Name: Comprender el desarrollo de vías compensatorias en un parásito mutante de la malaria que alberga un alelo hipomórfico de quinasas similares a las plantas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Descubre cómo las vías compensatorias en parásitos de malaria con alelos hipomórficos de quinasas esenciales revelan mecanismos de resistencia. Este estudio emplea CRISPR-Cas9 para explorar estrategias de inhibición dual y desarrollar terapias combinadas más efectivas contra la malaria.

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<meta charset="utf8"></head><body>Identificación de la reconexión de quinasas en el parásito de la malaria: un enfoque de genética química

<table><tbody><tr><td>1x cóctel de inhibidores de fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04906 845001</td><td></td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Albumax II&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GST</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G7781</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4416</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Conejo HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZ1</td><td>NEB</td><td>R0703S</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>ThermoFisher Centrífuga Scientific</td><td>Sorvall legend micro 17R</td><td></td></tr><tr><td>(para peletización de células bacterianas)</td><td>Centrífuga ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R</td><td></td></tr><tr><td>(para peletización/procesamiento de parásitos)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Sorvall ST 8R (rotor TX-400)</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>RO1765</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BLR(DE3) Células competentes pLysS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69956</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5a Células competentes</td><td>Takara Bio</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de electroporación, espacio de 0,2 cm</td><td>BioRad</td><td>1652086</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BioRad</td><td>GenePulser Reactivo</td> quimioluminiscente Xcell <td></td></tr><tr><td>femtoLUCENTTM PLUS HRP</td><td>G-Bioscience</td><td>7860-003</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de Giemsa Himedia</td><td></td><td>S011-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glutatión Sepharose 4B</td><td>GE Healthcare</td><td></td> 17075601 <td></td></tr><tr><td>HEPES, Ácido Libre</td><td>Merck</td><td>391338</td><td></td></tr><tr><td>Hipoxantina</td><td>Merck</td><td>4010CBC</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonación HD por fusión</td><td>Takara Bio</td><td>1711641A</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1708880EDU</td><td></td></tr><tr><td>MBP, desfosforilado</td><td>&nbsp; Merck</td><td>13-110</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R3189S</td><td></td></tr><tr><td>Nucleobond Xtra Maxi EF&nbsp; &nbsp;</td><td>Takara Bio 740424</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel y limpieza de PCR Mini kit</td><td>Takara Bio</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>mesilato de p-nitrobencil (PNBM)</td><td>Abcam</td><td>Ab138910</td><td></td></tr><tr><td>Primestar Max ADN polimerasa</td><td>Takara Bio</td><td>R045A</td> Cóctel inhibidor de la proteasa <td></td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td></td><td></td>11836170001</tr><tr><td>Kit de minipreparación Qiaprep Spin &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QuikChange II XL kit de mutagénesis dirigida al sitio</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31800-105</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SpeI-HF</td><td>NEB</td><td>R3133S</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Kit de síntesis de primera cadena</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de éster de tiofosfato</td><td>Abcam</td><td>Ab92570</td><td></td></tr></tbody></table>

