Name: Identificación de células quiescentes en un modelo de leucemia linfoblástica aguda de células T de pez cebra mediante tinción de proliferación celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:55:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprende a identificar células leucémicas quiescentes mediante tinción de proliferación celular en un modelo de leucemia linfoblástica aguda de células T de pez cebra Danio rerio. Este método permite aislar células dormantes para estudios de cribado de fármacos y análisis transcriptómicos.

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En este protocolo, estamos utilizando células T-ALL de pez cebra marcadas con GFP que se generaron previamente en la cepa CG1 y, por lo tanto, pueden inyectarse directamente en el pez cebra CG1 singénicoreceptor 15. En resumen, la leucemia se generó por microinyección de ADN de rag2:Myc y rag2:GFP en embriones unicelulares de pez cebra CG1. Los animales fueron monitoreados para el desarrollo de leucemia a partir de las 3 semanas posteriores a la inyección, utilizando microscopía de fluorescencia. Las células leucémicas positivas para GFP se aislaron en FACS y se trasplantaron en serie en el pez cebra receptor CG1 para generar clones con una alta frecuencia de LSC. Los detalles de todo el protocolo son descritos por Blackburn et al.15.
Alternativamente, la T-ALL derivada de rag2:Myc primaria puede generarse mediante microinyección de ADN de embriones de pez cebra17. La microinyección de ADN de rag2:Myc con un reportero fluorescente impulsado por rag2, como GFP, puede dar lugar al desarrollo de células B, células T y ALL18 mixtas. Se verificó previamente que los clones de leucemia utilizados en este protocolo eran T-ALL15. Todos los procedimientos experimentales con pez cebra fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kentucky, protocolo 2019-3399.
1. Propagación de células de LLA-T de pez cebra in vivo
<ol><li>Descongele un vial que contenga 1 ml de células T-ALL de pez cebra congeladas marcadas con GFP en un baño de agua a 37 °C con agitación suave, hasta que se descongele. Una vez descongelado, transfiéralo a hielo.</li>
	<li>Pipetee lentamente el contenido del tubo en un tubo cónico de 15 mL con 4 mL de medio de pescado (0,9x PBS + 5% FBS) para diluir el medio de congelación.</li>
	<li>Centrifugar durante 5 min a 2.500 × g a 4 °C. Retire los medios del pellet. Vuelva a suspender en 0,5 ml de medio para peces y mantenga las células en hielo.</li>
	<li>Cuente las células y dilúyalas si es necesario hasta 100.000 células/5 μL.</li>
	<li>Anestesiar el pez cebra CG1 adulto añadiendo 200 μL de 4 mg/mL de anestésico (MS-222) a 25 mL de agua del sistema de peces en una placa de Petri. Sostenga el pez CG1 con la parte ventral hacia arriba e inyecte 5-6 μL en el espacio intraperitoneal (IP) con una jeringa de microlitros Hamilton. Mueva a los animales de regreso a sus tanques y controle si vuelven a nadar normalmente antes de volver a colocarlos en el sistema. NOTA: Se utilizaron peces cebra adultos, de 60 días o más, para los estudios de trasplante descritos en este protocolo.</li>
	<li>Controle el crecimiento de la leucemia una vez por semana con un microscopio de fluorescencia. Consulte la sección 2 a continuación para obtener detalles sobre el procedimiento de detección.</li>
</ol>2. Recolección de células leucémicas marcadas con fluorescencia
<ol><li>Aproximadamente 21-28 días después del trasplante, anestesiar al pez cebra CG1 adulto añadiendo 200 μL (4-5 gotas) de 4 mg/mL de anestésico a 25 mL de agua del sistema de peces en una placa de Petri.</li>
	<li>Examinar el pez cebra CG1 para detectar la carga de leucemia evaluando el porcentaje de células leucémicas marcadas con GFP en el animal con un microscopio epifluorescente, utilizando el filtro adecuado para detectar la fluorescencia de GFP. La leucemia GFP positiva está lista para ser cosechada si se ha diseminado en el &gt;70% del animal.</li>
	<li>Eutanasiar al animal añadiendo 1 mL de anestésico de 4 mg/mL en una placa de Petri que contenga 9 mL de agua del sistema de peces. Permite que cesen todas las señales de vida; Por ejemplo, observe el cese del movimiento opercular de los peces (~5 min).</li>
	<li>Mueva el pez cebra a una nueva placa de Petri y agregue 1 ml de medio de pescado para que sirva como amortiguador para las células. Con una nueva hoja de afeitar, primero decapita al pez cebra y luego macera el tejido con la misma hoja de afeitar. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para desalojar grandes grupos de células.</li>
