Name: Mejorar los resultados de los estudiantes con una experiencia de investigación de pregrado basada en cursos de clonación molecular adaptable (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprende clonación molecular con ensamblaje Gibson en un formato CURE para biología molecular. Los estudiantes mejoran su comprensión y confianza en técnicas de clonación mediante experiencias prácticas de investigación.

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<meta charset="utf8"></head><body>Implementación de Gibson Assembly para mejorar la educación y las habilidades en biología molecular

<ol><li>Black, M. W., Tuan, A., Jonasson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+yeast+actin+cDNA+leads+to+an+investigative+approach+for+the+molecular+biology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Cloning yeast actin cDNA leads to an investigative approach for the molecular biology laboratory.</a> Biochem Mol Biol Educ. 36 (3), 217-224 (2008).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bell, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUREs+in+biochemistry%E2%80%94where+we+are+and+where+we+should+go%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUREs in biochemistry—where we are and where we should go.</a> Biochem Mol Biol Educ. 45 (1), 7-12 (2017).</li>
<li>Auchincloss, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+course-based+undergraduate+research+experiences%3A+A+meeting+report%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Assessment of course-based undergraduate research experiences: A meeting report.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 29-40 (2014).</li>
<li>Buchanan, A. J., Fisher, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+implementation+of+science+practices+in+Course-based+Undergraduate+Research+Experiences+%28CUREs%29%3A+A+systematic+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Current status and implementation of science practices in Course-based Undergraduate Research Experiences (CUREs): A systematic literature review.</a> CBE Life Sci Educ. 21 (4), ar83 (2022).</li>
<li>Verity, N., Ulm, B., Pham, K., Evangelista, B., Borgon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstrating+core+molecular+biology+principles+using+GST-GFP+in+a+semester-long+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Demonstrating core molecular biology principles using GST-GFP in a semester-long laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 50 (1), 55-64 (2022).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUR%28E%29ating+a+new+approach+to+study+fungal+effectors+and+enhance+undergraduate+education+through+authentic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">CUR(E)ating a new approach to study fungal effectors and enhance undergraduate education through authentic research.</a> Biochem Mol Biol Educ. 52 (1), 6-14 (2024).</li>
<li>Roecklein-Canfield, J. A., Lopilato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+and+purifying+proteins+to+teach+molecular+biology+and+advanced+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Tagging and purifying proteins to teach molecular biology and advanced biochemistry.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (6), 373-377 (2004).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+glyphosate+oxidase+and+a+chemiluminescence+system+for+glyphosate+detection%3A+A+comprehensive+practical+laboratory+experiment+on+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of glyphosate oxidase and a chemiluminescence system for glyphosate detection: A comprehensive practical laboratory experiment on biotechnology.</a> Biochem Mol Biol Educ. 51 (3), 302-311 (2023).</li>
<li>Wang, J. T. H., Schembri, M. A., Ramakrishna, M., Sagulenko, E., Fuerst, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immersing+undergraduate+students+in+the+research+experience%3A+A+practical+laboratory+module+on+molecular+cloning+of+microbial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Immersing undergraduate students in the research experience: A practical laboratory module on molecular cloning of microbial genes.</a> Biochem Mol Biol Educ. 40 (1), 37-45 (2012).</li>
<li>Dean, D. M., Wilder, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%E2%80%9CFrankenplasmid%E2%80%9D+lab%3A+An+investigative+exercise+for+teaching+recombinant+DNA+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">The “Frankenplasmid” lab: An investigative exercise for teaching recombinant DNA methods.</a> Biochem Mol Biol Educ. 39 (5), 376-383 (2011).</li>
<li>Bornhorst, J. A., Deibel, M. A., Mulnix, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+by+PCR+and+subcloning+into+a+GFP-fusion+plasmid+expression+vector+as+a+molecular+biology+laboratory+course%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Gene amplification by PCR and subcloning into a GFP-fusion plasmid expression vector as a molecular biology laboratory course.</a> Biochem Mol Biol Educ. 32 (3), 173-182 (2004).</li>
<li>Roberts, L. A., Shell, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+research+program-linked%2C+course-based+undergraduate+research+experience+that+allows+undergraduates+to+participate+in+current+research+on+mycobacterial+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A research program-linked, course-based undergraduate research experience that allows undergraduates to participate in current research on mycobacterial gene regulation.</a> Front Microbiol. 13, 1025250(2023).</li>
