Name: Caracterización de plaquetas procoagulantes mediante la medición de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas de plaquetas humanas purificadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Aprende a caracterizar plaquetas procoagulantes mediante citometría de flujo para evaluar la exposición de fosfatidilserina y la liberación de microvesículas en sangre humana. Este protocolo permite cuantificar la activación plaquetaria con precisión.

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<meta charset="utf8"></head><body>Análisis de la fosfatidilserina plaquetaria y la liberación de microvesículas

<table><tbody><tr><td>(CD42b, GPIX) APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>B13980</td><td></td></tr><tr><td>ACD-A tubos de extracción de sangre</td><td>BD Vacutainer</td><td>366645</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-V FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>560931</td><td></td></tr><tr><td>Apirasa Grado VII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6410</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9576</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, 0.25M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidratado</td><td>Merck</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno&nbsp;</td><td>Stago</td><td>86924</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Ionóforo&nbsp;</td><td>Calbiochem/VWR</td><td>100105</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Merck</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.06498</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sodio</td><td>Merck</td><td>6329</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>Thrombin&nbsp;</td><td>Hyphen Biomed</td><td>EZ 006 A</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisódico dihidratado&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Na3C6H5O7*2H2</td></tr><tr><td>O&alpha; Integración IIb (CD41, GPIIb) PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>6607115</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización de plaquetas procoagulantes mediante la medición de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas de plaquetas humanas purificadas

Procoagulant Platelet Characterization by Measuring Phosphatidylserine Exposure and Microvesicle Release from Human Purified Platelets