comprender el desarrollo de vías compensatorias en un parásito mutante de la malaria que alberga un alelo hipomórfico de quinasas similares a las plantas

Understanding the Development of Compensatory Pathways in a Mutant Malaria Parasite Harbouring Hypomorphic Allele of Plant-Like Kinases

La WT CDPK1 recombinante se expresa como una proteína de fusión con una etiqueta N-terminal de glutatión S-transferasa (GST) y se purifica mediante cromatografía de afinidad GST. La proteína CDPK1 purificada se detectó a través de Western blot utilizando anticuerpos anti-CDPK1 y anti-GST (Figura 1). El residuo guardián de la treonina (T145) en WT CDPK1 se reemplazó con Met y Ser utilizando mutagénesis dirigida al sitio para generar proteínas recombinantes CDPK1T145M y CDPK1T145S mutantes, respectivamente (Figura 2). Se realizó un ensayo de quinasa in vitro para evaluar la actividad quinasa de todas las proteínas CDPK1 recombinantes. La actividad de la quinasa se probó utilizando un enfoque de marcaje de epítopos semisintéticos34 mediante la detección del grupo éster de tiofosfato utilizando un anticuerpo específico en un formato de Western blot (Figura 3). El impacto de la sustitución de gatekeeper en la actividad de autofosforilación de CDPK1 y la transfosforilación de MBP utilizada como sustrato exógeno de CDPK1 se evaluó cuantificando la intensidad de las respectivas bandas de autofosforilación y transfosforilación. El mutante CDPK1 con gatekeeper de metionina retuvo ~ 53% de actividad de transfosforilación, mientras que la presencia de una serina en la posición de gatekeeper condujo a la abrogación completa de la transfosforilación del sustrato (Figura 3). Los SNP que conducen a la sustitución del guardián de Thr a Met (T145M) se diseñaron en el locus endógeno cdpk1 a través de CRISPR-Cas9 utilizando un sistema de dos plásmidos (Figura 4 y Figura 5). Los parásitos mutantes con sustitución de T145S no pudieron ser generados, posiblemente debido al efecto letal del gatekeeper Ser sobre la actividad de CDPK1. Los CDPK1T145M parásitos mutantes se subclonaron utilizando el método de dilución limitante, y la sustitución del guardián se confirmó mediante secuenciación de Sanger para verificar la generación del parásito mutante CDPK1T145M. Los niveles de transcripción de 11 quinasas diferentes, incluidos 7 miembros de la familia CDPK y otras 4 quinasas involucradas en el desarrollo esquizogónico tardío del parásito, se probaron mediante PCR en tiempo real (Figura 6). Se compararon los niveles de expresión de 11 quinasas diferentes entre los parásitos mutantes CDPK1T145M y los de tipo salvaje (WT), normalizados a los genes domésticos. La expresión de la transcripción de los miembros de la familia CDPK se alteró en el mutante CDPK1T145M en comparación con el parásito WT (Figura 6). Las transcripciones que muestran una mayor expresión en el mutante CDPK1T145M pueden estar compensando la función de CDPK1 en el parásito mutante CDPK1T145M.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig01.jpg"> Figura 1: Caracterización de PfCDPK1 de tipo salvaje recombinante (WT) de longitud completa. La proteína WT CDPK1 de longitud completa fusionada con la marca N-terminal de glutatión S transferasa (GST) se purificó por cromatografía de afinidad y se separó en SDS-PAGE al 10%. CDPK1 migró a la masa molecular predicha de ~ 87 kDa, como se muestra en el gel de poliacrilamida teñido con Coomassie Brilliant Blue R-250. La proteína recombinante separada en el SDS-PAGE se transfirió a una membrana de PVDF y se procesó para el análisis de Western blot con anticuerpos anti-CDPK1 y anti-GST. La banda correspondiente a la CDPK1 recombinante de longitud completa en SDS-PAGE se detectó con ambos anticuerpos, confirmando la identidad de la proteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig02.jpg"> Figura 2: Caracterización de proteínas mutantes recombinantes CDPK1 mutantes purificadas. (A) Alineación de la secuencia de aminoácidos primarios