<li>Jose, P. A., Maharshi, A., Jha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actinobacteria+in+natural+products+research%3A+Progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Actinobacteria in natural products research: Progress and prospects.</a> Microbiol Res. 246, 126708(2021).</li>
<li>Banskota, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLN-05220%2C+TLN-05223%2C+new+Echinosporamicin-type+antibiotics%2C+and+proposed+revision+of+the+structure+of+bravomicins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antibiot%22%5BJournal%5D)">TLN-05220, TLN-05223, new Echinosporamicin-type antibiotics, and proposed revision of the structure of bravomicins.</a> J Antibiot. 62 (10), 565-570 (2009).</li>
<li>Schorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+the+biosynthesis+of+the+pharmaceutically+important+class+of+epoxyketone+proteasome+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for the biosynthesis of the pharmaceutically important class of epoxyketone proteasome inhibitors.</a> ACS Chem Biol. 9 (1), 301-309 (2014).</li>
<li>Smith, H. G., Beech, M. J., Lewandowski, J. R., Challis, G. L., Jenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+domain-mediated+subunit+interactions+in+natural+product+megasynth%28et%29ases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ind+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Docking domain-mediated subunit interactions in natural product megasynth(et)ases.</a> J Ind Microbiol Biotechnol. 48 (3-4), kuab018(2021).</li>
<li>Williams, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+code+kit%3A+An+open-source+cell-free+platform+for+biochemical+and+biotechnology+education%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The genetic code kit: An open-source cell-free platform for biochemical and biotechnology education.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 941(2020).</li>
<li>Bloodhart, B., Balgopal, M. M., Casper, A. M. A., Sample McMeeking, L. B., Fischer, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outperforming+yet+undervalued%3A+Undergraduate+women+in+STEM%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Outperforming yet undervalued: Undergraduate women in STEM.</a> PLoS One. 15 (6), e0234685(2020).</li>
<li>Farrar, V. S., Aguayo, B. -Y. C., Caporale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gendered+performance+gaps+in+an+upper-division+biology+course%3A+Academic%2C+demographic%2C+environmental%2C+and+affective+factors%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Gendered performance gaps in an upper-division biology course: Academic, demographic, environmental, and affective factors.</a> CBE Life Sci Educ. 22 (4), ar55(2023).</li>
<li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%2B%3A+Architecture+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">BLAST+: Architecture and applications.</a> BMC Bioinf. 10 (1), 421(2009).</li>
<li>Optimization Tips for NEBuilder® HiFi DNA Assembly and NEB® Gibson Assembly. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly">https://www.neb.com/en-us/tools-and-resources/usage-guidelines/optimization-tips-for-nebuilder-hifi-dna-assembly-and-neb-gibson-assembly</a> (2024).</li>
<li>Instruction Manual: Gibson Assembly® Master Mix / Gibson Assembly® Cloning Kit. , New England BioLabs Inc. 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e">https://www.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale2611.pdf?rev=9db62577a41b4cfda071e21864a6763e</a> (2021).</li>
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La formación de los estudiantes universitarios en conceptos fundamentales de biología molecular y técnicas de laboratorio es crucial para su desarrollo científico y profesional, ya que estas metodologías son comunes en diversos entornos de investigación, incluidos el mundo académico y la industria. Como tal, los estudiantes de las carreras de biología (concentración de biología molecular y celular) y bioquímica en la Universidad Estatal Politécnica de California, San Luis Obispo (Cal Poly) deben tomar un curso de laboratorio de biología molecular de la división superior para aprender y aplicar estos temas (CHEM / BIO 475). Se ha desarrollado previamente un plan de estudios básico para este curso en el que los estudiantes realizan la clonación basada en topoisomerasa (TOPO) para ensamblar un plásmido que contiene actina que se prepara a partir de una plantilla de ADN complementario (ADNc)de levadura 1. Los estudiantes diseñan experimentos basados en preguntas que imitan hipótesis de investigación auténticas, aumentando su familiaridad con las prácticas de laboratorio y el aprendizaje basado en la indagación. El avance continuo en el campo de la biología molecular requiere que los planes de estudio correspondientes se adapten para preparar a los estudiantes con competencias modernas para la fuerza laboral. En particular, el uso de Gibson Assembly se ha vuelto más predominante en la comunidad científica; Si bien el método se estableció originalmente para sintetizar cromosomas artificiales2, más de 5,000 publicaciones en el momento de este informe han hecho referencia al trabajo original de Gibson et al. Gibson Assembly es único en comparación con las metodologías de clonación tradicionales: es altamente personalizable y puede ligar fácilmente múltiples fragmentos de ADN lineal sin necesidad de sitios de restricción para producir las uniones. Por lo tanto, vimos la oportunidad de renovar el plan de estudios de CHEM/BIO 475 para incorporar técnicas modernas de clonación molecular y mejorar el modelo de curso basado en la investigación.
