Name: La ablación celular con láser en larvas intactas de Drosophila revela una competencia sináptica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Aprende ablación láser de neuronas individuales en larvas intactas de Drosophila para investigar la competencia sináptica durante el ensamblaje de circuitos neuronales. Este método permite estudiar los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo del sistema nervioso.

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Los experimentos con el microscopio de 2 fotones se realizaron en el Núcleo de Imágenes Celulares Avanzadas del Instituto del Cerebro Stiles-Nicholson de la FAU. Nos gustaría agradecer a la Iniciativa de Ciencias de la Vida de Júpiter por su apoyo financiero.

Todos los animales utilizados para el protocolo fueron de la especie Drosophila melanogaster. No hay problemas éticos en torno al uso de esta especie. No era necesaria la autorización ética para llevar a cabo este trabajo. Los detalles de las especies de Drosophila , los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Cría de Drosophila y selección del estadio larvario correcto
<ol><li>Elija una línea controladora Gal4 que impulse la expresión en las células que se van a ablacionar y recombínela con una línea reportera UAS-GFP o la cruce con ella. Cría moscas con alimento estándar para moscas a 25 °C. NOTA: Para la ablación de fibra gigante (GF), R91H05-Gal4 o A307-Gal4 se recombinó con UAS-GFP. Para las ablaciones de TTMn se utilizó ShakB(letal)-GAL4 recombinado con UAS-GFP (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Seleccione las larvas que hayan comenzado a emerger de la comida y trepen por el costado del frasco de comida. Esas larvas se encuentran en la etapa de deambulación, que es la etapa preferida para realizar la ablación de células GF. NOTA: La ablación se puede realizar en cualquier etapa larvaria. La última etapa larvaria fue importante para la manipulación del desarrollo del GFS porque los cuerpos de las células GF se pueden identificar fácilmente en el cerebro, pero los axones GF no han hecho conexiones con sus objetivos en esta etapa.</li>
</ol>2. Preparación de la larva del3er estadio
NOTA: Las larvas fueron anestesiadas utilizando un método similar al de Burra et al.9. Para que los tiempos de procedimiento sean cortos, prepare solo una larva a la vez. La exposición corta al anestésico mejorará la supervivencia de los animales de experimentación10.
<ol><li>Prepare un plato de vidrio con una tapa hermética. Coloque una bola de algodón en el plato y, debajo de una campana extractora, agregue aproximadamente 3-5 ml de éter etílico (líquido peligroso e inflamable, bata de laboratorio, guantes, gafas). Cubre el plato con la tapa.</li>
	<li>Recoja larvas individuales de3er estadio de viales de moscas. En la3ª etapa larvaria, las larvas abandonan el medio alimenticio y se arrastran por el costado del vial alimenticio11.<ol><li>Asegúrese de que las larvas aún se estén moviendo y no hayan comenzado la formación de pupario. Las larvas que son estacionarias y muestran un acortamiento del cuerpo están comenzando la pupación y no son aptas para la ablación. Recoge las larvas con un pincel pequeño. NOTA: La3ª etapa larvaria comienza después de la segunda muda a las 72 h de desarrollo (después de la puesta de huevos), y dura hasta la formación del pupario a las 120 h para las moscas criadas a 25 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfiera una larva a un recipiente pequeño y abierto. Coloque el recipiente en el plato de vidrio con éter etílico y cierre bien el plato. Al abrir el plato de vidrio, colóquelo debajo de un tubo o en una campana extractora para evitar que los vapores se escapen.<ol><li>En intervalos de 30 s, retire la tapa con la larva del plato y verifique la movilidad de la larva bajo un microscopio de disección. Por lo general, la larva se inmovilizará en 1 minuto. Una vez que los ganchos bucales dejan de temblar, la larva está lista para montar. Deseche cualquier larva que no esté completamente inmovilizada después de 3 min. NOTA: La parte superior de una tapa invertida de un tubo de microcentrífuga (tapa extraída del tubo) se puede utilizar como recipiente.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Montaje de larvas en portaobjetos para la ablación
<ol><li>Coloque la larva anestesiada en un portaobjetos de vidrio para microscopio. Sumerge la larva en una gota de solución salina de insecto; Esto eliminará algunos de los restos de comida que podrían adherirse a la larva.</li>
	<li>Bajo el microscopio de disección, retire la mayor parte de la solución salina con un pañuelo de papel. Coloque la larva con el lado dorsal hacia arriba para la ablación GF o el lado ventral hacia arriba para la ablación con TTMn. Baje lentamente un cubreobjetos de vidrio sobre la larva. Agregue solución salina al costado del cubreobjetos para llenar el espacio entre el portaobjetos de vidrio y el cubreobjetos.</li>
	<li>Para la ablación GF, verifique la posición del cerebro bajo un gran aumento en el microscopio de disección. Asegúrese de que el cerebro esté nivelado y sea visible a través de la cutícula. A menudo, el cerebro estará cubierto de tejido graso, lo que hace imposible la visualización y la ablación de las células.<ol><li>Para desplazar cualquier tejido graso que cubra el cerebro, aplique una ligera presión al cubreobjetos con pinzas y mueva el cubreobjetos de un lado a otro. Si el tejido graso no se puede mover del cerebro de esta manera, usa una larva diferente en su lugar.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Localización de las células objetivo
NOTA: El sistema multifotónico utilizado para este estudio se montó en un microscopio vertical. Se utilizó un software específico del sistema para controlar la adquisición y los ajustes de estimulación láser. El sistema estaba equipado con una fuente de luz de epifluorescencia para localizar las muestras. La lente del objetivo era una lente de inmersión en agua con un aumento de 25x, una larga distancia de trabajo de 2 mm y una NA de 1,10.
