Name: Síntesis de nanopartículas lipídicas por flujo turbulento en mezcladores de chorro de impacto confinados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprende a sintetizar nanopartículas lipídicas mediante mezcladores de chorro de impacto confinados con flujo turbulento. Este método escalable produce partículas monodispersas reproducibles para aplicaciones de liberación de fármacos.

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Síntesis de nanopartículas lipídicas mediante tecnologías de mezcladores CIJ y μMIVM

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Se ha presentado la síntesis de LNPs que contienen polímeros de ácidos nucleicos utilizando dos mezcladores turbulentos de chorro de impacto confinado. Cuando se llevan a cabo a velocidades adecuadas, los mezcladores turbulentos CIJ garantizan que la escala de tiempo de mezcla sea más corta que el tiempo de ensamblaje del LNP, lo que produce condiciones de supersaturación homogéneas para formar LNP pequeños con distribuciones de tamaño estrechas21. En consecuencia, los LNP fabricados con la misma química utilizando diferentes geometrías de mezclador turbulento (el CIJ de 2 chorros y el mezclador MIVM de 4 chorros) exhiben propiedades fisicoquímicas similares y muestran buenas eficiencias de transfección (Figura 5 y Figura 6). Por el contrario, los LNP elaborados mediante pipeteo que produce una mezcla más pobre dan como resultado LNP más grandes y polidispersos (Figura 5A) con menores eficiencias de transfección. Desde hace mucho tiempo se sabe que la cinética de mezcla y ensamblaje juega un papel importante en el procesamiento de LNP; Cullis et al. observaron que la mezcla convectiva-difusiva rápida de etanol y tampón conduce a la formación de partículas pequeñas con una distribución de tamaño estrecha, mientras que la mezcla difusiva lenta conduce a partículas más grandes con distribuciones de tamaño amplias9. La escala de tiempo de mezcla en los mezcladores turbulentos CIJ disminuye proporcionalmente a los caudales de entrada de las corrientes al mezclador27. Esto se cuantifica mediante el número adimensional de Reynolds (Re), que mide la relación entre las fuerzas inercial y viscosa. La turbulencia dentro de las cámaras de mezcla de la CIJ y la MIVM se produce a un Re suficientemente alto, de modo que el estiramiento del vórtice turbulento da lugar a pequeñas escalas de longitud que producen una rápida mezcla de disolvente/antidisolvente por difusión. La escala de longitud turbulenta depende del Re y no de la geometría específica del dispositivo de mezcla. Esa es la razón por la que el CIJ o el MIVM producen las mismas partículas de LNP, y por qué varios tamaños de mezcladores MIVM producen los mismos tamaños de NP27. A alta Re, correspondiente a altas velocidades de entrada, los LNP se pueden producir de manera reproducible sin variaciones de lote a lote (Figura 3B).
Este protocolo permite la formulación de una variedad de LNPs de ARNm, ADN o ARNip con diferentes propiedades fisicoquímicas utilizando mezcladores CIJ turbulentos. Además de permitir versatilidad en la composición y las concentraciones, esta técnica proporciona un camino claro para seleccionar rápidamente las formulaciones en el banco (unos pocos miligramos) y escalar las formulaciones principales a tamaños de lote industrial más grandes a tasas de producción de 5 L/min36. Esto ha sido un obstáculo importante para varias otras técnicas, como la mezcla a granel y la microfluídica. Por ejemplo, las técnicas de procesamiento a granel no logran fabricar LNP de manera consistente y reproducible, incluso en escalas de unos pocos mililitros. Las técnicas microfluídicas proporcionan una mejora significativa con respecto a las técnicas de mezcla a granel para permitir la producción de LNP uniformes y reproducibles; sin embargo, solo están en el rango de miligramos29. Como se detalla en la introducción, la paralelización de dispositivos microfluídicos proporciona un intento de escalar a escalas de producción, pero no elimina el problema del ensuciamiento, y no se puede escalar con tanto éxito como los mezcladores basados en la tecnología de chorro de impacto confinado.