Se ha establecido que las experiencias de investigación de los estudiantes contribuyen a una mayor comprensión conceptual, desarrollo de habilidades y persistencia en ciencias3, sin embargo, no todos los estudiantes de pregrado tienen la oportunidad de participar directamente en un laboratorio de investigación. Para abordar el desafío de la capacidad limitada de los estudiantes en los laboratorios de investigación, se han desarrollado y empleado experiencias de investigación de pregrado (CURE) basadas en cursos para aumentar la accesibilidad a la ciencia a través de la investigación auténtica en el aula. Si bien las CURE varían en su implementación, se han establecido prácticas comunes que abordan los cinco principios de la investigación científica. En un CURE bien diseñado, los estudiantes 1) utilizarán prácticas científicas, 2) colaborarán en un proyecto de investigación, 3) intentarán hacer nuevos descubrimientos, 4) contribuirán al trabajo relevante fuera del aula, y 5) reevaluarán y revisarán hipótesis y métodos en caso de fracaso experimental4. Al igual que las experiencias tradicionales de investigación de los estudiantes en un laboratorio, se ha demostrado que los CURE fortalecen la confianza de los estudiantes en la ciencia, las habilidades científicas, la propiedad de proyectos y la persistencia en ciencia, tecnología, ingeniería y matemáticas (STEM)5. Si bien las curas que involucran clonación molecular han sido reportadas previamente 6,7,8,9,10,11,12,13, no tenemos conocimiento de ninguna que enfatice la adaptabilidad de Gibson Assembly para hacer una biblioteca de plásmidos de investigación auténticos.
Aquí, informamos de una expansión del actual plan de estudios CHEM/BIO 475 basado en la investigación en la Universidad Estatal Politécnica de California, San Luis Obispo, con dos mejoras importantes: la experiencia práctica con el ensamblaje de Gibson y la participación de los estudiantes en un CURE, que ha proporcionado construcciones plasmídicas originales para proyectos de investigación financiados por la Fundación Nacional de Ciencias (NSF-1708919 y NSF-2300890). A lo largo de tres implementaciones de este plan de estudios, los estudiantes han contribuido a dos proyectos de investigación distintos centrados en la biosíntesis de productos naturales de moléculas bioactivas producidas por Actinomycetota. Los productos naturales a menudo contienen farmacóforos con actividades antibióticas, antifúngicas y/o anticancerígenas, lo que da a estas pequeñas moléculas importancia en los esfuerzos de descubrimiento de fármacos y potencial de relevancia clínica14. Esta investigación requiere la creación de bibliotecas de plásmidos que permitan investigar tanto la función como el potencial de ingeniería de las enzimas biosintéticas bacterianas. En este CURE, los estudiantes diseñaron y realizaron experimentos de ensamblaje de Gibson para clonar las bibliotecas de plásmidos únicas pertinentes a estos proyectos de investigación (Figura 1). Además, el formato y diseño del módulo es distintivo porque es fácilmente adaptable para generar cualquier plásmido de interés para otros proyectos de investigación.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Descripción general del papel de Gibson Assembly en nuestro laboratorio de investigación. Actinomycetota produce productos naturales de moléculas pequeñas con bioactividades clínicamente relevantes utilizando grupos de genes que codifican enzimas biosintéticas. En nuestra investigación, los plásmidos que contienen un gen biosintético se ensamblan a través de Gibson Assembly para investigaciones posteriores de la función de la enzima codificada. Iconos de la ciencia de Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Descripción general del laboratorio
El Laboratorio de Biología Molecular es un curso de división superior requerido para los estudiantes de bioquímica y biología con una concentración en biología molecular y celular. Otros estudiantes que cumplan con los requisitos previos son bienvenidos a tomar el curso como una materia optativa de la división superior. El curso está co-listado entre el Departamento de Química y Bioquímica y el Departamento de Biología de Cal Poly. Los profesores de ambos departamentos se turnan para impartir el curso cada trimestre (dos trimestres de Biología, un trimestre de Química y Bioquímica).