	<li>Pase las células a través de un filtro celular de 40 μm a un tubo cónico de 50 mL para disociarlas en una suspensión de una sola célula. Mantenga las células en hielo.</li>
</ol>3. Optimización de la concentración del colorante de proliferación celular (CellTrace Far Red) para la tinción y la viabilidad celular del pez cebra
NOTA: Para este protocolo, y dado que las células tumorales están marcadas con GFP, utilizamos un colorante de proliferación de glóbulos rojos lejanos (CellTrace Far Red) para evitar la superposición espectral, que se denominará CT-FR.
<ol><li>Prepare una solución de 1 mM del tinte fluorescente inmediatamente antes de usarlo agregando el volumen apropiado de DMSO según las recomendaciones del fabricante. Tienen soluciones de trabajo de 1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM y 0,01 mM; diluir según sea necesario en medios de pescado para probar la viabilidad celular después de la tinción.</li>
	<li>Cuente las células y recoja 1 × 106 células en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugar a 2.500 × g a 4 °C durante 5 min. Retire el líquido y vuelva a suspender las células en 1 ml de 0,9x PBS.</li>
	<li>Divida la suspensión celular en cuatro tubos de 250 μL cada uno para el tratamiento con CT-FR.</li>
	<li>Añada 250 μL de PBS 0,9x para elevar el volumen a 500 μL cada uno con aproximadamente 250.000 células/tubo.</li>
	<li>Añada las cantidades necesarias de las soluciones de trabajo descritas anteriormente a cada uno de los cuatro tubos para alcanzar las siguientes concentraciones finales: 1 μM, 0,5 μM, 0,1 μM y 0,05 μM. Incubar durante 20 minutos a 37 °C, protegido de la luz.</li>
	<li>Granule las células girando a 2.500 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Retire el líquido y lave las células con 500 μL de medio de pescado para eliminar el exceso de colorante.</li>
	<li>Vuelva a pelar, retire el líquido y vuelva a suspender en 25 μL de medio de pescado. Utilice 1 μL para contar las células en una dilución 1:10 en 50% de Azul de Tripán.</li>
	<li>Examinar las células bajo el microscopio para determinar su viabilidad celular; Las células vivas no retendrán el azul tripán y se verán brillantes bajo el microscopio, mientras que las células muertas absorberán el tinte y se verán oscuras. Examine primero las células bajo el canal de fluorescencia apropiado para identificar las células tumorales y luego use el canal de campo claro para evaluar la viabilidad celular.</li>
	<li>Seleccione la concentración que dé como resultado una tinción exitosa mientras se mantiene la viabilidad celular (&gt;90% de células tripan-azul negativas). NOTA: Para las células T-ALL de pez cebra probadas en este experimento, se utilizó una concentración de 1 μM para una tinción exitosa y un &gt;90% de la viabilidad celular.</li>
</ol>4. Propagación de células de pez cebra T-ALL teñidas con CT-FR in vivo
<ol><li>Usando la concentración optimizada de CT-FR de la Sección 3, tiña las células de pez cebra. Deje algunas células tumorales sin teñir para la generación del tumor T-ALL marcado con GFP, como control positivo para GFP durante la clasificación de FACS. Diluir las células teñidas y no teñidas a 50.000 células/5 μL para el trasplante.</li>
	<li>Anestesiar el pez cebra CG1 adulto añadiendo 200 μL de 4 mg/mL de anestésico a 25 mL de agua del sistema de peces en una placa de Petri.</li>
	<li>Inyecte 5 μL de la suspensión celular en la cavidad IP del pez cebra como se describe en la sección 1 tanto para las células teñidas como para las no teñidas. Inyecte 5-6 peces cebra por grupo para tener en cuenta la mortalidad potencial después de la inyección.</li>
	<li>Examinar a los animales mediante microscopía fluorescente bajo sedación 2 veces por semana para detectar el desarrollo de leucemia. NOTA: Después de ~ 10-14 días, la leucemia debería ocupar aproximadamente el 30-40% de este cuerpo. Planifique la recolección de leucemia y la clasificación posterior dentro de este período de tiempo. Esperar a que el tumor se expanda a un tamaño grande puede resultar en una mayor dilución del tinte celular fluorescente y dificultad para detectar su señal. Considere la optimización del momento de la extracción del tumor para el modelo tumoral elegido. Además, se recomienda un seguimiento tumoral más frecuente para garantizar la captura del tamaño tumoral deseado.</li>
</ol>5. Preparación para la clasificación de células T-ALL de pez cebra teñidas con CT-FR
<ol><li>Prepare los siguientes controles para la clasificación de células: Sin control de color (sin teñir, no transgénico, suspensión unicelular, de un pez cebra de tipo salvaje), células T-ALL marcadas con GFP y células de pez cebra CT-FR WT recién teñidas (para establecer un umbral máximo de señal de rojo lejano).</li>
