Name: Ensayo de ligando de proximidad para localizar proteínas en sitios de daño en el ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a detectar interacciones proteicas en sitios de daño del ADN mediante ensayo de ligando de proximidad combinado con tinción Gamma-H2AX en células U2OS. Este protocolo permite caracterizar espacialmente las interacciones proteicas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación de la interacción y localización de proteínas en el daño del ADN

<ol><li>Xiao, W., Samson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+for+endogenous+DNA+alkylation+damage+as+a+source+of+spontaneous+mutation+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 90 (6), 2117-2121 (1993).</li>
<li>Lindahl, T., Barnes, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+endogenous+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Repair of endogenous DNA damage.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 65, 127-134 (2000).</li>
<li>DNA damage, aging, and cancer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22N+Engl+J+Med%22">N Engl J Med</a>. Hoeijmakers Jan, H. J. 361 (15), 1475-1485 (2009).</li>
<li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a000745(2011).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+Making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: Making it safe to play with knives.</a> Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Chatterjee, N., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+damage%2C+repair+and+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EnvironMol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis.</a> EnvironMol Mutagen. 58 (5), 235-263 (2017).</li>
<li>Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX%3A+a+sensitive+molecular+marker+of+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX: a sensitive molecular marker of DNA damage and repair.</a> Leukemia. 24 (4), 679-686 (2010).</li>
<li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Curr Biol. 10 (15), 886-895 (2000).</li>
<li>Nakamura, A. J., Rao, V. A., Pommier, Y., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complexity+of+phosphorylated+H2AX+foci+formation+and+DNA+repair+assembly+at+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">The complexity of phosphorylated H2AX foci formation and DNA repair assembly at DNA double-strand breaks.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 9 (2), 389-397 (2010).</li>
<li>Karchugina, S., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+heterodimerization+of+protein+isoforms+using+an+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of heterodimerization of protein isoforms using an in situ proximity ligation assay.</a> J Vis Exp. (140), (2018).</li>
<li>Tubbs, E., Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondria+interactions+by+in+situ+proximity+ligation+assay+in+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells.</a> J Vis Exp. (118), (2016).</li>
<li>Nguyen, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nek4+regulates+entry+into+replicative+senescence+and+the+response+to+DNA+damage+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Nek4 regulates entry into replicative senescence and the response to DNA damage in human fibroblasts.</a> Mol CellBiol. 32 (19), 3963-3977 (2012).</li>
<li>Basei, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+interaction+partners+for+Nek4.1+and+Nek4.2+isoforms%3A+from+the+DNA+damage+response+to+RNA+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing.</a> Proteome Sci. 13 (1), 11(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Animal+Cell+Culture+Guide%22">Animal Cell Culture Guide</a>. , https://www.atcc.org/resources/culture-guides/animal-cell-culture-guide (2024).</li>
<li>Soubeyrand, S., Pope, L., Haché, R. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II%CE%B1-dependent+induction+of+a+persistent+DNA+damage+response+in+response+to+transient+etoposide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22MolOncol%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase IIα-dependent induction of a persistent DNA damage response in response to transient etoposide exposure.</a> MolOncol. 4 (1), 38-51 (2010).</li>