<ol><li>Coloque la muestra en la platina del microscopio multifotónico y utilice el filtro GFP para localizar la muestra en modo de epifluorescencia. Para la ablación con GF, los cuerpos celulares se pueden identificar en el cerebro, como se ve en la Figura 1A, C, D. Para la ablación de TTMn, se puede identificar un grupo de cuatro células desde el lado ventral en el cordón nervioso ventral (VNC), como se muestra en la Figura 1A,B. Cuando termine de enfocar, centre las celdas en el campo de visión y cambie al modo de 2 fotones.</li>
</ol>5. Configuración de los parámetros de ablación
<ol><li>Ajuste la configuración del láser y la ganancia del detector para ver las células que expresan GFP con el escáner Galvano. Una longitud de onda de 870 nm funciona mejor para visualizar la señal GFP. Centra la celda en el campo de visión.</li>
	<li>Utilice una región circular de interés (ROI) para definir el área de ablación. Asegúrese de que el ROI cubra la mayor parte de la superficie de la celda (Figura 1E,G).</li>
	<li>Configure el protocolo de ablación en el software. Establezca un marco de adquisición, luego estimulación, seguido de otro marco de adquisición.</li>
	<li>Inicie el ajuste de la potencia del láser de estimulación en un valor más bajo (10%-20 %) y ejecute el protocolo de estimulación. Una ablación exitosa se puede reconocer por un círculo claro en el centro del soma celular en la ubicación de la ROI y un aumento en la fluorescencia que rodea la ROI (Figura 1F).<ol><li>Si la ablación no tuvo éxito y simplemente blanqueó la célula (Figura 1H), aumente la potencia del láser en incrementos del 5% o el número de bucles de uno en uno y vuelva a ejecutar el protocolo. La potencia del láser aplicada estuvo entre el 10% y el 40% para el sistema utilizado en el protocolo. NOTA: Los ajustes de la potencia del láser para la ablación dependen en gran medida de la profundidad a la que se encuentren las células en el tejido y de otros factores, como el plegamiento de la cutícula. Si las células son brillantes y claramente visibles, la potencia del láser estará en el extremo inferior del rango. La potencia del láser será diferente para cada sistema en función del modelo de láser y de la antigüedad del láser.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig01.jpg"> Figura 1: Identificación de neuronas para la ablación con láser en larvas intactas de Drosophila L3. (A) Esquema de la ubicación del soma de fibra gigante (GF) en el cerebro y el grupo de neuronas motoras que contienen la motorna tergotrochanteral (TTMn) en el cordón nervioso ventral (VNC). (B) Proyección de intensidad máxima de la expresión de GFP que impulsa la expresión de GFP en las larvas de VNC. La línea media se indica mediante la línea de puntos. El círculo indica el grupo de neuronas que contienen el TTMn y que son objetivo para la ablación con láser. Barra de escala: 50 μm. (C) Vista de proyección parcial del cerebro de las larvas que expresa GFP bajo el control de A307-Gal4. El círculo indica el soma GF dirigido para la ablación con láser. Barra de escala: 50 μm. (D) Proyección de intensidad máxima del cerebro con R91H05-Gal4 impulsando UAS-GFP. Ambos GF (círculos) son identificables por su ubicación, forma y tamaño. Barra de escala: 50 μm. (E) Vista ampliada del soma GF antes de la ablación con láser. El círculo magenta indica la región objetivo para la ablación con láser. Barra de escala: 10 μm. (F) Vista ampliada del soma GF después de la administración de la potencia láser localizada y la ablación exitosa. Barra de escala: 10 μm. (G) Vista ampliada del soma GF antes de la ablación con láser. El círculo magenta indica la región objetivo para la ablación con láser. Barra de escala: 10 μm. (H) Vista ampliada del soma GF después de la administración de potencia láser localizada y la ablación (blanqueo) fallida. Barra de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
6. Recuperación de las larvas
<ol><li>Después de ablacionar con éxito la célula, retire el cubreobjetos y recoja suavemente las larvas del portaobjetos con un pincel. Coloque las larvas en un frasco de comida. Las larvas comenzarán a arrastrarse nuevamente dentro de los 30 minutos. NOTA: Mantener el tiempo del procedimiento corto mejora las tasas de supervivencia de los animales. Con la experiencia, el experimento se puede realizar en poco menos de 10 minutos.</li>
	<li>Continúe criando larvas en condiciones estándar hasta que se cierren de la cubierta de la pupa.</li>
</ol>7. Probar la funcionalidad del GFS en moscas adultas
NOTA: Los siguientes pasos se explican en detalle en Allan y Godenschwege12, y Augustin et al.13.