	<li>Preparación de controles sin teñir y CT-FR<ol><li>Recoja células de peces de tipo silvestre (WT) mediante la eutanasia de un pez cebra CG1 no trasplantado agregando 1 mL de anestésico de 4 mg/mL en una placa de Petri que contenga 9 mL de agua del sistema de peces.</li>
		<li>Mueva el pez cebra a una nueva placa de Petri y agregue 1 ml de medio de pescado para que sirva como amortiguador para las células. Use una nueva hoja de afeitar para decapitar primero y luego macerar al pez cebra con la misma hoja de afeitar; pipetear hacia arriba y hacia abajo para desalojar los grandes grupos de células.</li>
		<li>Pase las células a través de un filtro celular de 40 μm a un tubo cónico de 50 mL para disociarlas en una suspensión de una sola célula. Mantenga las células en hielo.</li>
		<li>Para el control CT-FR, transfiera 250.000 células WT a un tubo de microcentrífuga y granule las células por centrifugación a 2.500 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Retire el medio de pescado y agregue 500 μL de 0,9x PBS+ 1% FBS.</li>
		<li>Añadir 0,5 μL de la solución madre de colorante CT-FR de 1 mM para obtener una concentración final de 1 μM. Pipetear suavemente con 1.000 μL de pipeta para mezclar. Incubar a 37 °C durante 20 min, protegido de la luz.</li>
		<li>Retire el líquido y lave las células con 500 μL de medio de pescado para eliminar el exceso de colorante.</li>
		<li>Vuelva a granular las células por centrifugación, retire el líquido y vuelva a suspender las células en 500 μL de 0,9x PBS+ 1% FBS y páselas a través de una tapa de filtro de 35 μm a un tubo FACS. Mantener en hielo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la placa del donante NOTA: La placa donante es una placa inferior en V de 96 pocillos en la que se clasificarán las células T-ALL teñidas con CT-FR del pez cebra trasplantado. Cada pocillo de la placa contiene 5.000 células WT CG1 sin teñir en 50 μL de medio de pescado para servir como portador y ayudar a pelar las células clasificadas en los pasos siguientes.<ol><li>Cuente 500.000 células WT CG1 y transfiéralas a un tubo cónico de 15 ml.</li>
		<li>Diluya este caldo celular a 100 células/μL añadiendo 5 mL de medio de pescado.</li>
		<li>Dispense 50 μL de la suspensión celular en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Mezcle el tubo de suspensión celular después de cada fila para mantener la homogeneidad de la suspensión celular. Mantenga la placa a 4 °C hasta la clasificación.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de las muestras de peces trasplantados<ol><li>Seleccione peces trasplantados con una carga de T-ALL del 30-40%. Recoja peces trasplantados con células teñidas con CT-FR y células tumorales GFP sin teñir.</li>
		<li>Recolectar células como se describe en la Sección 2. NOTA: Dado que se espera que las células retenedoras de colorante estén presentes en una abundancia baja, prepárese para clasificar una gran cantidad de células de la muestra de GFP CT-FR.</li>
		<li>Diluir en la concentración adecuada para clasificar ~ 3-5 × 106 celdas/mL en 0.9x PBS + 1% FBS y pasar a través de una tapa de filtro de 35 μm a un tubo FACS. Agregue DAPI (1 mg/mL) en dilución 1:1,000 como un colorante vital para excluir las células muertas. Mantener en hielo.</li>
		<li>En el caso de las células tumorales GFP no teñidas, transfiera 250.000 células a un tubo de microcentrífuga y granule a 2.500 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Retire el medio de pescado, agregue 500 μL de PBS y pase a través de una tapa de filtro de 35 μm a un tubo FACS. Mantener en hielo.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Clasificación
NOTA: Mantenga todos los tubos y la placa donante en hielo todo el tiempo, excepto cuando se use para clasificar.
<ol><li>Para ordenar los parámetros y las puertas, comience por aplicar la compuerta de dispersión frontal y lateral para identificar las celdas de interés en función de su tamaño y eliminar los desechos de celda. A continuación, utilice la altura de dispersión hacia adelante frente al área de dispersión hacia adelante para excluir las celdas duplicadas y mantener solo los singletes. Por último, utilice los controles sin color y de un solo color para dibujar los cuadrantes e identificar las poblaciones de células positivas para GFP y CT-FR positivas. NOTA: Se espera que el control de CT-FR sea mucho más brillante que las muestras para clasificar, ya que la tinción para el control se realizó fresca sin divisiones celulares; Se espera que las células de las muestras de GFP de CT-FR aparezcan en el extremo inferior de la puerta positiva de CT-FR.</li>