Aparte de estas ventajas, los mezcladores CIJ serán fundamentales en la fabricación de LNP de próxima generación que exhiban capacidades de orientación o realicen edición de genes. Las formulaciones actuales de LNP tienen lípidos y ácidos nucleicos que tienen difusividades similares y, por lo tanto, se pueden hacer incluso con una mezcla ligeramente pobre a escala de laboratorio. Sin embargo, los enfoques de edición genética pueden requerir la encapsulación de especies de ácidos nucleicos con pesos moleculares muy diferentes, como pequeñas moléculas de ARN guía y grandes transcripciones de ARNm, para codificar una proteína CAS937. Las muy diferentes escalas de tiempo de difusión de estas diferentes especies hacen que la encapsulación uniforme en proporciones estequiométricas sea un desafío. Este problema de encapsulación uniforme se vuelve más pronunciado a medida que la eficiencia de la mezcla se vuelve más pobre. Del mismo modo, las células no hepáticas dirigidas podrían necesitar la incorporación de estabilizadores de difusión lenta fuertemente unidos (como los copolímeros de bloque de gran peso molecular con ligandos dirigidos). Los ligandos dirigidos de hasta 14 kDa se pueden conjugar para bloquear copolímeros antes del ensamblaje de nanopartículas, lo que permite su incorporación uniforme en NP mediante la mezcla CIJ38. Los mezcladores turbulentos CIJ son herramientas útiles para la fabricación de LNP fabricados con componentes que tienen diferentes difusividades.
Si bien los mezcladores turbulentos CIJ demuestran varias ventajas sobre otros mezcladores para formular LNP, es importante tener en cuenta las limitaciones asociadas con cada geometría. El mezclador CIJ de 2 chorros requiere que ambas corrientes de entrada (etanol y agua) tengan momentos iguales (dentro del 10%-30%) para lograr una micromezcla turbulenta uniforme en la cámara. El hecho de que la corriente de salida comprenda 50:50 solvente/antisolvente limita el nivel de sobresaturación en la cavidad de mezcla donde se produce la precipitación29. Este inconveniente se soluciona con el mezclador MIVM de 4 chorros, ya que puede utilizar cuatro chorros con momentos desiguales para lograr condiciones de alta supersaturación en la cámara de mezcla. Además, ambos mezcladores deben estar en el orden de miligramos de masa total, lo que los convierte en una opción no ideal para el cribado de alto rendimiento de muchas formulaciones diferentes de LNP. En el caso de formulaciones simples de LNP, el cribado puede realizarse mejor con microfluídica o estrategias de pipeteo a escalas de microgramos y luego transferirse a la tecnología de chorro de impacto confinado cuando se hayan identificado algunas formulaciones de plomo. También es crucial tener en cuenta los volúmenes muertos en los mezcladores. En el CIJ, dos mezcladores de chorro, los volúmenes de retención son de 50 a 100 microlitros. Esta cantidad de material debe restarse de la cantidad capturada en el baño de enfriamiento al calcular la recuperación del proceso. Estas pérdidas son insignificantes cuando se opera a gran escala, pero representarían pérdidas del 10% cuando se producen volúmenes totales de 5 mL, como se muestra aquí. Los mezcladores turbulentos de chorro que inciden son una herramienta valiosa para producir LNP a escala GMP, como lo demuestran las dos vacunas COVID-19 aprobadas por la FDA.