<ol><li>Pruebe las moscas adultas a la edad de 2 a 5 días después de la eclosión. Anestesia las moscas con CO2 y móntalas sobre cera dental empujando las patas dentro de la cera. Extienda las alas en un ángulo de 90° y fíjelas en su lugar con la cera. Asegure la cabeza empujando la probóscide en la cera.</li>
	<li>Coloque cables de estimulación en ambos ojos, un cable de tierra en el abdomen y electrodos de registro de vidrio en los músculos de salto (TTM) de cada lado.</li>
	<li>Estimula el circuito GF con estímulos individuales para medir la latencia de respuesta de ambos músculos. Estimula el circuito con trenes de estímulos de 100 Hz y 200 Hz, respectivamente, para medir la siguiente frecuencia para ambos músculos.</li>
</ol>8. Disección y etiquetado del sistema de fibra gigante para la obtención de imágenes confocales
NOTA: La disección del SNC mosca y la inyección de tinte se detallan en Boerner y Godenschwege14.
<ol><li>Retire suavemente la mosca de la cera dental con pinzas y transfiérala a una placa de Petri revestida de elastómero de silicona bajo un endoscopio de disección.</li>
	<li>Retire las patas, las alas y la probóscide con unas tijeras y use alfileres de insectos para asegurar el lado dorsal de la mosca hacia arriba en el recubrimiento de elastómero.</li>
	<li>Haz una incisión lateral a lo largo de la línea media desde la parte media del abdomen, a través de todo el tórax y hacia arriba por el cuello, conectando el tórax con la cabeza. Abre la mosca con alfileres para insectos. Extrae órganos y glándulas de la mosca sin dañar el sistema nervioso. NOTA: En este punto, los axones GF se pueden inyectar con colorantes para marcar los GF y las neuronas acopladas eléctricamente13.</li>
	<li>Retire la cápsula de la cabeza para exponer el cerebro.</li>
</ol>9. Inmunohistoquímica del sistema nervioso
<ol><li>Después de la disección del SNC, fije la mosca en PFA al 4% en PBS durante 45 min a temperatura ambiente (RT). Lavar durante 20 min en PBS a RT (3 veces).</li>
	<li>Bloquear la muestra durante 1 h a RT en BSA al 3% en PBS con una solución de detergente al 0,5%.</li>
	<li>Incubar durante 2-3 noches a 4 °C en BSA al 3% en PBS con solución de detergente al 0,3% y anti-GFP de conejo (1:500). Lavar durante 20 min en PBS a RT (6 veces).</li>
	<li>Incubar durante la noche a 4 °C en PBS con Alexa 488 anti-conejo. Lavar durante 20 min en PBS a RT (6 veces).</li>
	<li>Deshidrate muestras con una serie ascendente de etanol (50%, 70%, 90%, 100% etanol) durante 10 minutos en cada paso. Retira los alfileres y recorta el abdomen y los músculos de vuelo. Transfiera el resto del tórax que contiene el sistema nervioso a un portaobjetos y cúbralo con un medio de montaje como el salicilato de metilo. Coloque un cubreobjetos sobre la muestra y séllela con esmalte de uñas.</li>
	<li>Obtener imágenes del sistema nervioso en un microscopio confocal para analizar la anatomía del terminal GF.</li>
</ol>

Ablación de una sola neurona en Drosophila para estudiar la adaptación del sistema nervioso

<ol><li>Chung, S. H., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A+Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).</li>
<li>Bower, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+branching+has+conserved+needs+for+local+parasympathetic+innervation+but+not+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission.</a> BMC Biol. 12, 92(2014).</li>
<li>Angelo, J. R., Tremblay, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated+cell+ablation+during+post-implantation+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development.</a> Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+an+escape%3A+Development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).</li>
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<li>Wiesel, T. N., Hubel, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+unilateral+and+bilateral+eye+closure+on+cortical+unit+responses+in+kittens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens.</a> J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+giant+fiber+neuron+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).</li>
<li>Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+larvae+to+study+epidermal+wound+closure+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation.</a> Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).</li>
<li>Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae.</a> Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+Drosophila+giant+fiber+system+%28GFs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs).</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), 5453(2010).</li>
<li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+giant+fiber+pathway+of+d.+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster.</a> J Vis Exp. (47), e2412(2011).</li>
<li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+preparation+of+the+adult+Drosophila+ventral+nerve+cord+for+giant+fiber+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection.</a> J Vis Exp. (52), e3080(2011).</li>
<li>Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Null+mutation+in+shaking-b+eliminates+electrical%2C+but+not+chemical%2C+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system%3A+A+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study.</a> J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).</li>
<li>Kennedy, T., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+identified+electrically+coupled+neurons+support+development+of+the+Drosophila+giant+fiber+model+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit.</a> eNeuro. 5 (6), 0346(2018).</li>
<li>Mcfarland, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+arrival+times+and+physical+occupancy+establish+visual+projection+neuron+integration+on+developing+dendrites+in+the+Drosophila+optic+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La ablación celular con un microscopio de 2 fotones demostró ser un método muy exitoso para manipular el desarrollo de circuitos neuronales en Drosophila. Dado que este método no es invasivo, causa un daño mínimo al animal. Los datos respaldan la utilidad de esta manipulación específica de la célula de circuitos conocidos.
