Name: Modelo in vitro que integra la rigidez y el flujo del sustrato para estudiar las respuestas de las células endoteliales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprende a desarrollar un modelo in vitro que integra rigidez del sustrato y flujo laminar para estudiar la respuesta de células endoteliales. Este sistema permite investigar la mecanotransducción vascular y enfermedades como la aterosclerosis.

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Los autores extienden su gratitud a Robert Egan por su ayuda en la fabricación de la cámara de flujo. Los autores agradecen a Lucas McCauley por su ayuda durante los experimentos. Además, les gustaría agradecer a las instalaciones centrales del Instituto de Imágenes Químicas de Sistemas Vivos (CILS) de la Universidad Northeastern por permitir el acceso a los microscopios confocal. Los autores agradecen el apoyo financiero proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH 1R01EB027705 otorgado a SB) y la Fundación Nacional de Ciencias (NSF CAREER Awards: DMR 1847843 a SB y CMMI 1846962 a EE).

Estudio de la rigidez de los tejidos y los efectos del estrés de cizallamiento en las células endoteliales

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<li>Hamrangsekachaee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+glycocalyx+sensitivity+to+chemical+and+mechanical+sub-endothelial+substrate+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Endothelial glycocalyx sensitivity to chemical and mechanical sub-endothelial substrate properties.</a> Front Bioeng Biotechnol. 11, 1250348(2023).</li>
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<li>Russell-Puleri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+induces+upregulation+of+COX-2+and+PGI2+release+in+endothelial+cells+via+a+pathway+involving+PECAM-1%2C+PI3K%2C+FAK%2C+and+p38%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Heart+Cir+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress induces upregulation of COX-2 and PGI2 release in endothelial cells via a pathway involving PECAM-1, PI3K, FAK, and p38.</a> Am J Physiol-Heart Cir Physiol. 312 (3), H485-H500 (2016).</li>
<li>Hamrangsekachaee, M., Wen, K., Bencherif, S. A., Ebong, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+endothelial+mechanotransduction%3A+current+knowledge+and+models+for+future+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and endothelial mechanotransduction: current knowledge and models for future research.</a> Am J Physiol-Cell Physiol. 324 (2), C488-C504 (2022).</li>
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<li>Kim, J., Bencherif, S. A., Li, W. A., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-friendly+inverse+opal-like+hydrogels+for+a+spatially+separated+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Rapid+Comm%22%5BJournal%5D)">Cell-friendly inverse opal-like hydrogels for a spatially separated co-culture system.</a> Macromol Rapid Comm. 35 (18), 1578-1586 (2014).</li>
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<li>Bencherif, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cross-linker+chemistry+on+release+kinetics+of+PEG-co-PGA+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Influence of cross-linker chemistry on release kinetics of PEG-co-PGA hydrogels.</a> J Biomed Mater Res A. 90 (1), 142-153 (2009).</li>
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<li>Estrada, R., Giridharan, G. A., Nguyen, M. D., Prabhu, S. D., Sethu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+endothelial+cell+culture+model+to+replicate+disturbed+flow+conditions+seen+in+atherosclerosis+susceptible+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic endothelial cell culture model to replicate disturbed flow conditions seen in atherosclerosis susceptible regions.</a> Biomicrofluidics. 5 (3), 32006(2011).</li>
<li>Inglebert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+shear+stress+reduction+on+endothelial+cells%3A+A+microfluidic+study+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">The effect of shear stress reduction on endothelial cells: A microfluidic study of the actin cytoskeleton.</a> Biomicrofluidics. 14 (2), 024115(2020).</li>
<li>Noria, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+reorientation+of+stress+fibers+drives+morphological+changes+to+endothelial+cells+exposed+to+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Assembly and reorientation of stress fibers drives morphological changes to endothelial cells exposed to shear stress.</a> Am J Pathol. 164 (4), 1211-1223 (2004).</li>
<li>Amer, M., Shi, L., Wolfenson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27Yin+and+Yang%27+of+cancer+cell+growth+and+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The 'Yin and Yang' of cancer cell growth and mechanosensing.</a> Cancers (Basel). 13 (19), 4754(2021).</li>
</ol>

Los autores declaran que se ha presentado una solicitud de patente provisional (Nº 63/634.853) con el título Cámara de flujo con un sustrato mecánicamente sintonizable, y que no existen otros intereses contrapuestos.