<li>Wei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Etoposide-induced+DNA+damage+affects+multiple+cellular+pathways+in+addition+to+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Etoposide-induced DNA damage affects multiple cellular pathways in addition to DNA damage response.</a> Oncotarget. 9 (35), 24122-24139 (2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Melo-Hanchuk, T. D., Slepicka, P. F., Pelegrini, A. L., Menck, C. F. M., Kobarg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NEK5+interacts+with+topoisomerase+II%CE%B2+and+is+involved+in+the+DNA+damage+response+induced+by+etoposide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">NEK5 interacts with topoisomerase IIβ and is involved in the DNA damage response induced by etoposide.</a> J Cell Biochem. 120 (10), 16853-16866 (2019).</li>
<li>George, J., Mittal, S., Kadamberi, I. P., Pradeep, S., Chaluvally-Raghavan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+proximity+ligation+assay+%28PLA%29+for+detection+of+RNA-protein+complex+interactions+in+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized proximity ligation assay (PLA) for detection of RNA-protein complex interactions in cell lines.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101340(2022).</li>
<li>Zhang, W., Xie, M., Shu, M. D., Steitz, J. A., DiMaio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity-dependent+assay+for+specific+RNA-protein+interactions+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A proximity-dependent assay for specific RNA-protein interactions in intact cells.</a> RNA. 22 (11), 1785-1792 (2016).</li>
<li>Hegazy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assay+for+detecting+protein-protein+interactions+and+protein+modifications+in+cells+and+tissues+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assay for detecting protein-protein interactions and protein modifications in cells and tissues in situ.</a> Curr Protoc Cell Biol. 89 (1), e115(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Placas negras de 384 pocillos</td><td>Perkin Elmer Placas portadoras de</td><td></td><td></td>células</tr><tr><td>Burro&nbsp; anti-Conejo Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Duo link Burro anti Ratón Minus</td><td>Sigma DUO92004</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diluyente de anticuerpos Duolink</td><td>Sigma</td><td>DUO82008</td><td></td></tr><tr><td>Solución de bloqueo Duolink 1X</td><td>Sigma</td><td>DUO82007</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Reactivo de detección Far red</td><td>Sigma</td><td>DUO92013</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Burro anti cabra plus</td><td>Sigma</td><td>DUO92003</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Burro anti conejo más</td><td>Sigma</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>Etopósido</td><td>Sigma</td><td>E1383</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti Nek4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-5517</td><td>cabra anti Nek4 se utilizó en dilución 1:50</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo</td><td>H1399</td><td>0.6 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>Leica DMI, microscopio Leica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti Ku70</td>, <td>Thermo</td><td>MA5-13110</td>, <td>mouse anti Ku70 se utilizó en dilución 1:100</td></tr><tr><td>Mouse anti TOPII&beta;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-365071</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Conejo anti Nek5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-84527</td><td>1:25</td></tr><tr><td>Conejo anti Y H2AX</td><td>Cell Signalling</td><td>9718S</td><td>1:100 dilución</td></tr><tr><td>U2OS línea celular</td><td>ATCC</td><td>HTB-96&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de ligando de proximidad para localizar proteínas en sitios de daño en el adn