Crucial para el éxito de la ablación fue la selección del controlador Gal4 más adecuado. Dado que el GFS está bien estudiado, se han descrito muchas líneas específicas de controladores Gal47. La mayoría de los controladores Gal4 están muy restringidos, pero aún se expresan en muchas otras neuronas. Uno de los retos fue identificar de forma fiable las células diana en el animal intacto. En el caso de los animales con una etiqueta GFP claramente visible, la ablación podía realizarse a baja potencia láser y, a menudo, sólo requería un ensayo. En animales en los que el tejido graso cubría el cerebro o la expresión de GFP era débil, la eliminación de las células diana requería una mayor potencia láser y múltiples bucles de exposición al láser. Los cuerpos celulares GF estaban ubicados a unos 100 μm de profundidad desde el lado dorsal del cerebro. En el caso de los experimentos en los que las células diana se encuentran a mayor profundidad, podría ser útil realizar la ablación en fases larvales más tempranas, cuando el sistema nervioso es más pequeño.
En experimentos anteriores en el laboratorio, se exploraron diferentes métodos para la ablación celular. El uso del sistema UAS/Gal4 para impulsar la expresión de toxinas también condujo a la eliminación de neuronas específicas. Sin embargo, es mucho más difícil controlar la deleción de células individuales y evitar efectos fuera del objetivo. La otra dificultad es controlar el momento exacto del evento de eliminación de células. La ablación celular con láser permitió un control preciso sobre la ubicación del objetivo y el momento de la eliminación, pero aún quedaban algunos desafíos por superar antes de que se perfeccionara el método y se alcanzaran tasas de éxito de más del 80% (supervivencia animal y ablación celular exitosa). La tasa de supervivencia de los animales se vio afectada negativamente por la exposición prolongada al éter etílico y los largos tiempos de procedimiento. Los estudios han demostrado que se pueden lograr altas tasas de supervivencia a la pupación (78%) y a la eclosión de los adultos (67%) con una exposición de 3,5 minutos de las larvas de Drosophila L3 al éteretílico 10. La exposición durante 3,5 minutos asegurará que el animal esté inmóvil hasta por 8 h. Para la ablación de células con láser, los animales deben permanecer inmóviles durante 30 minutos o menos. Por lo tanto, el tiempo de exposición al éter etílico puede mantenerse muy por debajo de 3,5 min. En la mayoría de los casos, las larvas quedaron completamente inmóviles en 1 minuto.
Los resultados de la ablación láser demuestran que el GF se puede ablacionar limpiamente, y el efecto sobre el GF vecino contralateral se evalúa fácilmente. El resultado de la ablación fue claro y consistente. En 13 de las 15 ablaciones de células individuales, el resto de los socios GF exhiben una terminal bilateral que nunca se ha visto en los animales de control. Este terminal bilateralmente simétrico es fácilmente reconocible, y la rama contralateral inusual es similar en tamaño a un terminal normal y está acoplada a la neurona motora objetivo contralateral. El terminal bilateral está acoplado a ambas neuronas motoras diana y funciona casi como de tipo salvaje en la mayoría de los especímenes, impulsando tanto la diana normal-ipsilateral como la neurona motora diana contralateral con latencias y frecuencias de seguimiento cercanas a los valores de control.
El experimento complementario, una ablación unilateral de una neurona motora diana, proporciona una comparación interesante. La neurona motora restante a menudo exhibe un crecimiento dendrítico reactivo, extendiendo un proceso a través de la línea media hacia el espacio normalmente ocupado por el vecino eliminado. Aunque esta dendrita no es tan grande como la eliminada, demuestra una reacción similar a la de los GF que pierden a su pareja bilateral. Por el contrario, el GF, ahora sin objetivo, responde solo modestamente al objetivo ausente, extendiendo procesos menores a través de la línea media y a lo largo de las dendritas de las neuronas motoras restantes. Esta modesta respuesta contrasta marcadamente con la dramática respuesta del GF a la ausencia de un GF bilateralmente homólogo, donde se forma un gran terminal contralateral para complementar el terminal normal y formar un terminal bilateral.