El sistema vascular es un entorno dinámico en el que diversas fuerzas influyen significativamente en el comportamiento celular. Estudiar los eventos biológicos en las enfermedades cardiovasculares sin tener en cuenta estas fuerzas sería inexacto. Por lo tanto, los modelos celulares capaces de emular el entorno mecánico vascular son cruciales. Los investigadores ya han hecho progresos significativos en destacar el efecto de estas fuerzas en el comportamiento celular11. Sin embargo, para comprender ...

El endotelio, que recubre la superficie interna de los vasos sanguíneos, desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la salud vascular. Las células endoteliales (CE) son fundamentales para regular diversas funciones cardiovasculares, incluyendo el control del tono de los vasos, la permeabilidad selectiva, la hemostasia y la mecanotransducción 1,2. La investigación ha relacionado firmemente la disfunción de la CE con un papel principal en el desarrollo de la aterosclerosis. En particular, las CE encuentran diversas fuerzas mecánicas en las interfaces donde interactúan con el flujo sanguíneo y los tejidos vasculares subyacentes 3,4. Varios estudios han asociado la disfunción de la CE con cambios anormales en los factores mecánicos dentro del entorno vascular, como el esfuerzo por cizallamiento del líquido del flujo sanguíneo y la rigidez de los tejidos 5,6,7.
Sin embargo, la investigación previa ha recibido una atención limitada en la comprensión de los efectos combinados de la rigidez del tejido y el esfuerzo cortante en la función de la CE. Para mejorar la capacidad de traducir los resultados de la investigación en tratamientos efectivos para la aterosclerosis y otras enfermedades cardiovasculares, es esencial mejorar los modelos celulares utilizados en el campo. Se han logrado avances significativos en la humanización de modelos celulares mediante el empleo de EC humanas y su sometimiento a esfuerzos cortantes o sustratos con diferentes niveles de rigidez 8,9,10. Sin embargo, la adopción y el refinamiento de modelos celulares que integran entornos de flujo dinámico con sustratos EC que poseen propiedades de rigidez ajustables ha progresado lentamente. El reto consiste en idear sustratos de EC que no se hinchen para evitar alteraciones en los parámetros de caudal dentro del canal de flujo y, al mismo tiempo, facilitar el cultivo de monocapas de EC intactas y bien adheridas. Un modelo in vitro capaz de superar estos obstáculos podría facilitar investigaciones más efectivas sobre cómo la hipertensión, el envejecimiento y las condiciones de flujo influyen en colaboración en la mecanotransducción de la CE, la salud vascular y, en última instancia, el desarrollo de la aterosclerosis. Se han desarrollado varios métodos para aplicar tensión de cizallamiento en las células mientras se controla la rigidez del sustrato, incluidas placas giratorias y dispositivos microfluídicos. En el método de placa giratoria, las celdas se colocan entre dos placas y se aplica un esfuerzo cortante a través del movimiento de rotación de las placas. Este método es menos complicado y proporciona un modelo rápido; sin embargo, sufre de variación del esfuerzo cortante espacial, con un esfuerzo cortante cero en el centro y un esfuerzo cortante máximo en la periferia11.
Por otro lado, los dispositivos microfluídicos representan la nueva generación de herramientas con la capacidad de controlar la rigidez del sustrato y las condiciones de flujo. Estos sistemas son adecuados para imitar microvasculaturas en condiciones de flujo laminar. Sin embargo, el estudio de la aterosclerosis con estos dispositivos es poco práctico, ya que la aterosclerosis ocurre en grandes vasos con flujo alterado11. Este artículo tiene como objetivo contribuir al dominio crítico de investigación de los estudios de CE mediante la presentación de un sistema rentable capaz de examinar los efectos de los diferentes niveles de rigidez en sustratos de CE bajo diferentes condiciones de flujo. El sistema integra sustratos con diferentes rigideces para emular vasos sanguíneos patológicos y fisiológicos. Este protocolo describe el método para crear hidrogeles a base de gelatina sin hinchazón y con niveles de rigidez de 5 kPa y 10 kPa, que representan la rigidez fisiológica y patológica, respectivamente. Adicionalmente, se detalla la construcción de una cámara de flujo de placas paralelas capaz de integrar estos sustratos. Se empleó la dinámica de fluidos computacional (CFD) para evaluar el esfuerzo cortante y las condiciones de flujo. Se describe la preparación de hidrogeles para el cultivo de CE y la ejecución de un experimento de flujo de 6 h, seguido de una discusión sobre la inmunotinción posterior al experimento.