La clase se reúne en el laboratorio dos veces por semana durante períodos de 170 minutos y una vez a la semana para una conferencia de 50 minutos. Las secciones de laboratorio contienen un máximo de 16 estudiantes y se ofrecen 2-3 secciones de laboratorio cada trimestre. El curso tiene una duración de 10 semanas y el examen final se administra durante la última reunión de la semana 10. El tiempo de la conferencia se dedica a discutir la teoría detrás de muchas de las técnicas experimentales realizadas en el laboratorio, así como temas actuales en biología molecular que no se cubren en el laboratorio. El plan de estudios básico del laboratorio abarca el proceso de clonación del gen de actina de la levadura1, que dura aproximadamente 7 semanas (13-14 reuniones de laboratorio). Las técnicas incluyen el micropipeteo, el aislamiento de ARN de levadura, la amplificación de un gen de levadura mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), la clonación de TOPO, el cribado azul-blanco, el aislamiento de plásmidos y la verificación del inserto mediante digestión de restricción y PCR, análisis in silico de clones y análisis de secuencias de ADN. El plan de estudios de las últimas 3 semanas del curso queda a discreción del instructor, pero implica que los estudiantes completen un "proyecto independiente" con resultados indefinidos.
Descripción general del experimento
Uno de los focos de nuestro grupo de investigación son las rutas biosintéticas en Actinomycetota. Al diseñar el proyecto independiente, imaginamos que los estudiantes crearan plásmidos a través de Gibson Assembly para su uso en nuestros proyectos de investigación que investigan la biosíntesis de productos naturales. Si bien las iteraciones del módulo del curso que se evalúan aquí eran particulares de los plásmidos que permiten la manipulación de vías biosintéticas, el flujo de trabajo de Gibson Assembly es enormemente adaptable para otros proyectos de clonación molecular (Figura 2). El flujo de trabajo se dividió en tres experimentos diferentes (A, B y C) que se completaron durante dos períodos de clase y seis períodos de laboratorio (3 semanas en total) (consulte el Archivo Suplementario 1 y el Archivo Suplementario 2). Los experimentos fueron precedidos por hojas de trabajo para apoyar la preparación de los estudiantes y evaluar su comprensión (Archivo Suplementario 3, Archivo Suplementario 4 y Archivo Suplementario 5). El flujo de trabajo se presenta en un formato que es flexible a las necesidades e intereses del instructor.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig02v2.jpg"> 
Figura 2: Flujo de trabajo del módulo de ensamblaje de Gibson. El día 1 y el día 4 son períodos de clase en los que los estudiantes completan el análisis de secuencias in silico y el diseño experimental. Los días 2 y 3 y 5 a 8 son reuniones de laboratorio en las que se llevan a cabo los pasos para clonar plásmidos nuevos a través de Gibson Assembly, seguidos de aislamiento y detección. El diagrama de flujo pictórico se agrupa por los tres experimentos que realizan los estudiantes (A, B y C). Se pueden encontrar instrucciones y protocolos más detallados en los Manuales del Instructor y del Estudiante que se proporcionan como Archivo Complementario 1 y Archivo Suplementario 2, respectivamente. Iconos de la ciencia de Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El módulo de proyecto independiente Gibson Assembly se probó por primera vez en el trimestre de primavera de 2019 en CHEM/BIO 475. En 2020 y 2021, el curso se impartió en línea debido a la pandemia de SARS-CoV-2. Cuando se reanudó la enseñanza presencial en la primavera de 2022 y 2023, se invitó a los estudiantes del curso a participar en un estudio que evaluaba los resultados de aprendizaje de un proyecto independiente de Gibson Assembly en el que se clonarían plásmidos originales relevantes para la investigación. En 2019, los estudiantes crearon una biblioteca de plásmidos compuesta por casetes de genes del genoma de Micromonospora echinospora ATCC 15837 que se clonaron en pKC1132 (Figura 3). Esta biblioteca de plásmidos se está utilizando en nuestro laboratorio de investigación para inactivar genes de interés en un grupo de genes biosintéticos putativos para el producto natural TLN-0522015. Para complementar nuestros estudios de inactivación génica, los estudiantes clonaron en 2022 una pequeña biblioteca de genes del grupo de genes TLN-05220 putativo en pUC19 (figura3); nuestro grupo de investigación ha utilizado estos