular estándar con medios estándar mientras las placas están en una incubadora de cultivo celular estándar.

Monitorización a largo plazo de las tasas de consumo de oxígeno en cultivos epiteliales de pigmento retiniano altamente diferenciados y polarizados

Mitochondrial metabolism is critical for the normal function of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells in the retina important for ...

long-term-monitoring-oxygen-consumption-rates-highly-differentiated

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo, que fue reportado originalmente por Fernandez-Godino et al. en 20161,describe un método para aislar eficientemente y cultivo de células RPE del ratón, que forman una monocapa RPE funcional y polarizada dentro de una semana en las placas Transwell. El procedimiento dura aproximadamente 3 horas.

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Este protocolo describe un método detallado para la preparación y tinción de inmunofluorescencia de ratones montados planos de retina y análisis. El uso de la angiografía con fondo de ojo de fluoresceína (FFA) para crías de ratones y el procesamiento de imágenes también se describen en detalle.

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Este protocolo describe un modelo de acumulación de lipofuscina en cultivos epiteliales pigmentarios (EPR) humanos altamente diferenciados y polarizados y un ensayo de fagocitosis de segmento externo (SG) mejorado para detectar la capacidad total de consumo/degradación de SG del EPR. Estos métodos superan las limitaciones de los modelos anteriores de lipofuscina y los ensayos clásicos de fagocitosis del segmento externo de persecución de pulsos.

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El análisis en tiempo real del tejido vivo proporciona importantes datos funcionales y mecanicistas. Este documento describe los protocolos y las variables críticas para garantizar la generación precisa y reproducible de datos mediante un sistema de fluídica multicanal novedoso y sin bomba que mantiene y evalúa una amplia gama de modelos de tejidos y células.

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Chirp es una técnica novedosa y rápida a los sitios de unión del Mapa del Genoma de los ARNs no codificantes de largo (lncRNAs). El método tiene la ventaja de la especificidad de los oligonucleótidos antisentido baldosas para permitir la enumeración de los sitios genómicos lncRNA enlazados.

Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

El perfil de madre humanas pluripotentes inducidas (iPS), el epitelio pigmentario de la retina (RPE) derivadas de células (iPS) (iPS-RPE) inducido por el hombre-madre pluripotentes, y RPE fetal microRNA (miRNA), fueron comparados.

Perfiles de expresión de microARN de las células iPS humanas, de la retina del epitelio pigmentario Derivado de Ips y Fetal epitelio pigmentario de la retina

Las células epiteliales del pigmento retiniano podrían servir como una terapia de reemplazo celular para la forma avanzada de la degeneración macular seca relacionada con la edad. Este protocolo describe la generación de un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica y el transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivados de células madre embrionarias humanas en este modelo de la enfermedad.

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El epitelio retiniano del pigmento (RPE) es un epitelio de múltiples funciones del ojo. Aquí presentamos un protocolo para establecer cultivos celulares primarios derivados del RPE murino.

Cultivos celulares primarios de células del epitelio pigmentario de la retina del ratón

Aprende a medir tasas de consumo de oxígeno en cultivos de epitelio pigmentario retiniano altamente diferenciados usando el dispositivo Resipher. Este método permite monitoreo prolongado bajo condiciones óptimas de cultivo celular.

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Monitorización a largo plazo de las tasas de consumo de oxígeno en cultivos epiteliales de pigmento retiniano altamente diferenciados y polarizados

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