Recientemente se ha realizado un experimento de ablación paralela sobre las entradas presinápticas al GF en el cerebro, donde se reveló un tipo similar de "competencia" por el espacio sináptico17. Las entradas visuales al GF colocan el glomérulo donde las neuronas de proyección visual (VPN) llegan a las dendritas GF. La eliminación de un grupo de VPNs (en este caso genéticamente) demuestra que las VPNs restantes toman el control e inervan parte del espacio sináptico del vecino ausente y producen una recuperación fisiológica compensatoria de la respuesta visual a los estímulos que se avecinan. Cuando se eliminan las primeras aferencias que llegan, las llegadas posteriores ocupan espacio y ya no están ocupadas. La mayor similitud fenomenológica con el presente trabajo es el papel aparente que juega la ocupación física en la determinación del equilibrio entre los diversos insumos. Los terminales de salida de los dos GF parecen competir entre sí por el espacio sináptico físico.

La ablación láser es una herramienta preferida para diseccionar circuitos neuronales en una amplia variedad de organismos. Desarrollado en sistemas genéticos modelo como gusanos y moscas, se ha aplicado en todo el reino animal para estudiar la estructura, la función y el desarrollo del sistema nervioso 1,2,3. Aquí, la ablación de una sola neurona se empleó para investigar cómo interactúan las neuronas durante el ensamblaje del circuito en Drosophila. El sistema de escape de la mosca es uno de los circuitos favoritos para el análisis porque contiene las neuronas más grandes y las sinapsis más grandes de la mosca adulta, y el circuito ha sido bien caracterizado en lasúltimas décadas. El papel que juegan las interacciones neurona-neurona en el ensamblaje del circuito de fibra gigante es un punto focal de esta investigación.
Un tipo de interacción que ha sido un punto focal en la neurociencia desde el trabajo de Hubel y Wiesel en la década de 1960 es la "competencia sináptica"5,6. En este protocolo, la ablación con láser se utilizó para revisar el papel de la competencia a través de la ablación de una sola célula en el sistema de fibras gigantes (GFS) de Drosophila, donde se podrían descubrir los fundamentos moleculares de los fenómenos.
La ablación de las neuronas en la mosca en desarrollo ha sido difícil por una variedad de razones, incluida la visualización de las neuronas objetivo, la precisión del método de ablación y la supervivencia del espécimen. Para superar estos problemas en el GFS, se utilizó el sistema UAS/Gal47 para etiquetar las neuronas de interés, y se utilizó un microscopio de dos fotones para eliminar la fibra gigante presináptica o la neurona motora de salto postsináptica (TTMn).
En este estudio, para determinar el papel que juegan las neuronas bilaterales vecinas en el ajuste de la conectividad sináptica y la fuerza sináptica en el GFS, se eliminó uno de los pares bilaterales de neuronas (ya sea GF presináptico o neurona motora postsináptica) justo antes del desarrollo de la pupa. En esta etapa del desarrollo, la axonogénesis de GF no se ha completado8. A continuación, se examinó la estructura y la función del circuito sináptico del FG en el adulto, prestando especial atención a la salida del FG restante.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniCabra Pura Anti-Conejo IgG (H+L)</td><td>Jaxkson ImmunoResearch</td><td>111-545-003</td><td></td></tr><tr><td>Proteína fluorescente anti-verde, conejo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11122</td><td>concentración 1:500</td></tr><tr><td>Apo LWD 25x/1.10W Objetivo</td><td>Nikon</td><td>MRD77220</td><td>inmersión en agua larga distancia</td></tr><tr><td>de trabajo Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton Ball</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td></td></tr><tr><td>Dextra, Tetrametilrodamina, 10.000 MW, Lisina fijable (fluoro-Ruby)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D1817</td><td></td></tr><tr>Receta salina de<td>Drosophila</td><td></td><td></td><td>de Gu y O'Dowd, 2006</td></tr><tr><td>Ethyl Ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E134-1</td><td>Peligro, líquido inflamable</td></tr><tr><td>Alimento para moscas B (receta de Bloomington)</td><td>LabExpress</td><td>7001-NV</td><td></td></tr><tr><td>Salicilato de metilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3695-500</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de microscopio 18x18 #1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>Vector trazador de neurobiotina</td><td> Laboratorios</td><td>SP-1120</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio multifotónico Nikon A1R</td><td>Nikon</td><td></td><td>en posición vertical FN1 soporte de microsope</td></tr><tr><td>NIS Elements Investigación avanzada</td><td>Nikon</td><td></td><td>Software de adquisición y análisis de datos</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)Fisher</td> <td>Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Salin tamponada con fosfato)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2944-100</td><td>Tabletas</td></tr><tr><td>R91H05-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>40594</td><td></td></tr><tr><td>shakB(lethal)-GAl4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>51633</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost portaobjetos de vidrio para microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>solución de detergente</td></tr><tr><td>para 422355000 UAS-10xGFP</td><td>Bloomington Centro de Stock de Drosophila</td><td>32185</td><td></td></tr></tbody></table>