Las terapias basadas en ARNm tienen un gran potencial para el tratamiento y la prevención de una amplia gama de enfermedades, incluidas las enfermedadesinfecciosas, los trastornos genéticos y los cánceres. A diferencia de las terapias de moléculas pequeñas, que pueden difundirse pasivamente a través de la membrana celular, los ácidos nucleicos deben encapsularse para su administración intracelular2. La encapsulación proporciona estructura y estabilidad al ARNm, facilitando su entrega intracelular a través de vías endocíticas, así como evitando la degradación de componentes intra y extracelulares como las nucleasas3. Se han desarrollado una gran cantidad de materiales y nanoportadores para la encapsulación y administración de ARNm, incluidas nanopartículas inorgánicas, polímeros, lípidos y materiales similares a los lípidos1. Entre ellas, las LNP se han convertido en la plataforma de administración más destacada para las terapias basadas enARNm 4.
Las LNP están compuestas por cuatro componentes lipídicos: lípidos ionizables, colesterol, lípidos zwitteriónicos y estabilizador de lípidos PEG5. Los lípidos ionizables adecuados para la administración de ARNm exhiben un cuidadoso equilibrio entre la hidrofobicidad lipídica y la constante de disociación (pKa) de un grupo aminaternario 6. El pKa lipídico ionizable suele tener un pH entre 6,0 y 6,7, como KC-2 (DLin-KC2-DMA), MC-3 (DLin-MC3-DMA) y ALC-03157. Esta restricción de pKa en el lípido ionizable permite tanto la encapsulación de polímeros de ácidos nucleicos como sales lipídicas hidrofóbicas como la administración intracelular a través de un proceso de "escape de endosomas". Las LNP ingresan a una célula diana a través de (varias) vías de endocitosis que implican la acidificación del endosoma desde un pH de 7,4 hasta un pH ~5,8. El pKa lipídico ionizable asegura que las LNP tengan superficies casi neutras en condiciones fisiológicas, pero se conviertan en catiónicas en un endosoma acidificante9. Esta respuesta al pH permite la disrupción selectiva de solo la membrana endosómica, la liberación del polímero de ácido nucleico encapsulado y preserva la viabilidad celular, a diferencia de los lípidos catiónicos permanentes utilizados en sistemas de transfección como Lipofectamine. El colesterol es una molécula hidrofóbica e intersticial en la estructura de LNP que mejora la fluidez de los lípidos. El lípido zwitteriónico desempeña un papel estructural y forma una bicapa en la superficie del LNP. El poli(etilenglicol)-lípido (PEG-lípido) es un estabilizador coloidal que mejora la estabilidad del LNP al impartir un estabilizador estérico polimérico sobre la superficie del LNP, que resiste la agregación de LNP. Esto estabiliza el LNP, particularmente durante los cambios en el pH que regeneran la forma de base libre del lípido ionizable que se comporta como un aceite hidrofóbico. La receta de Onpattro (patisiran) (en adelante, denominada formulación LNP) se utiliza a menudo como punto de partida para la formulación de LNP con lípidos ionizables MC3, colesterol, distearoilfosfatidilcolina (DSPC) y PEG2000-DMG disueltos en etanol mezclados contra una solución acuosa de ARN10.
Se pueden utilizar varias técnicas para fabricar LNPs que encapsulan polímeros de ácidos nucleicos, y la mayoría de ellas se basan en un tema común de mezclar rápidamente una corriente de etanol que contiene lípidos con una corriente acuosa que incorpora el ácido nucleico de interés (siRNA, mRNA o ADN)9,11,12,13,14 . En este sentido, los procesos de mezcla a granel, como la mezcla con pipeta y la mezcla en vórtice, ofrecen una estrategia sencilla para formar LNP que elimina la necesidad de utilizar instrumentos sofisticados12. Sin embargo, la mezcla a granel no proporciona una distribución homogénea de los componentes, lo que conduce a una distribución del tamaño de LNP subóptima junto con una variabilidad significativa de un lote a otro15.
Los laboratorios utilizan rutinariamente técnicas de mezcla microfluídica para obtener LNPs reproducibles al lograr un control más preciso sobre las condiciones de mezcla 12,13,16. Sin embargo, las condiciones de flujo laminar en los dispositivos microfluídicos, que son inherentes debido a las escalas de pequeña longitud y las bajas velocidades en una cámara de microfluídica, dan como resultado una mezcla de solvente/antisolvente comparativamente lenta17. Las pequeñas dimensiones de la cámara limitan severamente el rendimiento y la escalabilidad necesarios para la producción de GLP de LNP, pero los investigadores han paralelizado cámaras microfluídicas para intentar escalar los volúmenes de producción. Una geometría de microfluídica paralelizada no elimina el problema de la adsorción de lípidos a las superficies durante el procesamiento de grandes volúmenes, un problema comúnmente conocido como "ensuciamiento" del dispositivo de mezcla, y existen problemas con la uniformidad y estabilidad de los flujos que hacen que el escalado de la microfluídica sea un desafío para la producción a escala industrial18,19. No es de extrañar que las empresas farmacéuticas utilizaran mezcladores de chorro de impacto turbulento para fabricar ARNm-LNP de la vacunación contra la COVID-1920.