La cuantificación de plaquetas y microvesículas procoagulantes se logra mediante la tinción con anexina-V, con al menos 50.000 eventos registrados por muestra. Como se indicó en el paso 2.2, las mediciones de plaquetas de referencia se tomaron de muestras incubadas con tampón de reacción, como se muestra en la Figura 1A. El tamaño de las plaquetas se midió utilizando el valor de la mediana de dispersión directa (FSC). Si bien el FSC está influenciado por varios factores, sigue siendo un indicador común para la estimación del tamaño de las células, incluido el de las plaquetas. Se utilizaron gráficos de densidad de área (Figura 1A) para identificar y controlar las plaquetas en reposo y las microvesículas liberadas.
En el caso de las plaquetas no activadas, menos del 2,9% presentó fosfatidilserina (PS) según lo determinado por la tinción con anexina V. Tras la activación de las plaquetas lavadas con colágeno solo o junto con trombina o ionóforo de calcio, se observó un aumento en la exposición a PS. El colágeno por sí solo provocó un aumento del 26,7% en las plaquetas PS positivas. La trombina tuvo efectos mínimos sobre la exposición a PS (9,1%), pero cuando se asoció con el colágeno, aumentó el porcentaje de plaquetas expuestas a PS al 36,2%. Como referencia, el tratamiento con ionóforo de 2 μM dio como resultado que el 49,6% de las plaquetas se convirtieran en procoagulantes.
La Figura 1 ilustra que la proporción basal de microvesículas de plaquetas lavadas en un individuo sano fue mínima (0,3%). Si bien la trombina y el colágeno aumentaron mínimamente la formación de microvesículas, solo con la combinación de colágeno y trombina la formación de microvesículas aumentó significativamente (Figura 1D; 11,4%). La adición de 2 μM de ionóforo dio como resultado que el 44,0% de las microvesículas formadas por las plaquetas de control estuvieran expuestas a PS.
La Figura 2 proporciona información sobre la variación, repetibilidad y reproducibilidad que se espera de este proceso.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig01.jpg"> 
Figura 1: Exposición a PS y formación de microvesículas en plaquetas de control en reposo y activadas. Las plaquetas fueron activadas o inactivadas (en reposo) (A), con 30 μg/mL de colágeno (B), con 0,5 U/mL de trombina (C), con combinaciones de colágeno y trombina (D) con ionóforo de 2 μM. Los diagramas de puntos representativos muestran el tamaño de las plaquetas (dispersión directa (registro FSC)) frente a la unión de la anexina-V. Las líneas horizontales y verticales (E) delinean la población de plaquetas negativas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67042/67042fig02.jpg"> 
Figura 2: Repetibilidad y reproducibilidad de la exposición a PS y la formación de microvesículas después de la incubación con ionóforo. Análisis de la exposición a PS y la formación de microvesículas después de la incubación con ionóforo de 2 μM o 5 μM en plaquetas lavadas, tratadas o no con citrato (un quelante de calcio): (A) de 4 controles sanos diferentes; (B) de un control sano repetido 5 veces; y (C) de dos controles sanos preparados por dos técnicos diferentes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67042/67042fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Recuento de plaquetas en sangre total (10:9 por ml)</td>
			<td>Fuerzas centrífugas relativas (g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&lt;30</td>
			<td>70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-50</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>51-100</td>
			<td>130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-150</td>
			<td>200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>151-300</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>301-600</td>
			<td>290</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&gt;600</td>
			<td>340</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Fuerzas centrífugas relativas para la preparación de plasma rico en plaquetas en relación con el recuento de plaquetas en sangre total.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reactivo</td>
			<td>Importe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido cítrico monohidratado (C6H8O7. H2O, 38 mM)</td>
			<td>8 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrato trisódico dihidratado (Na, 3, C,6, H5O,7,2 H, 2O, 61 mM)</td>
			<td>180 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucosa (C6h12o6, 136 mM)</td>
			<td>24,6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">El pH de la solución no debe ajustarse. Mantenga la solución a 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: Preparación de una solución acuosa de 1 L de ácido-citrato-dextrosa (ACD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reactivo</td>
			<td>Importe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido cítrico monohidratado (C6, H,8, O, 7. H2O, 36 mM)</td>
			<td>7,56 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (103 mM)</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>4 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H 2O (1 mM)</td>
			<td>0,203 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ajusta el pH a 6,5. Mantenga la solución a 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 3: Preparación de la solución madre del tampón de lavado.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reactivo</td>
			<td>Importe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% albúmina sérica bovina (BSA)</td>
			<td>583 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, 0,25 m</td>
			<td>400 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucosa</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apirasa</td>
			<td>31,5 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 4: Preparación de una solución extemporánea de 50 mL de tampón de lavado a partir de la solución madre.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reactivo</td>
			<td>Importe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (137 mM)</td>
			<td>8 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl (2.7 mM)</td>
			<td>0,2 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H 2O (1 mM)</td>
			<td>0,203 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (5 mM)</td>
			<td>1,19 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3 (12 mM)</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H 2O; 0,3 mM</td>
			<td>0,05 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ajusta el pH a 7,4. Mantenga la solución a 4 °C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 5: Preparación de una solución madre de tampón de reacción.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reactivo</td>
			<td>Importe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% albúmina sérica bovina (BSA)</td>
			<td>167 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2, 0,25 m</td>
			<td>400 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucosa</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 6: Preparación de una solución extemporánea de 50 mL de tampón de reacción a partir de la solución madre.

Caracterización de plaquetas procoagulantes mediante la medición de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas de plaquetas humanas purificadas

Activated platelets promote coagulation primarily by exposing the procoagulant phospholipid phosphatidylserine (PS) on their outer membrane surfaces and ...

procoagulant-platelet-characterization-measuring-phosphatidylserine

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Aprende a caracterizar plaquetas procoagulantes mediante citometría de flujo para evaluar la exposición de fosfatidilserina y la liberación de microvesículas en sangre humana. Este protocolo permite cuantificar la activación plaquetaria con precisión.

Caracterización de plaquetas procoagulantes mediante la medición de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas de plaquetas humanas purificadas (Video) | JoVE Journal

Caracterización de plaquetas procoagulantes mediante la medición de la exposición a fosfatidilserina y la liberación de microvesículas de plaquetas humanas purificadas

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