la ablación celular con láser en larvas intactas de drosophila revela una competencia sináptica

Laser Cell Ablation in Intact Drosophila Larvae Reveals Synaptic Competition

El protocolo describe la ablación de una sola neurona con un sistema láser de 2 fotones en el sistema nervioso central (SNC) de larvas intactas de Drosophila melanogaster. Con este método no invasivo, el sistema nervioso en desarrollo puede manipularse de una manera específica para cada célula. La interrupción del desarrollo de las neuronas individuales en una red se puede utilizar para estudiar cómo el sistema nervioso puede compensar la pérdida de información sináptica. Las neuronas individuales fueron ablacionadas específicamente en el sistema de fibras gigantes de Drosophila, con un enfoque en dos neuronas: la fibra gigante presináptica (GF) y la neurona motora tergotrochanteral postsináptica (TTMn). El GF hace sinapsis con el TTMn ipsilateral, que es crucial para la respuesta de escape. La ablación de uno de los GF en el tercer estadio del cerebro, justo después de que el GF comienza el crecimiento axonal, elimina permanentemente la célula durante el desarrollo del SNC. El GF restante reacciona al vecino ausente y forma un terminal sináptico ectópico con el TTMn contralateral. Este terminal atípico, bilateralmente simétrico, inerva ambos TTMns, como se demuestra mediante el acoplamiento de colorantes, e impulsa ambas neuronas motoras, como se demuestra mediante ensayos electrofisiológicos. En resumen, la ablación de una sola interneurona demuestra la competencia sináptica entre un par bilateral de neuronas que puede compensar la pérdida de una neurona y restaurar las respuestas normales al circuito de escape.

Este método se puede utilizar para manipular el desarrollo de redes neuronales específicas en el sistema nervioso de Drosophila. La principal pregunta de investigación aquí fue la formación de conexiones sinápticas. La eliminación de la GF presináptica o la TTMn postsináptica permitió la investigación de la sinaptogénesis reactiva en esta sinapsis central y los mecanismos moleculares cruciales para la función y el desarrollo sináptico. Como se describe en el protocolo, se realizó una ablación celular con láser de uno de los GF o uno de los TTMns, y se analizaron los efectos sobre la sinapsis después del desarrollo de la pupa en la mosca adulta.
Para garantizar que el procedimiento no tuviera un efecto negativo en la supervivencia de los animales, se realizaron simulacros de ablación en paralelo. Para las ablaciones simuladas, los animales fueron tratados de la misma manera que los animales de experimentación, pero se administraron pulsos de láser con una potencia láser del 0%. En el 82,4% de los casos, los animales de las ablaciones simuladas se convirtieron en moscas adultas. Los GF de moscas ablacionadas simuladas fueron capaces de responder con una latencia de menos de 1 ms y seguir una estimulación de 100 Hz para el 79,3% de los estímulos. La anatomía de las moscas no tratadas era indistinguible de la de las moscas no tratadas.
Para cada animal de experimentación, la ablación se verificó anatómicamente. En los animales ablacionados con GF, el GF no ablacionado fue inyectado con tinte y se tomaron imágenes (ver más abajo). Si solo un axón GF era visible en el conectivo cervical (CvC), se suponía la ablación del otro GF. La ablación también pudo verificarse a través de la ausencia de un soma marcado con GFP en el lado ablacionado del cerebro (Figura 2A, círculo). Para evaluar la ablación de TTMn, se analizó la señal de GFP en el adulto VNC, donde el soma y la dendrita de TTMn se pueden identificar fácilmente. La ausencia de TTMn en un lado se reconoció fácilmente debido a la falta de soma y dendritas (Figura 2B, círculo).
Para probar la función del GFS en moscas tratadas, se registraron los potenciales sinápticos de los músculos de salto12,13, que son inervados por el TTMn (Figura 3A). Los GFs forman una sinapsis electroquímica mixta con la dendrita medial TTMn15. El terminal GF no está ramificado y muestra una curvatura lateral típica que se opone a la dendrita TTMn en la región sináptica (Figura 3D, Figura 4A punta de flecha). En las moscas control, cada GF inerva exclusivamente su motoneurona ipsilateral. En las grabaciones de las fibras TTM, la fuerza de la conexión se evaluó analizando la latencia de respuesta a la estimulación de 1 Hz y la frecuencia de seguimiento a la estimulación de 100 Hz (Figura 3B,C). Las moscas control mostraron una latencia de respuesta promedio de menos de 1 ms y pudieron seguir una estimulación de 100 Hz para el 78,1% de los estímulos (Figura 3B). Después de realizar los registros fisiológicos, la muestra se diseccionó para revelar el SNC y los GF, que se inyectaron con un tinte con una mezcla de TRITC-Dextrano y neurobiotina. La gran molécula de dextrano marca el axón GF y el terminal, pero no pasa a través de las uniones de separación. La neurobiotina puede cruzar las uniones gap entre GF y TTMn, y la señal de neurobiotina se detectó en la dendrita postsináptica (Figura 3E, F, puntas de flecha). Este acoplamiento de colorante de neurobiotina confirmó el acoplamiento eléctrico entre las dos neuronas. La neurobiotina también se puede detectar en muchas otras neuronas del VNC que están conectadas a través de uniones gap con el GF16 (Figura 3E,F).