<table><tbody><tr><td>(trimetoxisilil)metacrilato de propilo, tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Invitrogen</td><td>15524-010 Fabricación de</td><td>hidrogel</td></tr><tr><td>3-(trimetoxisilil)Metacrilato de propilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Salinización de vidrio</td></tr> 4<tr><td>',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)-Medios de montaje que contienen Vector</td><td>Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Inmunotinción</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>A18-4</td><td>GelMA Síntesis</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Faloidina&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>8953S</td><td>Inmunotinción</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Bio-RAD</td><td>1610700</td><td>Fabricación de hidrogel</td></tr><tr><td>Lámina acrílica fundida transparente resistente a los arañazos y a los rayos UV (45/64'')</td><td>McMaster-CARR</td><td>8560K165</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td> de fabricación en cámara de flujo <td>Carl Zeiss Meditex AG</td><td>Zeiss LSM 800</td><td>Inmunotinción</td></tr><tr><td>Covidien Monoject Rigid Pack 60 mL Jeringas sin Agujas</td><td>Fisher&nbsp; &nbsp;</td><td>22-031-375 Experimento de</td><td>flujo</td></tr><tr><td>Kit de crecimiento EC&nbsp;</td><td>Colección de cultivos tipo americano (ATCC)</td><td>PCS-100-041</td><td>Etanol de cultivo celular</td></tr><tr><td>a prueba</td><td>de 200 Decon Labs</td><td>2701</td><td>Gelatina de salinización</td></tr><tr><td>de vidrio tipo A (300 flores) de piel porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>GelMA Síntesis</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>9526-33</td><td>Salinización de vidrio</td></tr><tr><td>Silicona de alta pureza y alta temperatura Lámina</td><td>de caucho McMaster-Carr</td><td>87315K74</td><td>Fabricación de cámara de flujo</td></tr><tr><td>Células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC)</td><td>Colección de cultivo tipo americano (ATCC)</td><td>PSC-100-010</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>M3x30mm Tornillos de máquina Tornillo de cabeza redonda de zócalo hexagonal 304 Sujetadores de acero inoxidable Pernos 20 piezas Uxcell</td><td></td><td>B07Q5RM2TP</td><td>Fabricación de</td></tr> <tr><td>cámara de flujoAccionamiento digital Masterflex L/S con Easy-Load&reg; 3 cabezales de bomba para tubos de precisión; Experimento</td> de flujo <td>VWR</td><td>#MFLX77921-65</td> de 115/230 <td>VCA&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de bomba de precisión Masterflex L/S, Puri-Flex, L/S 25; 25 pies</td><td>VWR</td><td>#MFLX96419-25</td><td>Flow Experiment&nbsp;</td></tr><tr><td>Anhídrido metacrílico (MAH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276685</td><td>GelSíntesis</td></tr><tr><td>de MA Paraformaldehído</td><td>Thermo Fisher Scientifics</td><td>043368.9M</td><td>Cultivo celular</td></tr> solución <tr><td>salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>General Bicarbonato de sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S233-3</td><td>GelMA Síntesis</td></tr><tr><td>Carbonato de sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S263-500</td><td>GelMA Synthesis</td></tr><tr>Versión <td></td><td></td><td></td><td>educativa de SOLIDWORKS SOLIDWORKS</td></tr><tr><td>Student Edition Desktop, 2023</td><td>SolidWorks</td><td>N/A</td><td>Diseño de cámara</td></tr><tr><td>de flujo Medio basal vascular</td><td>Colección de cultivos de tipo americano (ATCC)</td><td>PCS-100-030</td><td>Cultivo celular</td></tr></tbody></table>

modelo in vitro que integra la rigidez y el flujo del sustrato para estudiar las respuestas de las células endoteliales

In Vitro Model Integrating Substrate Stiffness and Flow to Study Endothelial Cell Responses