de TgCDPK1 y PfCDPK1 (accesión de Plasmodb no. PF3D7_0217500). La treonina en la posición 145 de PfCDPK1 corresponde a la glicina 128, la posición de guardián en TgCDPK1 (resaltada en rojo). (B) Representación del caricaturista del residuo del guardián Thr (resaltado en rojo) codificado por el codón triplete ACC (círculo negro) en WT CDPK1. Sustitución del residuo guardián por mutagénesis dirigida al sitio para generar proteínas CDPK1 mutantes recombinantes con Met (resaltado en amarillo) en CDPKT145M y Ser (resaltado en azul) en CDPKT145S. (C) Perfil SDS-PAGE de WT recombinante y proteínas mutantes de CDPK1. Las proteínas mutantes WT y gatekeeper recombinantes se purificaron mediante cromatografía de afinidad GST y se separaron en SDS-PAGE. Todas las proteínas recombinantes se ajustan al peso molecular esperado de ~87 kDa. M- escala de peso molecular. (D) Caracterización de CDPK1 WT recombinante y proteínas mutantes mediante Western blot. Las proteínas recombinantes WT y mutantes gatekeeper de CDPK1 se separaron en SDS-PAGE y se transfirieron a la membrana de PVDF para Western blot. Las bandas correspondientes a las proteínas WT recombinantes de longitud completa y CDPK1 mutantes en SDS-PAGE se detectaron con anticuerpos anti-CDPK1 y anti-GST, confirmando la identidad de todas las proteínas recombinantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig03.jpg"> Figura 3: La sustitución de gatekeeper en CDPK1 conduce a una disminución en la actividad quinasa de las enzimas mutantes. (A) Representación del caricaturista del enfoque de marcado de epítopos semisintéticos para detectar la actividad de la quinasa de la proteína CDPK1. Aquí solo se representa la actividad de transfosforilación. La proteína CDPK1 tiofosforila un sustrato exógeno (S, cuadrado verde sólido) en presencia de ATPγS (triángulo amarillo sólido), una fuente de grupo tiofosfato terminal transferible). El residuo tiofosforilado se alquila mediante tratamiento con mesilato de p-nitrobencil (PNBM), formando un éster de tiofosfato que luego se detecta con un anticuerpo que reconoce específicamente el aducto de tiofosfato alquilado. (B) Se utilizó un ensayo de actividad de quinasa in vitro utilizando un enfoque de marcado de epítopos semisintéticos para probar el efecto de la sustitución de guardianes en el potencial de autofosforilación y transfosforilación de proteínas mutantes CDPK1 recombinantes. Todas las proteínas recombinantes exhiben actividad quinasa dependiente del calcio. La autofosforilación de CDPK1 y la transfosforilación de la proteína básica de mielina (MBP), un sustrato exógeno, solo fueron evidentes en presencia de cloruro de calcio (Ca2+), mientras que no se detectó fosforilación en presencia de EGTA, un quelante específico de los iones Ca2+ . Los mutantes guardianes muestran una actividad de autofosforilación reducida, mientras que la transfosforilación de MBP se abrogó por completo en CDPK1T145S. CDPK1T145M conserva el potencial de transfosforilación (~ 53 %) como se informó anteriormente32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig04.jpg"> Figura 4: Construcción de plásmidos para introducir SNPs en la posición de gatekeeper en el locus cdpk1 utilizando CRISPR-Cas9. Se clonó una secuencia guía de 20 nucleótidos correspondientes a 432 a 451 pb en el sitio de restricción de BtgZI en el plásmido pL6eGFP para generar pL6CK1G. Un brazo de homología (421 pb) que incorporaba los SNPs deseados (T145M o T145S, el codón correspondiente se mostraba en verde) junto con mutaciones de escudo (se mostraban en rojo) se clonó en pL6CK1G dentro de los sitios de enzimas de restricción AflII y SpeI para generar pL6CK1GT145M y pL6CK1GT145M, respectivamente. Las mutaciones de escudo evitan el recorte del locus modificado después de la edición deseada. La endonucleasa Cas9 codificada en un segundo plásmido, pUF1, se dirige al sitio objetivo dentro del locus cdpk1 con la ayuda del ARN guía expresado a partir del plásmido pL6CK1GT145M/S . Cas9 introduce una rotura de doble hebra en el sitio objetivo hacia el lado 5' de la secuencia PAM. El DSB se repara utilizando el brazo de homología en el plásmido pL6CK1GT145M/S . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig05.jpg"> Figura 5: Representación esquemática de P. transfección de falciparum con plásmidos CRISPR para la introducción de la mutación gatekeeper (T145M) en el locus cdpk1 . i) P asíncrono. El cultivo de Falciparum se trata con sorbitol para obtener parásitos sincronizados en etapa anular. ii) Los parásitos sincronizados en etapa anular se toman en una cubeta de electroporación junto con plásmidos pL6CK1G, T145M/S y pUF1 resuspendidos en una solución tampón. iii) Los parásitos se electroporan a 310 voltios, 950 μF y resistencia infinita. iv) Después de la transfección, los parásitos se transfieren a un matraz T25 que contiene medio RPMI completo fresco (cRPMI) y se cultivan durante 48 h. Después de 48 h, los parásitos transfectados se cambian a cRPMI suplementado con los fármacos WR99210 y DSM267 y se expanden en el matraz T75. v) El día 14 se preparan los portaobjetos y se tiñen con tinte de Giemsa. vi) Posteriormente, el frotis de sangre se visualiza bajo un microscopio óptico para evaluar la presencia de glóbulos rojos parasitados. vii) Tras la visualización, se permite que los parásitos crezcan en presencia de fármacos. Posteriormente, los parásitos se procesan para obtener la plantilla para la PCR y la secuenciación del ADN para la verificación de la modificación deseada del locus cdpk1 objetivo. viii) Con posterioridad a la verificación, los parásitos transgénicos clonales se obtienen mediante el establecimiento de una dilución limitante en una placa de 96 pocillos. ix) Los parásitos transgénicos clonales de los pozos positivos se transfieren a matraces T25 y se les permite crecer. x) Los parásitos transgénicos clonales se validan aún más a través de PCR y la presencia de SNP deseados en la posición de guardián mediante secuenciación de ADN y análisis del cromatograma. La cifra se modifica de32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67079/67079fig06.jpg"> Figura 6: Representación esquemática de los pasos utilizados para el análisis de transcripción de genes diana a través de PCR en tiempo real (RT-PCR). i ) P. El cultivo de falciparum con parásitos predominantemente maduros en estadio de esquizonte se obtiene mediante tratamiento con sorbitol en el mismo ciclo. ii) Los parásitos se colocan suavemente en capas sobre un gradiente de 70/40 Percoll/sorbitol en un tubo cónico de 15 mL para el enriquecimiento de los parásitos maduros en etapa de esquizonte. iii) El anillo de color negro en la interfase de 40 % y 70 % personal/sorbitol se transfiere a un tubo nuevo de 50 mL, se procesa y se resuspende en cRPMI. Los parásitos enriquecidos en la etapa esquizontónica se incuban con glóbulos rojos frescos preincubados a 37 °C para la invasión. iv) Los parásitos se cultivan durante 4 h y luego se tratan con sorbitol al 5 % para obtener parásitos en etapa anular altamente sincronizados de 0-4 h. v) Los parásitos se cultivan adicionalmente para un tratamiento adicional de 44 h después del sorbitol para obtener parásitos altamente sincronizados en la etapa de esquizontes de 44-48 h. vi) Los parásitos sincronizados se tratan con saponina para liberarlos de los glóbulos rojos y se almacenan en un reactivo de extracción de ARN. El ARN total se aísla de los parásitos resuspendidos por la extracción de ARN. vii) el ADNc se prepara a partir del ARN aislado. viii) Se establece un experimento de PCR en tiempo real con la plantilla de ADNc para amplificar los genes objetivo utilizando cebadores específicos de genes. La placa funciona con un sistema de PCR en tiempo real. ix) Los datos de expresión de la transcripción se analizan utilizando un software de análisis. El gráfico representa los niveles de expresión de transcripción diferencial de 11 quinasas en parásitos CDPK1 T145M en comparación con el tipo salvaje (WT). Esta cifra se modifica de32. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67079/67079fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nombre del gen</td>