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

Hemos observado la interacción Nek4-Ku70 en ausencia de tratamiento con etopósido. Sin embargo, esta interacción puede ocurrir fuera del núcleo (Figura 1A). La interacción Nek4-Ku70 aumenta después del daño en el ADN y se concentra en el núcleo (Figura 1A). En el caso de la interacción Nek5-Topoisomerasa II β (TOPIIβ), utilizada en este ensayo como control positivo con base en los resultados de la literatura18, la interacción se incrementa considerablemente con el tratamiento con etopósido (Figura 1B).
El tratamiento con etopósido promueve un incremento de casi el 40% (un promedio de 9 puntos/núcleo en las células tratadas con vehículos frente a 12 - 14 puntos/núcleo en las células tratadas con etopósido). La interacción de Nek4 y Ku70 no es exclusiva de las condiciones de daño en el ADN. De hecho, Nguyen et al.12 demostraron que estas proteínas pueden interactuar en ausencia de la agresión celular y no dependen del ADN, lo que significa que la interacción no siempre se produce en los sitios de daño del ADN.
La tinción γ-H2AX está ausente en las condiciones de control, pero aumenta después de 20 min de tratamiento con etopósido y se mantiene hasta 3 h de tratamiento (Figura 1C). Algunos de los puntos de interacción están cerca de la tinción γ-H2AX (Figura 1C). Después de 1 h de tratamiento, la mayoría de los puntos de interacción Nek4-Ku70 se concentran en los focos de daño del ADN (Figura 1C).
La caída de Nek4 es de alrededor del 70% (datos no presentados), lo que significa que la señal no se eliminará por completo. Creemos que la diferencia en el número de puntos/núcleos no es equivalente al agotamiento de la proteína, ya que la proteína recordante se dedicará a la respuesta al daño del ADN y luego interactuará con Ku70. El promedio de puntos/núcleo encontrados en las células knockdown Nek4 tratadas durante 3 h con etopósido es de 10, lo que significa una reducción de alrededor del 30% en comparación con las células PLKO de control en la misma condición. Si consideramos que el etopósido aumenta la interacción Nek4-Ku en un 40% en relación con las células tratadas con vehículos, y tenemos un 70% de knockdown de Nek4, las células knockdown presentarán alrededor de 10 puntos/núcleo. La interacción de Nek4 y Ku70 no es exclusiva de la respuesta al daño del ADN, y aunque se incrementa después del daño del ADN, el principal cambio está en la localización de la interacción.
Los resultados mostrados aquí presentan una herramienta importante para localizar la interacción de las proteínas en el contexto de la respuesta al daño del ADN. Nek4 y Ku70 ya han sido implicados en DDR, y Nek4 parece ser importante para el reclutamiento de Ku70/Ku80 en los focos de daño en el ADN12. Sin embargo, las características espaciales y temporales de esta interacción pueden explorarse utilizando PLA concomitantemente con tinción de γ-H2AX.
Otras técnicas, como la coinmunoprecipitación y la inmunofluorescencia, pueden proporcionar información similar, pero por separado. El uso del marcador γ-H2AX como referencia permite el seguimiento temporal y espacial de la interacción.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67072/67072fig01v4.jpg"> Figura 1: Interacción Nek4 - Ku70 en condiciones de daño en el ADN. (A) Las células U2OS se incubaron con etopósido (25 μM) durante 20 min, 1 h y 3 h. Se utilizó DMSO (0,05% durante 3 h) como vehículo. Después del tratamiento, las células se fijaron con metanol helado y el PLA se realizó utilizando anti-Nek4 de cabra y anti-Ku70 de ratón como anticuerpos primarios. El núcleo se tiñó con Hoechst 33342 y se presenta en azul; Los puntos de PLA se presentan en rojo. Las células control fueron células tratadas con etopósido durante 1 h e incubadas solo con un anticuerpo primario (anti-Nek4 de cabra) y ambos anticuerpos secundarios. El control biológico fue con células knockdown Nek4 (shRNA Nek4) tratadas durante 3 h con etopósido. (B) Control positivo del ensayo basado en los resultados de la literatura: las células U2OS se incubaron con 25 μM de etopósido durante 1 h, y el PLA se realizó con ratón anti-Nek5 y conejo anti-TOPIIβ. El gráfico es representativo de un experimento y representa el promedio más la media del error estándar (SEM) de todas las celdas comprendidas en al menos 4 campos diferentes (al menos 35 celdas para el control y 50 celdas para todas las demás condiciones). La significación se obtuvo mediante la prueba t y *: p&lt;0.05, **p&lt;0,01 y *** p&lt;0,001 en comparación con el vehículo DMSO. (C) Después del PLA, las células presentadas en (A) se lavaron con PBS y se incubaron con el anticuerpo anti-γ-H2AX de conejo. Después de 1 h de incubación, el anticuerpo secundario contra conejo se utilizó para la detección de focos de daño en el ADN y se presenta en verde. Las regiones que contienen la tinción conjunta de PLA y γ-H2AX se acercan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/67072fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Estructura de carpetas. Las imágenes de Nucleus y PLA deben colocarse en carpetas diferentes, como se muestra aquí. Los nombres de archivo deben comenzar con un prefijo específico (por ejemplo, DAPI, PLA) y deben tener una imagen correspondiente en cada carpeta (por ejemplo, DAPI_control1.tif y PLA_control1.tif). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%201_RE.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Ventana de parámetros de macro. Después de abrir/ejecutar la macro en ImageJ/FIJI, se le pedirá al usuario que elija las carpetas de datos e ingrese los parámetros. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/Supplementary%20figure%202_RE.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 1: Archivo de macro creado para ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67072/pla_dots_per_nucleus_basei_et_al_2024.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Ensayo de ligando de proximidad para localizar proteínas en sitios de daño en el ADN

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...

proximity-ligand-assay-to-localize-proteins-in-dna-damage-sites

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video describe el ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína en células de nematodos. La proximidad de las proteínas de interés genera la plantilla circular de ADN con la ayuda de una sonda de PLA unida a un anticuerpo secundario. La sonda se amplifica aún más utilizando la solución de amplificación, que produce un ADN monocatenario largo seguido de la hibridación de la sonda detectora, lo que permite la localización de las interacciones...