Presentamos un innovador modelo in vitro destinado a investigar los efectos combinados de la rigidez tisular y el estrés de cizallamiento en la función de las células endoteliales (CE), que son cruciales para comprender la salud vascular y la aparición de enfermedades como la aterosclerosis. Tradicionalmente, los estudios han explorado los impactos del esfuerzo cortante y la rigidez del sustrato en las CE, de forma independiente. Sin embargo, este sistema integrado combina estos factores para proporcionar una simulación más precisa del entorno mecánico de la vasculatura. El objetivo es examinar la mecanotransducción de la CE a través de varios niveles de rigidez tisular y condiciones de flujo utilizando CE humanas. Detallamos el protocolo para sintetizar hidrogeles de metacrilato de gelatina (GelMA) con rigidez sintonizable y sembrarlos con ECs para conseguir confluencia. Además, describimos el diseño y montaje de una cámara de flujo rentable, complementada con simulaciones de dinámica de fluidos computacional, para generar condiciones de flujo fisiológico caracterizadas por flujo laminar y niveles adecuados de esfuerzo cortante. El protocolo también incorpora el marcaje de fluorescencia para la microscopía confocal, lo que permite evaluar las respuestas de la CE tanto a la distensibilidad tisular como a las condiciones de flujo. Al someter las CE cultivadas a múltiples estímulos mecánicos integrados, este modelo permite realizar investigaciones exhaustivas sobre cómo factores como la hipertensión y el envejecimiento pueden afectar a la función de la CE y a las enfermedades vasculares mediadas por la CE. Los conocimientos obtenidos de estas investigaciones serán fundamentales para dilucidar los mecanismos subyacentes a las enfermedades vasculares y para desarrollar estrategias de tratamiento eficaces.

La Figura 1 muestra la configuración experimental, describiendo el proceso de síntesis de GelMA a través de una reacción de metacrilación. El producto resultante se utilizó para fabricar el sustrato de hidrogel, sobre el que se sembraron las EC. Posteriormente, las células se introdujeron en la cámara de flujo para un experimento de flujo de 6 h a 12 dinas/cm2.
1Se utilizó espectroscopia de RMN H para evaluar el éxito de la reacción de metacr...

Sintetizamos y caracterizamos un sustrato a base de gelatina sintonizable para el cultivo de células endoteliales vasculares (CE) en condiciones de flujo vascular relevantes. Esta superficie biomimética reproduce condiciones fisiológicas y patológicas, lo que permite el estudio de las fuerzas mecánicas sobre el comportamiento de la CE y avanza en nuestra comprensión de la salud vascular y los mecanismos de la enfermedad.

Modelo in vitro que integra la rigidez y el flujo del sustrato para estudiar las respuestas de las células endoteliales

We present an innovative in vitro model aimed at investigating the combined effects of tissue rigidity and shear stress on endothelial cell (EC) function, ...

Este estudio se centra en la mecanobiología en relación con la aterosclerosis y la hipertensión. Las principales preguntas que buscamos abordar son: primero, ¿cómo podemos replicar con mayor precisión el entorno vascular bajo condiciones fisiológicas y patológicas? Segundo, ¿cuáles son las respuestas celulares de las células endoteliales cuando se exponen simultáneamente a esos estímulos mecánicos?El estudio tiene como objetivo proporcionar una simulación más precisa del entorno vascular mediante la integración de la rigidez del sustrato y las condiciones de flujo en un solo sistema. Los modelos in vitro anteriores o bien investigan la rigidez del sustrato en condiciones estáticas o bien estudian el efecto del flujo sobre células endoteliales cultivadas en un sustrato rígido, lo cual es fisiológicamente irrelevante en ambos casos. Para comenzar, añada 10 gramos de gelatina tipo A, de 300 bloom, de piel porcina a 100 mililitros de tampón de carbonato bicarbonato.Disuelva la gelatina en un baño de agua a 55 grados Celsius mientras agita la solución a 700 RPM utilizando un agitador magnético. Una vez completamente disuelta, ajuste el pH de la solución de gelatina a 9,5 utilizando hidr

in-vitro-model-integrating-substrate-stiffness-flow-to-study

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Estamos describiendo un método de someter a las células adherentes al esfuerzo cortante de flujo laminar en un circuito de flujo continuo estéril. Adhesión de las células, la morfología puede ser estudiado a través de la cámara transparente, las muestras obtenidas de los circuitos para el análisis de metabolitos y células recolectadas después de la exposición de corte para futuros experimentos o la cultura.