plásmidos para subclonar genes en vectores de expresión, incluido pET28b, para la sobreexpresión y purificación de proteínas. Los estudiantes de la cohorte de 2023 contribuyeron al trabajo en curso en un proyecto de ingeniería biosintética sobre la epoxomicinasintetasa 16. En equipos de 3 a 4 estudiantes, los estudiantes clonaron dominios de ingeniería de péptido sintetasa no ribosómico17 módulos en varios vectores de expresión de proteínas para optimizar la sobreexpresión y purificación de estas enzimas en nuestro laboratorio de investigación (Figura 3). La redundancia se incorporó en el plan de clonación de cada cohorte. Por ejemplo, la cohorte de 2019 contenía 44 estudiantes y se asignaron 15 plásmidos a la clase para su clonación. Por lo tanto, la clonación de cada plásmido se intentó dos o tres veces.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67067/67067fig03v2.jpg"> 
Figura 3: Resumen de plásmidos clonados y estudiantes participantes durante las iteraciones de proyectos independientes de 2019, 2022 y 2023. El proyecto de ensamblaje de Gibson se ha implementado tres veces. En cada oferta, los estudiantes participantes clonaron una biblioteca diferente de plásmidos para utilizarla en proyectos de investigación que exploran las vías biosintéticas. Los proyectos de 2019 y 2022 respaldaron nuestro trabajo en curso sobre el producto natural TLN-0522015 con reacciones de ensamblaje de Gibson de dos fragmentos (un casete de genes o un gen y un vector). El proyecto de 2023 consistió en el intercambio de dominios dentro de los módulos 1 y 2 de una enzima péptido sintetasa no ribosómico (NRPS) que participa en la biosíntesis de epoxomicina16. Los fragmentos sombreados representan dos mutantes diferentes del dominio intercambiado, y los colores sólidos representan dominios que no se intercambiaron. En total, se generaron ocho fragmentos de genes diferentes (cuatro para el módulo 1 y cuatro para el módulo 2) con voladizos compatibles con el ensamblaje de Gibson. Para cada módulo, se ensamblaron dos combinaciones diferentes de tres fragmentos de genes con uno de dos vectores diferentes (pBAD33 y pET28, cuatro fragmentos totales por ensamblaje), para el potencial de generar ocho plásmidos NRPS diseñados. Iconos de la ciencia de Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67067/67067fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Resumen de la evaluación
Al menos 1 semana antes del inicio del proyecto independiente de Gibson Assembly, se invitó a los estudiantes de las cohortes de 2022 y 2023 a participar en una investigación de resultados de aprendizaje, diseñada de manera similar a un estudio realizado en un curso de laboratorio de encuesta de bioquímica en Cal Poly18. Los estudiantes participantes completaron un cuestionario previo de opción múltiple en la reunión de laboratorio antes del inicio del proyecto independiente y un cuestionario posterior de opción múltiple durante la reunión final de laboratorio (es decir, después de haber completado el módulo de ensamblaje de Gibson). Los cuestionarios pre y post constaron de 28 preguntas idénticas con dos preguntas adicionales en el post-cuestionario (30 en total). Se escribieron diez preguntas de contenido para evaluar el conocimiento de los estudiantes sobre las enzimas y los mecanismos involucrados en la clonación molecular (p. ej., reacción en cadena de la polimerasa [PCR], ensamblaje de Gibson, transformación, detección azul-blanco). En las siguientes siete preguntas se pidió a los estudiantes que autoevaluaran su familiaridad con los términos de clonación molecular (p. ej., ADN polimerasa, exonucleasa, ligasa). Las siguientes 10 preguntas permitieron a los estudiantes autoevaluar su capacidad para realizar técnicas de clonación molecular (por ejemplo, análisis de secuencias de ADN, reacciones de digestión de restricción, electroforesis en gel de agarosa). Los estudiantes también informaron si se sentirían cómodos siguiendo una carrera en biología molecular basándose en su conocimiento de las técnicas de clonación molecular. Se incluyeron dos preguntas adicionales en el cuestionario posterior para que los estudiantes autoevaluaran su compromiso con el aprendizaje en el curso y si el curso fue una experiencia de aprendizaje valiosa (Archivo Suplementario 6 y Archivo Suplementario 7). Todos los datos de las respuestas de los estudiantes antes y después del cuestionario de 2022 y 2023 se combinaron para su análisis y están disponibles en la Tabla Complementaria S1.