	<li>Clasifique el número de células que se trasplantarán en cada pez en un pocillo de la placa donante. NOTA: Para este experimento, utilizamos un ensayo de dilución limitante para estimar la frecuencia de células madre de leucemia en CT-FR High y CT-FR Low. Este ensayo utilizó una dosis de 25 células, trasplantadas a 3 animales, y una dosis de 10 células, trasplantadas a 10 animales. Un ensayo de dilución limitante típico utilizando la LLA-ALL derivada del pez cebra rag2:Myc involucraría un grupo con un mayor número de células (500 o 1.000), ya que la frecuencia de LSC en este modelo se estima en 1 LSC en cientos de células. Sin embargo, en este ensayo, estamos utilizando uno de los clones de T-ALL previamente descritos por Blackburn et al.15. La frecuencia de LSC en la muestra utilizada aquí es ~1 LSC en decenas de células; Predecimos que la leucemia se detectará en animales trasplantados en el grupo de 25 células. Al optimizar este ensayo para su modelo de enfermedad, se debe tener cuidado al seleccionar el grupo de número de células más alto para garantizar el injerto del tumor.</li>
	<li>Después de clasificar, mantenga la placa en hielo hasta que esté lista para el trasplante. NOTA: Los procedimientos de clasificación pueden ser estresantes y afectar la viabilidad de la célula. Antes de ejecutar el experimento de dilución limitante real, se realizó un experimento piloto de clasificación. Se trasplantaron las células seleccionadas y se monitoreó el desarrollo de la leucemia para determinar si la clasificación era perjudicial para la viabilidad celular. Alternativamente, la viabilidad celular se puede evaluar tiñendo las células clasificadas con azul de tripán y examinándolas bajo el microscopio antes del trasplante.</li>
</ol>7. Trasplante de células clasificadas en la dilución límite y seguimiento de la aparición del tumor
<ol><li>Gire la placa con una centrífuga de sobremesa grande a 2.500 × g a 4 °C.</li>
	<li>Retire con cuidado 45 μL del sobrenadante de cada pocillo, dejando 5 μL de líquido y asegurándose de evitar tocar el pellet de celda en el fondo del pocillo.</li>
	<li>Vuelva a suspender las células con una pipeta de 20 μL. Vuelva a suspender 2-3 pocillos con la pipeta y luego, con la jeringa de microlitro Hamilton, inyecte las suspensiones celulares de cada pocillo en el número deseado de pez cebra CG1 mediante trasplante IP. Luego, vuelva a suspender las células en el siguiente grupo de pocillos para evitar el reasentamiento de las células.</li>
	<li>Examinar el pez cebra mediante microscopía de fluorescencia bajo sedación una vez a la semana para detectar el desarrollo de LLA-T durante al menos 6 semanas.</li>
</ol>8. Determinación de la frecuencia de células madre leucémicas
<ol><li>Registre el número de animales positivos por dosis de célula y grupo de tratamiento a las 6 semanas después del trasplante, considerando que los animales con cualquier cantidad de señal de GFP son positivos. Se considera que los animales tienen una carga significativa de leucemia cuando la señal GFP ocupa el &gt;50% del cuerpo.</li>
	<li>Utilice el software estadístico ELDA (Extreme Limiting Dilution Analysis) (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)19 basado en la web para calcular la frecuencia de LSC dentro de cada población celular. NOTA: En la Figura 1 se proporciona una ilustración esquemática del flujo de trabajo.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67059/67059fig01.jpg"> Figura 1: Flujo de trabajo para el uso de la tinción de seguimiento celular para aislar células inactivas en el modelo T-ALL de pez cebra. Ilustración esquemática de la tinción de células T-ALL de pez cebra con la tinción de proliferación celular, la propagación en un pez cebra CG1 (panel superior) y la clasificación de las células en función de la retención de la tinción de proliferación celular (panel central). Las células recolectadas se utilizaron para un ensayo de dilución limitante para determinar la frecuencia de LSC (panel inferior). Abreviaturas: LLA-T = leucemia linfoblástica aguda de células T; LSC = células madre leucémicas; CT-FR = CellTrace rojo lejano; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PE = ficoeritrina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67059/67059fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Estimación de la frecuencia de LSC en la LLA-T del pez cebra mediante la clasificación de colorantes de proliferación celular