Ensayo de ligadura de proximidad para estudiar in situ las interacciones proteína-proteína

Los láseres se utilizan con frecuencia en los estudios de la respuesta celular al daño del ADN. Sin embargo, que generan lesiones cuya distancia, la frecuencia y las colisiones con las horquillas de replicación están raramente caracterizado. Aquí se describe un método que permite la determinación de estos parámetros con láser localizado entrecruzamientos entre cadenas.

El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

Microirradiation láser es una herramienta útil para estudios de reparación del ADN en las células vivas. Se muestra un enfoque metodológico para el uso de láseres de rayos UVA para inducir varias lesiones del ADN. Hemos optimizado un método para microirradiation local que mantiene el ciclo normal de la célula; así, las células irradiadas proceden a través de mitosis.

Avanzadas técnicas de Microscopía Confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del ADN

Estudiar la cinética de reparación de daños de ADN requiere un sistema para inducir lesiones en regiones definidas del nucleares. Se describe un método para crear localizados roturas de doble cadena utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un 405 nm láser y procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación de estas lesiones.

Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

El objetivo de este protocolo es cuantificar la reparación de reticulaciones de ADN-proteína definido en ADN plásmido. Plásmidos lesionados son transfectados en líneas celulares mamíferos receptores y bajo peso molecular cosechada en múltiples puntos de tiempo después la transfección. Cinética de reparación del ADN se cuantificó usando extensión primer filamento específico seguido por qPCR.

Una prueba Simple, rápida y cuantitativa a medida reparación de vínculos cruzados de proteínas DNA en plásmidos Transfected en las células de mamífero

Después del daño del ADN, las células humanas activan vías de reparación esenciales para restaurar la integridad de su genoma. Aquí, describimos el método de inmunofluorescencia indirecta como un medio para detectar proteínas de reparación del ADN, analizar su reclutamiento espacial y temporal, y ayudar a interrogar la interacción proteína-proteína en los sitios de daño del ADN.

Visualización de la interacción de proteínas de reparación del ADN por inmunofluorescencia

Si bien las colisiones de horquilla de replicación con aductos de ADN pueden inducir roturas de doble cadena, se sabe menos sobre la interacción entre los replisomas y las lesiones de bloqueo. Hemos empleado el ensayo de ligadura de proximidad para visualizar estos encuentros y caracterizar las consecuencias para la composición replisómica.

Visualización de encuentros con replisoma con una lesión bloqueadora etiquetada con antígeno

Aquí, se presenta un protocolo para analizar las enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, utilizando ejemplos de enzimas ligasa, nucleasa y polimerasa. El ensayo utiliza oligonucleótidos marcados con fluorescencia y sin marcar que pueden combinarse para formar dúplex que imitan el ARN y/o los daños en el ADN o los intermediarios de la vía, lo que permite la caracterización del comportamiento de las enzimas.

Uso de oligonucleótidos sintéticos modificados para analizar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Se describe un protocolo simple de identificar a las proteínas del cerebro que se unen a la terminal C de longitud completa de la ATP-dependientes P2X2 receptores. La extensión y aplicación sistemática de este enfoque a todos los receptores P2X se espera que conduzca a una mejor comprensión de la señalización del receptor P2X.

Proteómica para identificar proteínas que interactúan con los canales de cationes P2X2 ligando

Aprende a detectar interacciones proteicas en sitios de daño del ADN mediante ensayo de ligando de proximidad combinado con tinción Gamma-H2AX en células U2OS. Este protocolo permite caracterizar espacialmente las interacciones proteicas.

Ensayo de ligando de proximidad para localizar proteínas en sitios de daño en el ADN

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