El proceso de producción de LNP cargadas de ARN implica la mezcla de un flujo tampón acuoso que contiene la carga útil de ARN con un flujo de etanol que contiene los cuatro componentes lipídicos distintos. Estas formulaciones utilizan un tampón ácido con un pH de 4.0 o menos, que carga el lípido ionizable a medida que se mezclan las corrientes acuosa y etanólica. Los lípidos ionizables cargados positivamente interactúan electrostáticamente con los ARN cargados negativamente, formando una sal hidrofóbica ARN-lipídica. Las especies lipídicas hidrofóbicas, incluida la sal lipídica de ARN, precipitan en los disolventes mezclados y forman núcleos hidrofóbicos. Estos núcleos crecen a través de la precipitación de lípidos zwitteriónicos y colesterol hasta alcanzar un punto crítico en el que se adsorbe suficiente lípido pegilado en la superficie de las LNPs, deteniendo el crecimiento posterior del mecanismo de nucleación y crecimiento 21,22,23. La adición de tampón acuoso a la solución lipídica, en la medida en que los lípidos precipitan y se forman LNP, depende de dos escalas de tiempo distintas: el período de mezcla solvente-antisolvente, τmezcla, y el período de crecimiento de los núcleos, τagg. El número adimensional de Damköhler, definido como Da = τmix/τagg, capta la interacción entre estas escalas de tiempo24. En los casos de mezcla lenta (Da > 1), el tamaño final de los LNP está controlado por el transporte y varía con el tiempo de mezcla. Por el contrario, durante la mezcla rápida (Da < 1), el fluido se fragmenta en estrías o capas de longitud de Kolmogrov, por lo que la formación de LNP se rige únicamente por la difusión molecular de cada constituyente, lo que da como resultado una cinética homogénea de formación de LNP. Lograr este último escenario exige que la concentración de lípidos supere un umbral crítico, estableciendo un estado de sobresaturación propicio para una nucleación homogénea uniforme.
Se estima que τagg oscila entre unas pocas decenas y unos pocos cientos de milisegundos25. En su configuración más básica, las dos corrientes, una que contiene etanol con lípidos y la otra que contiene un tampón acuoso con carga de ARN, se inyectan en una cámara conocida como mezclador de "chorro de impacto confinado" (CIJ). Los vórtices turbulentos producen escalas de longitud de estría de solvente/antisolvente de 1 μm dentro de 1,5 ms cuando se operan a velocidades adecuadas. Las velocidades de la corriente y la geometría de la mezcla determinan la conversión del momento lineal en vórtices turbulentos que mezclan las corrientes. Esto está parametrizado por el número adimensional, el número de Reynolds (Re), que es linealmente proporcional a las velocidades de flujo. Re se calcula a partir de Re = Σ (ViDi/vi), donde Vi es la velocidad del flujo en cada vapor, vi es la viscosidad cinemática de cada corriente y Di es el diámetro de entrada de la corriente en dispositivos CIJ de 2 chorros26 o el diámetro de la cámara en MIVM de 4 chorros27. Nota: Algunas referencias para el CIJ utilizan un solo diámetro de chorro y velocidad para definir Re28. Re está en el rango de 1-100 en un dispositivo de microfluídica, mientras que en los dispositivos CIJ, se puede lograr Re de 125.000. En un mezclador CIJ, las corrientes con el mismo momento chocan, disipando su impulso al impactar como una mezcla turbulenta, lo que conduce a una micromezcla eficiente debido a las pequeñas microescalas de Kolmogorov y al pequeño número de Damköhler. Otro tipo de mezclador es el "mezclador de vórtice de entrada múltiple" (MIVM), donde cuatro corrientes se dirigen a una cámara central. En esta configuración, los flujos continuos hacia la cámara de mezcla confinada garantizan una escala de tiempo de mezcla bien definida. Todos los elementos fluidos pasan a través de la zona de mezcla de alta energía en ambos tipos de mezcladores. Por el contrario, los dispositivos de mezcla simples, como las uniones en T, no contienen una cámara que proporcione una zona de mezcla, lo que resulta en una menor mezcla de las dos corrientes debido a que el momento de la corriente entrante se desvía en gran medida hacia la dirección de salida en lugar de hacia la generación de vórtices turbulentos. Tanto los mezcladores CIJ como los MIVM pueden funcionar en modo por lotes o continuo, lo que ofrece flexibilidad para la producción de LNP a varias escalas.
Este protocolo describe cómo se obtienen las formulaciones óptimas de LNP mediante el empleo de dos tecnologías de chorro de impacto confinado: CIJ de 2 chorros y los mezcladores MIVM de 4 chorros. El funcionamiento de los mezcladores CIJ y MIVM ha sido demostrado previamente para la preparación de NPs con materiales de núcleo hidrófobos29. Ese artículo y video deben ser consultados como un recurso adicional sobre la formación de NPs con estos mezcladores. Esta actualización se centra en la formación de NP a base de lípidos. Se demuestra la capacidad de ajustar el tamaño de los LNP variando las condiciones de micromezcla. Además, se muestra la utilidad de las tecnologías CIJ en la formación de LNPs estables y monodispersas con una mayor eficiencia de transfección in vitro en células HeLa en comparación con las LNP fabricadas con una mezcla deficiente de pipetas. Además, se discuten las ventajas y desventajas de cada geometría de mezcla CIJ, junto con las condiciones apropiadas necesarias para el escalado de estos mezcladores.