<ol><li>Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
<li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie2%2Fangiopoietin-1+signaling+regulates+hematopoietic+stem+cell+quiescence+in+the+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche.</a> Cell. 118 (2), 149-161 (2004).</li>
<li>Li, L., Bhatia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Stem cell quiescence.</a> Clin. Cancer Res. 17 (15), 4936-4941 (2011).</li>
<li>Kreso, A., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+cancer+stem+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolution of the cancer stem cell model.</a> Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).</li>
<li>Chen, W., Dong, J., Haiech, J., Kilhoffer, M. -C., Zeniou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+quiescence+and+plasticity+as+major+challenges+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell quiescence and plasticity as major challenges in cancer therapy.</a> Stem Cells Int. 2016, 1740936(2016).</li>
<li>Kleffel, S., Schatton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+and+cancer+stem+cells%3A+Two+sides+of+the+same+coin%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy and cancer stem cells: Two sides of the same coin.</a> Adv Exp Med Biol. 734, 145-179 (2013).</li>
<li>Tuy, K., Rickenbacker, L., Hjelmeland, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+produced+by+altered+tumor+metabolism+impacts+cancer+stem+cell+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species produced by altered tumor metabolism impacts cancer stem cell maintenance.</a> Redox Biol. 44, 101953(2021).</li>
<li>Zhou, B. -B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-initiating+cells%3A+Challenges+and+opportunities+for+anticancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Tumour-initiating cells: Challenges and opportunities for anticancer drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (10), 806-823 (2009).</li>
<li>Lyons, A. B., Blake, S. J., Doherty, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+cell+division+by+dilution+of+cfse+and+related+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of cell division by dilution of cfse and related dyes.</a> Curr Protoc Cytom. 64 (1), 11-12 (2013).</li>
<li>Lyons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysing+cell+division+in+vivo+and+in+vitro+using+flow+cytometric+measurement+of+cfse+dye+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of cfse dye dilution.</a> J Immunol Methods. 243 (1-2), 147-154 (2000).</li>
<li>Azari, H., Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+carboxy+fluorescein+succinimidyl+ester+%28cfse%29+to+identify+quiescent+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse) to identify quiescent glioblastoma stem-like cells.</a> Methods Mol Biol. 1686, 59-67 (2018).</li>
<li>Deleyrolle, L. P., Rohaus, M. R., Fortin, J. M., Reynolds, B. A., Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+isolation+of+slow-dividing+cells+in+human+glioblastoma+using+carboxy+fluorescein+succinimidyl+ester+%28cfse%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification and isolation of slow-dividing cells in human glioblastoma using carboxy fluorescein succinimidyl ester (cfse).</a> J Vis Exp. (62), e3918(2012).</li>
<li>Ebinger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+rare%2C+dormant%2C+and+therapy-resistant+cells+in+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of rare, dormant, and therapy-resistant cells in acute lymphoblastic leukemia.</a> Cancer Cell. 30 (6), 849-862 (2016).</li>
<li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myc-induced+t+cell+leukemia+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myc-induced t cell leukemia in transgenic zebrafish.</a> Science. 299 (5608), 887-890 (2003).</li>
<li>Blackburn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+enhances+leukemia-propagating+cell+frequency+in+t+cell+acute+lymphoblastic+leukemia+through+akt%2Fmtorc1+pathway+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in t cell acute lymphoblastic leukemia through akt/mtorc1 pathway activation.</a> Cancer Cell. 25 (3), 366-378 (2014).</li>