<table><tbody><tr><td>Trifosfato desoxirribonucleótido (dNTPs, 10&nbsp; mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERR0191</td><td>Componente MasterMix Casero'</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific FERR0861</td><td></td><td>Casemade' Componente MasterMix</td></tr><tr><td>DpnI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>1000 unidades</td></tr><tr><td>Incubadora microbiológica Fisherbrand Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0513</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand Baño de agua Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>S28124</td><td></td></tr><tr><td>GelRed Tinción de gel de ácido nucleico</td><td>Biotium</td><td></td><td>NC9594719 10,000X</td></tr><tr><td>GeneJET Extracción de gel y limpieza de ADN Micro</td><td>Kit Thermo Scientific</td><td>FERK0831</td><td>100 preparaciones</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Escalera de ADN</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERSM0314</td><td>100 aplicaciones</td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP9723-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td>Hecho en casa' Componente MasterMix</td></tr><tr><td>Mastercycler nexus X2 Gradient Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>6337000027</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 16 Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>Micromonospora echinospora bacteria</td><td>Tipo americano Colección</td><td>de cultivos ATCC 15837</td><td></td></tr><tr><td>Horno de microondas</td><td>General Electric&nbsp;</td><td></td><td></td>2440640</tr><tr><td>Grado de Biología Molecular Agarosa</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-100</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Nanodrop One Microvolume Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-400-518</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alfa E. coli competente</td><td>New England Biolabs</td><td>C2987H</td><td>20 x 0.05 mL</td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621S</td><td>10 reacciones</td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 40 Agitador orbital de sobremesa</td><td>New Brunswick</td><td>M1299-0090</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasa</td><td>Bioreactivos Fisher</td><td>BP248450</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>PEG-8000&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-100</td><td>Hecho en casa' Componente MasterMix</td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Hecho en casa' Componente MasterMix</td></tr><tr><td>Balanza portátil</td><td>Ohaus</td><td>SKX123</td><td></td></tr><tr><td>pUC19 vector</td> New <td>England Biolabs</td><td>N3041S</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Alta fidelidad 2x Master Mix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td>100 reacciones</td></tr><tr><td>T5 Exonucleasa</td><td>Epicentro</td><td>T5E4111K</td><td>Hecho en casa' Componente MasterMix</td></tr><tr><td>Taq ADN ligasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208</td><td>Hecho en casa' Componente MasterMix</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific AAA1137918</td><td></td><td>Hecho en casa' Componente MasterMix</td></tr><tr><td>TriTrack DNA Gel Loading Dye (6x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>FERR1161</td><td>5 x 1 mL</td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4019</td><td>100 Preps</td></tr><tr><td>&beta;-Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9007S</td><td>Componente MasterMix casero</td></tr></tbody></table>

mejorar los resultados de los estudiantes con una experiencia de investigación de pregrado basada en cursos de clonación molecular adaptable

Improving Student Outcomes with an Adaptable Molecular Cloning Course-Based Undergraduate Research Experience

Mejorar los resultados de los estudiantes con una experiencia de investigación de pregrado basada en cursos de clonación molecular adaptable

The continuous advancement of molecular biology techniques requires that molecular biology curricula are&#160;regularly refined to effectively prepare ...

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