Las mismas pruebas fisiológicas y anatómicas se realizaron después de que un GF fue ablacionado en L3. El axón de la mayoría (13/15) de los GF restantes en las moscas de ablación exhibe una división de la terminal en dos ramas: una en la ubicación ipsilateral habitual y otra que cruza la línea media a una posición homóloga contralateral a la GF intacta (Figura 3G, flecha). Cada rama fue acoplada con tinte a una de las dendritas TTMn (Figura 3H, I, puntas de flecha). Los registros fisiológicos de los TTMs confirmaron esta conexión sináptica de un GF a ambos TTMns, aunque más débilmente de lo normal. Las latencias de respuesta del TTM fueron superiores a 1 ms para ambos lados, y las siguientes frecuencias a 100 Hz fueron del 37,1% para el TTMn ipsilateral al GF intacto y del 28% para el TTM contralateral (Figura 3C).
Dado que la ablación de un GF hizo que el GF restante inervara ambas neuronas diana, el siguiente experimento tenía como objetivo observar la respuesta de los GF vecinos cuando uno carecía de una neurona motora diana ipsilateral normal. Para este experimento, se eliminó una de las neuronas postsinápticas y se evaluó la anatomía y función del TTMn restante, así como la morfología de los terminales GF. Al visualizar tanto los TTMns como los GF en animales de control adultos, la región de presunto contacto sináptico era claramente visible (Figura 4A, puntas de flecha). Cada dendrita medial TTMn se apuso a la terminal presináptica GF ipsilateral. Pequeñas proyecciones de dendritas TTMn de ambos lados estaban en contacto con la línea media (Figura 4C; recuadro). El acoplamiento del colorante con la neurobiotina fue notablemente visible en ambos TTMn (Figura 4D, puntas de flecha).
Cuando se ablacionó un TTMn, se cambió la morfología de la dendrita medial TTMn restante. La dendrita medial en estos especímenes extendía una rama larga y gruesa a través de la línea media (Figura 4I, K; flechas amarillas). Además, proyecciones más delgadas hacia ambos terminales GF se extendieron anteriormente (Figura 4E, G; puntas de flecha amarillas). El GF, ipsilateral al TTMn, mostró su anatomía habitual con un terminal que se proyectaba a lo largo de la dendrita del TTMn.
La respuesta de la GF "huérfana" que carecía de una neurona motora diana fue de interés primordial. En la mayoría de los casos (61,5% de los animales), el GF huérfano exhibió un terminal dividido con un terminal en el lado ipsilateral y el otro terminal cruzando la línea media y proyectándose hacia la dendrita TTMn contralateral (Figura 4J, flechas). Estas ramas cruzadas del GF siempre fueron más pequeñas que las observadas en el experimento complementario cuando se ablacionó el GF vecino (Figura 3F). El terminal ipsilateral entró en contacto con la rama TTMn que se extendía a través de la línea media (Figura 4I, flecha amarilla). En el 23% de los especímenes, el GF huérfano cruzó la línea media (Figura 4F, flecha) y se proyectó a lo largo de una de las ramas anteriores del TTMn (Figura 4E, puntas de flecha amarillas) y se acopló con tinte al TTMn restante (Figura 4H, punta de flecha).
Se observaron dos fenotipos más en moscas de ablación con TTMn (Figura 4M). En una de las 13 moscas, ambas hembras hicieron la flexión normal y permanecieron en sus respectivos lados del sistema nervioso. En otro caso, el GF huérfano exhibió el fenotipo sin fin, donde el GF huérfano no llegó a un terminal y se detuvo antes del área donde normalmente se dobla. Para los cuatro fenotipos, las grabaciones de TTM en el lado del TTMn intacto fueron comparables a la fisiología de tipo salvaje (WT) con una latencia de respuesta inferior a 1 ms y una frecuencia de seguimiento a 100 Hz al 100% o cerca del 100%. La eliminación de un objetivo puede permitir que ambos GF compartan el TTMn de destino restante. En la mayoría de los casos, ambos GF harán una conexión con el TTMn restante. Generalmente, el GF huérfano exhibirá un terminal bilateral. En las moscas de control, los GF nunca cruzarán la línea media; sin embargo, en aproximadamente el 85% de las moscas de ablación con TTMn, un GF cruzó la línea media para contactar con la TTMn contralateral. La inervación de un TTMn por dos GF no influyó negativamente en la función sináptica.