<li>Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cancer+avatars%3A+A+translational+platform+for+analyzing+tumor+heterogeneity+and+predicting+patient+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes.</a> Int J Mol Sci. 24 (3), 2288(2023).</li>
<li>Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+frequency+of+tumor-propagating+cells+using+limiting+dilution+cell+transplantation+in+syngeneic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish.</a> J Vis Exp. (53), e2790(2011).</li>
<li>Borga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+b+and+t+cell+acute+lymphoblastic+leukemias+in+zebrafish+driven+by+transgenic+myc%3A+Implications+for+oncogenesis+and+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Simultaneous b and t cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic myc: Implications for oncogenesis and lymphopoiesis.</a> Leukemia. 33 (2), 333-347 (2019).</li>
<li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elda%3A+Extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Elda: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).</li>
<li>Bhojwani, D., Pui, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapsed+childhood+acute+lymphoblastic+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Relapsed childhood acute lymphoblastic leukaemia.</a> Lancet Oncol. 14 (6), e205-e217 (2013).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat Rev Drug Discov. 4 (1), 35-44 (2005).</li>
<li>Al-Hamaly, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+drug+screening+identifies+erlotinib+as+an+inhibitor+of+wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+and+self-renewal+in+t-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Zebrafish drug screening identifies erlotinib as an inhibitor of wnt/β-catenin signaling and self-renewal in t-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Biomed Pharmacother. 170, 116013(2024).</li>
<li>Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+engrafted+human+cancer+and+therapy+responses+in+immunodeficient+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish.</a> Cell. 177 (7), 1903-1914 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Microjeringa de 26 G/2" Hamilton</td><td></td><td>87930</td><td>NA</td></tr><tr><td>35 y micro; m tapón de filtro FACS tubos Falcon</td><td></td><td>352235</td><td>NA</td></tr><tr><td>40 &micro; M filtro de células</td><td>CELLTREAT</td><td>229482</td><td>NA</td></tr><tr><td>Placa de PCR con faldón de 96 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0800</td><td>NA</td></tr><tr><td>Clasificador de células</td><td>Sony Biotechnology</td><td>SY3200</td><td>NA</td></tr><tr><td>CellTrace Far</td><td>Red Thermo Fisher Scientific</td><td>C34564</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tubos cónicos</td><td>VWR</td><td>10026-078</td><td>NA</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62248</td><td>NA</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td><td>NA</td></tr><tr><td>Dulbecco'sSolución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Caisson Labs</td><td>22110001</td><td>NA</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de epifluorescencia</td><td>Nikon</td><td>SMZ25</td><td>NA</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>NA Agua del sistema de peces</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>0,03-0,05% de salinidad, pH 6,5-8, tamponado con bicarbonato de sodio</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>C2171</td><td>NA</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Pentaire</td><td>TRS-1</td><td>mesilato de tricaína, un anestésico</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Corning</td><td>07-202-011</td><td>NA</td></tr><tr><td>Hojas de afeitar American</td><td>Line</td><td>66-0089</td><td>NA</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher Científico</td><td>T10282</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