			<td colspan="4">Secuencia de cebadores</td>
		</tr><tr><td>Pk1fpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGGATCCATGGGGTTCACAAAGTTCAAACG</td>
		</tr><tr><td>Pk1rpgex</td>
			<td colspan="4">ATGCGCGCGCGGCCGCTTATGAAGATTTATTATCACAAATTTTGTGCATC</td>
		</tr><tr><td>CK1T145S</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAGAAATATTTTTTTATTTAGTAAGCGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145S_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCGCTTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>CK1T145M</td>
			<td colspan="4">GTTTGATGTTTTTGAAGATAAATATTTTTTTATTTAGTAATGGAATTTTATGAAGGTGGGGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1T145M_antisense</td>
			<td colspan="4">TTCCCCACCTTCATAAAATTCCATTACTAAATAAAAATATTTCTTATCTTCAAAAACATCAAAC</td>
		</tr><tr><td>Ck1GUIDEFWD</td>
			<td colspan="4">TAAGTATATAATATTAACCGAATTTTATGAAGGTGTTTTTTAGAGCTAGAA</td>
		</tr><tr><td>Ck1GUIDEREV</td>
			<td colspan="4">TTCTAGCTCTAAAACCACCTTCATAAAATTCGGTTAATATTATATACTTA</td>
		</tr><tr><td>CK1F1 </td>
			<td colspan="4">ATTTTCTTTTCTGAACGTGTAACATG</td>
		</tr><tr><td>CK1R3WT</td>
			<td colspan="4">TGCATCTCTTAATCTCTCTCCTCACTG</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Listado de cebadores utilizados en el estudio.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nombre del gen</td>
			<td colspan="2">Imprimación hacia adelante</td>
			<td colspan="2">Imprimación inversa</td>
		</tr><tr><td>CDPK1 (PF3D7_0217500)</td>
			<td colspan="2">GGAAGAATTAGCAAATTTATTTGGTTTGACATC</td>
			<td colspan="2">ATGTTAACGAATTCATCAAAGTCAATCATGT</td>
		</tr><tr><td>CDPK2 (PF3D7_0610600)</td>
			<td colspan="2">GGAACAGGAGAATTTACAACGAC</td>
			<td colspan="2">TGTATACATAATAACACCACTAGACCAG</td>
		</tr><tr><td>CDPK3 (PF3D7_0310100)</td>
			<td colspan="2">CACGAAATATTGAGCATGGTAAAGAAGG</td>
			<td colspan="2">CAGCGTCCATTGTAAG ACATCTTTTTATTAAATC</td>
		</tr><tr><td>CDPK4 (PF3D7_0717500)</td>
			<td colspan="2">ATACTTCTCTCAGGGTGCCC</td>
			<td colspan="2">CTTATCACTAATTTTTTT GAATTGTGGTAAATCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK5 (PF3D7_1337800)</td>
			<td colspan="2">GGAGGTCGAAGATATGGATACGAATAG</td>
			<td colspan="2">TATCGGCTAACGTACTCTTTGTCG</td>
		</tr><tr><td>CDPK6 (PF3D7_1122800)</td>
			<td colspan="2">CCTCCCGTAGATAAGAATATATTATCTATCG</td>
			<td colspan="2">ATCTGCTTCAATAAAATCCCAATACATTTGC</td>
		</tr><tr><td>CDPK7 (PF3D7_1123100)</td>
			<td colspan="2">AGTCCTAAAAAAGATATA TAAAGAACTAGGTAGTAG</td>
			<td colspan="2">TTTAAAAATAATCTTTCTCCCCACAACCC</td>
		</tr><tr><td>PKA (PF3D7_0934800)</td>
			<td colspan="2">AATCATCCATTTTGTGTAAATTTACATGG</td>
			<td colspan="2">CTTTTGTTTCTTCTTAAA AATGTAAAAAATTCTCC</td>
		</tr><tr><td>PAQUETE (PF3D7_1436600)</td>
			<td colspan="2">AAAGGGAAAGAAATAAAAAGAAGGC</td>
			<td colspan="2">CATATCAATATCTTCTGAAAGCTTTTCCC</td>
		</tr><tr><td>PKB (PF3D7_1246900)</td>
			<td colspan="2">CACAATAGAAGAAATGATGTTCTTTTTTACG</td>
			<td colspan="2">GAGAGCGCAATTAGCCATATTG</td>
		</tr><tr><td>PI3K (PF3D7_0515300)</td>
			<td colspan="2">CCCCTTCAATTTGTGTGTGAAACAG</td>
			<td colspan="2">ATCACATTTGTTATACTT ATTATCATCACATTTGTT</td>
		</tr><tr><td>GAPDH (PF3D7_1462800)</td>
			<td colspan="2">GGAAGGAAAGATATCGAAGTAG</td>
			<td colspan="2">GGGTTACCTCACATGG</td>
		</tr><tr><td>ThrRS (PF3D7_1126000)</td>
			<td colspan="2">CTTGGGAACTGCAGAGTAGAATTT</td>
			<td colspan="2">TAAAAATCCTCCGAACAATTTTTCTAAACTAC</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Lista de genes diana (número de identificación de PlasmoDB) junto con la secuencia de los cebadores utilizados para el análisis de PCR en tiempo real.

Comprender el desarrollo de vías compensatorias en un parásito mutante de la malaria que alberga un alelo hipomórfico de quinasas similares a las plantas

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