<table><tbody><tr><td>18:0 PC (DSPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850365P</td><td>Lípido auxiliar</td></tr><tr><td>21 G x 1-1/2 pulg. Aguja BD PrecisionGlide</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>96 Pozo Pared Negra Placa inferior negra</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-135</td><td></td></tr><tr><td>96 Pocillo Placa inferior blanca/transparente, TC Surface</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>165306</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético, Glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>ALC-0315</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890900</td><td>Lípido ionizable</td></tr><tr><td>Filtro ultracentrífugo Amicon, 100 kDa MWCO, 15 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Filtro ultracentrífugo Amicon, 100 kDa MWCO, 4 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC810096</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de ensayo de luciferasa Bright-Glo Promega</td><td></td><td>E2620</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Millipore Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap FLuc mRNA (5 moU)</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7202</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de chorros de impacto confinados</td><td>Holland Applied Technologies, Helix Biotech, Diamond Tool and Die (DTD)</td><td>N/A</td><td>Póngase en contacto con Holland o DTD para pedidos personalizados y el sistema Helix Biotech es Nova BT. Texto de revisión para la validación del nuevo mezclador</td></tr><tr><td>D-Lin-MC3-DMA </td><td>MedChemExpress</td><td>HY-112251 </td><td>Lípido ionizable</td></tr><tr><td>DMEM, glucosa alta, piruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>DMG-PEG 2000</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>880151P</td><td>Lípidos PEG</td></tr><tr><td>DODMA</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>890899P</td><td>Lípidos ionizables</td></tr><tr><td>Etanol 200 Proof</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Tubos de Centrífuga Cónicos</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Tubos de Centrífuga Cónicos de Alta Claridad</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino, certificado, Estados Unidos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, IBI de ácido libre</td><td> Scientific</td><td>IB01130</td><td></td></tr><tr><td>HSW HENKE-JECT de dos partes de 1 mL Luer</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>HSW HENKE-JECT de dos partes de 5 mL (6 mL) Luer Lock</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4050.X00V0</td><td></td></tr><tr><td>Idex 1648 Tubo de ETFE <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/67047/67047eq02.jpg" style="margin: auto; ">” Diámetro exterior 0.093" ID</td><td>Idex Salud &amp; Ciencia</td><td>1648</td><td></td></tr><tr><td>Idex P-678 y frac14; "-28 a Luer fitting</td><td>Idex Health &amp; Férula Science</td><td>P-678</td><td></td></tr><tr><td>Idex P-940 para tubos de ETFE</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Reactivo de transfección</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>Luer fitting</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>P-604</td><td>Ensamble en la entrada del mezclador CIJ o MIVM con las roscas correspondientes. Las piezas Idex también están disponibles a través de VWR y muchos otros proveedores</td></tr><tr><td>Soporte mezclador</td><td>Holland Applied Technologies</td><td>N/A</td><td>Ver Markwalter &amp;   Prud'homme for design.26 Póngase en contacto con Holland para comprar</td></tr><tr><td>el mezclador de vórtice de entrada múltiple</td><td>Holland Applied Technologies y Diamond Tool and Die (DTD)</td><td>N/A</td><td>Póngase en contacto con Holland o DTD para pedidos personalizados. Revise el texto para la validación del nuevo mezclador</td></tr><tr><td>Junta tórica (MIVM)</td><td>C.E. Conover</td><td>MM1.5 35.50 V75</td><td>Pedido a granel - pieza consumible. Garantice la compatibilidad con el disolvente si utiliza una fuente alternativa.</td></tr><tr><td>Casquillo de salida - CIJ</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>P-200</td><td>Ensamblar con accesorio de salida (extremo grande al ras con tubo)</td></tr><tr><td>Accesorio de salida - CIJ</td><td>Idex Health &amp; Ciencia</td><td>P-205</td><td>Ensamble con férula y tubo en la salida de la cámara CIJ</td></tr><tr><td>Accesorio de salida - MIVM</td><td>Idex Health &amp; Science</td><td>P-942</td><td>Combinación con férula</td></tr><tr><td>Tubo de salida - CIJ</td><td>Idex Health &amp; Ciencia</td><td>1517</td><td>Use un cortador de tubos para los extremos limpios. Asegúrese de que los tubos adicionales no sobresalgan en la cámara de mezcla</td></tr><tr><td>Tubo de salida - MIVM</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Ajuste a la férula ID.</td></tr><tr><td>PBS - Solución salina tamponada con fosfato (10x) pH 7.4, libre de RNasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PHD 2000 Bomba de jeringa programable</td><td>Harvard Apparatus N</td><td>/A Jeringa</td><td></td></tr><tr><td>de plástico de dos piezas 1 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>Conexión de</td> <td>tapónIdex Salud &amp; Science</td><td>P-309</td><td>Ensamble en los lados del mezclador CIJ (sellar el punto de acceso de la perforación)</td></tr><tr><td>Quant-it Kit de ensayo de ARN RiboGreen y reactivo de ARN RiboGreen, RediPlate 96 Kit de cuantificación de ARN RiboGreen</td><td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td><td>R11491</td><td></td></tr><tr><td>Resazurina, sal de sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R12204</td><td></td></tr><tr><td>RNase AWAY Descontaminante de superficies</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de centelleo</td><td>DWK Lifesciences</td><td>74504-20</td><td></td></tr><tr><td>SGE Jeringas herméticas al gas, Luer Lock, 100 mL</td><td>SGE</td><td>100MR-LL-GT</td><td></td></tr><tr><td>SGE Jeringas herméticas al gas, Luer Lock, 50 mL</td><td>SGE</td><td>50MR-LL-GT</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Casetes de diálisis, 20 K MWCO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>66012</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>32319-500G-R</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S320-500</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de jeringa, estériles</td><td>Genesse Scientific</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Agua, libre de endotoxinas</td><td>Calidad Biológico</td><td>118-325-131</td><td>ARNasa y ARN de levadura libre de ADNasa</td></tr><tr><td>(10 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM7118</td><td></td></tr></tbody></table>