identificación de células quiescentes en un modelo de leucemia linfoblástica aguda de células t de pez cebra mediante tinción de proliferación celular 

Identification of Quiescent Cells in a Zebrafish T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia Model Using Cell Proliferation Staining

Seguimos el protocolo descrito anteriormente para clasificar las células que han retenido el colorante de proliferación celular, CT-FR, y las utilizamos para un ensayo de dilución limitante (LDA) para estimar la frecuencia de LSC en las poblaciones de CT-FR High y CT-FR Low. Para establecer la compuerta para el experimento de citometría de flujo, utilizamos un control sin fluoróforo (sin color) además de controles de un solo color (Figura 2A). Esos cuadrantes se utilizaron para identificar las poblaciones positivas y negativas de FITC y PE para la configuración de las puertas de clasificación. El control positivo de un solo color CT-FR se preparó el mismo día de la clasificación tiñendo células WT de un pez cebra no trasplantado y, por lo tanto, se espera que la intensidad de la señal sea mucho mayor que la señal de las células propagadas en la muestra.
En la LLA-GPF T-ALL teñida con CT-FR (Figura 2B), las células que aparecían en el cuadrante superior derecho con una frecuencia baja del 0,13% se consideraron CT-FR High, y se colocó una puerta de clasificación etiquetada como "CT-FR high" en este cuadrante. Se creó otra puerta en el cuadrante inferior derecho para recolectar células leucémicas que son CT-FR Low. Dado que las células altas de CT-FR existían en baja abundancia en la muestra tumoral, se seleccionó un gran número de células (~2,5 × 106) para recoger el número necesario de células para el experimento de dilución limitante.
Después de trasplantar el pez cebra CG1 con las células clasificadas para el LDA, el pez cebra fue monitoreado durante 6 semanas. Las células de la CT-FR High tuvieron una frecuencia de LSC cuatro veces mayor en comparación con la población de células de CT-FR Low (p = 0,0134) (Figura 3A). En la Figura 3B se muestran imágenes representativas de los animales a los 28 días post-trasplante. En el grupo CT-FR High, dosis de 10 células, 8 de 9 animales (89%) de los animales desarrollaron leucemia, en comparación con 2 de cada 10 (20%) en el grupo CT-FR Low (Figura 3A). Los animales del grupo CT-FR High tuvieron una latencia significativamente más corta frente a la leucemia (p = 0,0014) (Figura 3C). Finalmente, los animales del CT-FR High tuvieron una supervivencia global significativamente menor (p = 0,0408) (Figura 3D); en la semana 6, el 70% de los animales CT-FR Low estaban vivos en comparación con solo el 10% de los animales CT-FR High. Estos resultados demuestran el enriquecimiento de LSCs autorrenovables dentro de la población de células inactivas de división lenta en el modelo T-ALL de pez cebra impulsado por rag2:Myc y la utilización de la tinción de proliferación celular para aislar esta población.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67059/67059fig02.jpg"> Figura 2: Clasificación de células mediante citometría de flujo. (A) Se utilizaron gráficos FACS de células WT recién teñidas con CT-FR y células T-ALL marcadas con GFP para crear las puertas para clasificar las teñidas con CT-FR. Células GFP+ T-ALL. (B) Ejemplo representativo de las células TF-ALL GFP+ teñidas con CT-FR propagadas. Las células del cuadrante superior derecho se consideraron CT-FR High y las células del cuadrante inferior derecho se consideraron CT-FR Low. Abreviaturas: LLA-T = leucemia linfoblástica aguda de células T; CT-FR = CellTrace rojo lejano; GFP = proteína verde fluorescente; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PE = ficoeritrina; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia; WT = tipo salvaje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67059/67059fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67059/67059fig03.jpg"> Figura 3: Frecuencia significativamente mayor de LSC en células con alta retención de la mancha de proliferación celular. (A) Datos del ensayo de dilución limitante que indican el número de animales positivos para leucemia después del trasplante con dos dosis crecientes de células (10 y 25 células). Se indica la frecuencia de LSC calculada y el intervalo de confianza del 95% (p = 0,0134). (B) Imágenes representativas de los animales después de 28 días de trasplante; barra de escala = 10 mm. (C) Latencia a leucemia significativa considerada como el tiempo necesario para que el &gt;50% del animal se convierta en GFP positivo, lo que representa una carga significativa de leucemia. (D) Curva de supervivencia del animal trasplantado con 10 células. Abreviaturas: LSC = células madre leucémicas; CT-FR = CellTrace Rojo lejano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67059/67059fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Identificación de células quiescentes en un modelo de leucemia linfoblástica aguda de células T de pez cebra mediante tinción de proliferación celular 