Cabe destacar que la ausencia de la GF vecina tiene un efecto mayor que la ausencia de la neurona motora diana. El terminal bilateral formado en ausencia del GF contralateral es mucho más grande y más obviamente funcional que los cambios cuando se extirpa el objetivo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig02.jpg"> Figura 2: Ejemplos de ablaciones exitosas en el SNC adulto. (A) Proyección de intensidad máxima del cerebro de una mosca adulta después de la ablación de GF larvaria. GFP (verde) es impulsado por el A307-GAL4. El círculo indica el área donde falta el GF ablacionado. La punta de flecha apunta al GF restante que expresa GFP en el otro lado del cerebro. El GF estaba lleno de TRITC-Dextran (rojo). El axón se proyecta posteriormente hacia el VNC. Barra de escala: 20 μm. (B) Proyección de intensidad máxima de un adulto VNC donde se ablacionó un TTMn en L3. El TTMn restante (punta de flecha) expresa GFP bajo el controlador shakB (letal). El área del TTMn faltante se indica mediante un círculo. Barra de escala: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig03.jpg"> Figura 3: La ablación larvaria de una fibra gigante (GF) provoca la ramificación bilateral de la terminal presináptica de la GF restante. (A) Esquema de la configuración experimental para probar la estructura y función del sistema de fibra gigante adulta (GFS). El electrodo de registro mide la latencia y la frecuencia de seguimiento de las salidas de la motorna tergotrochanteral (TTMn) en los músculos tergotrocantorales (TTM) tras la estimulación del cerebro en el animal intacto. Después de la disección del sistema nervioso, el tinte se inyectó en los axones GF en el conectivo cervical (CvC). (B,C) Trazas de muestra para la latencia de respuesta TTM y la frecuencia de seguimiento a 100 Hz (n representa el número de TTM registrados en cada situación con la latencia media y la frecuencia de seguimiento mostradas). (B) Los animales de control con dos GF intactos muestran latencias de TTM inferiores a 1 ms y frecuencias de seguimiento cercanas al 100% a 100 Hz. (C) El único GF restante en animales ablacionados inerva ambos TTMns. Las latencias de ambos TTMn son más largas que en los controles, y después de 100 Hz, la frecuencia disminuye significativamente. (D-I) Proyección de máxima intensidad de pilas de imágenes confocales para GF rellenos de colorante. Se coinyectaron TRITC-Dextrano (D,G,F,I en rojo) y Neurobiotina (E,H,F,I en gris). La neurobiotina puede cruzar las uniones gap entre el GF y el TTMn, marcando las neuronas postsinápticas. Las líneas punteadas indican la línea media. (D) Anatomía típica de los animales de control con la curvatura terminal. (E,F) La neurobiotina marca muchas neuronas postsinápticas acopladas eléctricamente a las GF. Las dendritas TTMn marcadas transsinápticamente se indican con puntas de flecha. (G) Después de la ablación, el GF restante desarrolla un terminal adicional (flecha), que cruza la línea media para inervar el TTMn contralateral. (H,I) Ambos TTMn (puntas de flecha) están acoplados al mismo GF. Barras de escala: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig04v2.jpg"> Figura 4. La ablación larvaria de una neurona motora tergotrocantorera (TTMn) provoca la inervación de la TTMn restante por ambas fibras gigantes (GF). (De la A a la L) Las proyecciones de intensidad máxima de pilas de imágenes confocales de TTMn marcadas con GFP (verde) bajo el control de shakB(letal)-Gal4 y los GFs se rellenaron con TRITC-Dextrano (magenta) y Neurobiotina (rojo). La línea punteada indica la línea media del sistema nervioso. (A-D) Probetas de control con ambos TTMn intactos. Los GF hacen su curva terminal típica alejándose de la línea media para entrar en contacto con el TTMn (A,B), y cada GF entra en contacto con un TTMn. Las dendritas del TTMn se encuentran en la línea media (C). Cada GF está acoplado a su TTMn (D, puntas de flecha blancas). (E-H) El TTMn izquierdo estaba ablacionado. La dendrita medial de la TTMn restante se proyecta a través de la línea media (G, flecha amarilla). El GF huérfano cruza la línea media (flecha blanca) en la región sináptica y entra en contacto con la dendrita TTMn contralateral (E,F). Los GFs se acoplan al TTMn restante (H, punta de flecha). (I-L) Ejemplo de otro fenotipo GF donde se ablacionó el TTMn izquierdo. La dendrita medial de la TTMn restante se proyecta a través de la línea media (I y K, flecha amarilla). El GF huérfano a la izquierda hace un terminal bilateral; una rama se proyecta contralateralmente y la otra permanece ipsilateral (J, flechas) para conectarse al TTMn. Barras de escala: 20 μm. (M) Esquema de los cuatro fenotipos diferentes de GF observados en animales de ablación con TTMn. n indica el número de animales de cada clase. Se muestran los promedios con error estándar para la latencia de respuesta TTM y la frecuencia de seguimiento (FF) a 100 Hz para el lado del TTMn <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig04large.jpg" target="_blank">intacto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo demuestra la ablación celular con láser de neuronas individuales en larvas intactas de Drosophila . El método permite estudiar el efecto de la reducción de la competencia entre neuronas en el sistema nervioso en desarrollo.

La ablación celular con láser en larvas intactas de Drosophila revela una competencia sináptica

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