síntesis de nanopartículas lipídicas por flujo turbulento en mezcladores de chorro de impacto confinados

Synthesizing Lipid Nanoparticles by Turbulent Flow in Confined Impinging Jet Mixers

Las nanopartículas lipídicas (LNP) han demostrado su enorme potencial como vehículos de administración terapéutica, como lo demuestra la aprobación y el uso mundial de dos vacunas de ARN mensajero (ARNm) contra la COVID-19. A pequeña escala, los LNP a menudo se fabrican utilizando microfluídica; Sin embargo, las limitaciones de estos dispositivos impiden su uso a gran escala. Las vacunas contra la COVID-19 se fabrican en grandes cantidades utilizando mezcladores turbulentos de chorro de impacto confinado (CIJ). La tecnología CIJ permite la producción a escala de laboratorio con la confianza de que se puede escalar a volúmenes de producción. Los conceptos clave en la mezcla CIJ son que la longitud de mezcla y la escala de tiempo están determinadas por la intensidad de la turbulencia en la cavidad de mezcla y que la formación de nanopartículas se produce lejos de las paredes, eliminando el problema de la deposición en las superficies y el ensuciamiento. Este trabajo demuestra el proceso de fabricación de LNPs utilizando la tecnología de mezcladores de chorro de impacto confinado con dos geometrías: el CIJ de dos chorros y el mezclador de vórtice de entrada múltiple (MIVM) de cuatro chorros. Se discuten las ventajas y desventajas de cada geometría de mezcla. En estas geometrías, los LNP se forman por la mezcla rápida de una corriente de disolvente orgánico (generalmente etanol que contiene los lípidos ionizables, co-lípidos y lípidos PEG estabilizadores) con una corriente acuosa de anti-solvente (tampón acuoso que contiene ARN o ADN). Se presentan los parámetros de funcionamiento de los mezcladores CIJ y MIVM para preparar LNPs reproducibles con tamaño, potencial zeta, estabilidad y efectividad de transfección controlados. También se presentan las diferencias entre los LNP elaborados con una mala mezcla (soluciones de pipeteo) en comparación con la mezcla CIJ.

Se demuestra un protocolo detallado para sintetizar nanopartículas lipídicas (LNPs) utilizando tecnologías de mezcladores de chorro de impacto confinado (CIJ), incluyendo un CIJ de dos chorros y un mezclador de vórtice de entrada múltiple de cuatro chorros (μMIVM). Los mezcladores CIJ generan entornos de micromezcla turbulentos y reproducibles, lo que da como resultado la producción de LNP monodispersos.

Síntesis de nanopartículas lipídicas por flujo turbulento en mezcladores de chorro de impacto confinados

Lipid nanoparticles (LNPs) have demonstrated their enormous potential as therapeutic delivery vehicles, as evidenced by the approval and global usage of ...

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