Cellular quiescence is a state of growth arrest or slowed proliferation that is described in normal and cancer stem cells (CSCs). Quiescence may protect ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Limitación de la dilución ensayos de trasplante de células se utilizan para determinar la frecuencia de los tumores se propagan las células. Este protocolo describe un método para generar pez cebra singénico que desarrollan leucemia fluorescente marcado y los detalles de cómo aislar y trasplante de estas células de leucemia en la limitación de dilución en la cavidad peritoneal de los adultos de pez cebra.

Cuantificar la frecuencia de tumores se propagan las células usando trasplante de células limitación de dilución en el pez cebra singénico

Este protocolo describe la técnica de aislar células tumorales de leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) marcadas con fluorescencia de un pez cebra adulto y cuantificarlas utilizando un colorante azul de tripano.

Aislamiento de células T-ALL marcadas con fluorescencia: un método para aislar células T-ALL de pez cebra adulto

El siguiente protocolo describe un método para aislar la población lateral de células tumorales de leucemia linfoblástica aguda (LLA-T), que consiste en células madre, de un pez cebra adulto. La población lateral carece de marcadores celulares prominentes y, por lo tanto, utilizamos el ensayo de eflujo de colorante Hoechst 33342 para aislarlos.

Ensayo de población lateral: un método para aislar la población lateral de células tumorales del pez cebra

A continuación, describimos una técnica para aislar las células de población lateral de un modelo de pez cebra de células T myc inducida por la leucemia linfoblástica aguda (LLA-T). Este ensayo población lado es muy sensible y se describe, por pez cebra T-ALL, pero puede ser aplicable a otros tipos de células de pez cebra malignas y no malignas.

Aislamiento de la población lateral en la leucemia linfoblástica aguda inducida por linfocitos T de Myc en peces cebra

Pez cebra transgénico lck:eGFP expresan GFP altamente en los linfocitos T y se han utilizado para estudiar el desarrollo de las células T y leucemia linfoblástica aguda. Esta línea puede utilizarse para células de estudio B, que expresan lck en niveles inferiores. Este protocolo describe la purificación de las células B malignas y no malignas del pez cebra lck:eGFP .

Aislar maligno y no maligno de células B lck:eGFP pez cebra

Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso, con consejos para generar xenoinjertos y directrices para el análisis del comportamiento tumoral, la inmunofluorescencia de montaje completo y la cuantificación de imágenes confocales.

Generación de Xenoinjertos Larvales de Pez Cebra y Análisis de Comportamiento Tumoral

Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para generar y solucionar problemas de xenoinjertos de leucemia linfoblástica aguda (LLA) humana a partir de líneas celulares y material fresco del paciente en embriones de pez cebra inmunosuprimidos transitoriamente, junto con pautas para la evaluación de la respuesta a los medicamentos mediante citometría de flujo. La tubería experimental también se puede adaptar para tumores sólidos.

Predicción rápida de la respuesta a fármacos in vivo mediante injertos de células de leucemia en embriones de pez cebra

Detección de enfermedad residual mínima o medible (Milirutherford) es un biomarcador pronóstico importante para refinar la evaluación de riesgo y predicción de la recaída en la leucemia mieloide aguda (AML). Estas directrices amplias y recomendaciones con las mejores prácticas de identificación consistente y precisa y detección de MRD, puede ayudar en la toma de decisiones eficaces de tratamiento de AML.

General protocolo muestra y médula de proceso para medir enfermedad Residual medible y células leucémicas en la leucemia mieloide aguda

Este protocolo describe el uso de elutriación centrífuga para separar las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula.

Preparación de las células de la leucemia linfoblástica aguda primaria en diferentes fases de la célula por elutriación centrífugo

Contorneamos un protocolo para detectar la expresión simultánea de marcadores de células madre de leucemia en las células de la leucemia mieloide aguda primaria por citometría de flujo. Mostramos cómo cuantificar tres poblaciones progenitoras y una supuesta población de LSC con el aumento del grado de maduración. Se confirmó la presencia de estas poblaciones en paciente correspondientes-derivado-xenoinjertos.

Citometría de flujo para estimar las células madre de leucemia la leucemia mieloide aguda primaria y el paciente-derivado-xenoinjertos, diagnóstico y seguimiento hasta

Aprende a identificar células leucémicas quiescentes mediante tinción de proliferación celular en un modelo de leucemia linfoblástica aguda de células T de pez cebra Danio rerio. Este método permite aislar células dormantes para estudios de cribado de fármacos y análisis transcriptómicos.

Identificación de células quiescentes en un modelo de leucemia linfoblástica aguda de células T de pez cebra mediante tinción de proliferación celular (Video) | JoVE Journal

Identificación de células quiescentes en un modelo de leucemia linfoblástica aguda de células T de pez cebra mediante tinción de proliferación celular

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