De placas paralelas de flujo y la Cámara de circuito de flujo continuo para evaluar las células progenitoras endoteliales bajo una tensión cortante de flujo laminar

Aquí se describe un método sencillo y rápido para medir la rigidez de la célula. El principio general de este enfoque consiste en medir la deformación de la membrana en respuesta a la bien definida la presión negativa aplicada a través de una micropipeta a la superficie celular. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar las propiedades biomecánicas de los adjuntos sustrato células.

Aspiración Micropipeta de células adheridas a sustratos para estimar la rigidez Celular

Larvas de Drosophila son un sistema modelo atractivo para imágenes en vivo debido a su cutícula translúcida y la genética de gran alcance. Este protocolo describe cómo utilizar un dispositivo de PDMS de una sola capa, llamada el 'chip de larva' para imágenes en vivo de procesos celulares dentro de las neuronas de 3 º estadio las larvas de Drosophila.

El uso de chips de microfluídica para imágenes en vivo y de estudio de las respuestas de lesiones en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Este protocolo revisa eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección, un método para registrar y analizar el espectro de impedancia de las células adherentes para la cuantificación de la unión celular, la proliferación, motilidad, y las respuestas celulares a estímulos farmacológicos y tóxicos. La detección de la permeabilidad endotelial y la evaluación de los contactos célula-célula y célula-sustrato que se obtienen.

Eléctrico de la célula-sustrato Impedancia de detección para la cuantificación de la proliferación endotelial, la función de barrera, y la motilidad

Aquí, se describe un método que permite la preparación rápida, eficiente y económica de geles de poliacrilamida en un formato de placa multipocillo. El método no requiere ningún equipo especializado y podría ser fácilmente adoptado por cualquier laboratorio de investigación. Sería particularmente útil en investigaciones centradas en la comprensión de las respuestas celulares dependientes de la rigidez.

Multiwell Rigidez Ensayo para el Estudio de las respuestas de las células Rigidez dependientes simple basado poliacrilamida-

Hemos desarrollado un ensayo de irritación ocular que utiliza un modelo de tejido tridimensional epitelial-córnea como humana reconstruida (RHCE). La prueba es capaz de discriminar entre irritante ocular y materiales corrosivos (SGA Categorías 1 y 2 combinados) y aquellos que no requieren etiquetado (GHS No Categoría).

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

Este protocolo se replica el flujo de sangre fisiológica o patológica in vitro para ayudar en la determinación de la respuesta celular en patologías de enfermedades. Mediante la introducción de una cámara de presión aguas abajo de una bomba de sangre de amortiguación, el flujo de sangre a través de la vasculatura puede recapituló e impuso en una monocapa de endotelio vascular o un compañero de la cultura mimética.

En Vitro Modelo de fisiológicos y patológicos de flujo de sangre con aplicación a las investigaciones de remodelado vascular celular

La transfusión y hemostasia de plaquetas se modeló utilizando cámaras de reconstitución de sangre y flujo microfluídico para investigar la función de las plaquetas de los bancos de sangre. Los datos demuestran las consecuencias de la lesión por almacenamiento de plaquetas sobre la hemostasia, in vitro.

Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em&gt; In Vitro</em

cultivo de órgano entero del disco intervertebral (DIV) conserva la matriz extracelular nativa, fenotipos de células, y las interacciones celulares-matriz. A continuación se describe un sistema de cultivo IVD utilizando lumbar del ratón y IVD caudales en sus unidades funcionales de la columna vertebral y varias aplicaciones que utilizan este sistema.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Órgano Cultura Modelo Murino del disco intervertebral

Aquí, se presenta un flujo de trabajo para el análisis de expresión cultura y genes de células endoteliales bajo tensión de esquileo líquido. Incluido es un arreglo físico para simultáneamente y monitoreo de múltiples cámaras de flujo en un entorno controlado y el uso de un RNA de referencia exógena para PCR cuantitativa.

Análisis de expresión génica de las células endoteliales expuestas a estrés mediante múltiples cámaras de placas paralelas flujo del esquileo

Aprende a desarrollar un modelo in vitro que integra rigidez del sustrato y flujo laminar para estudiar la respuesta de células endoteliales. Este sistema permite investigar la mecanotransducción vascular y enfermedades como la aterosclerosis.

Modelo in vitro que integra la rigidez y el flujo del sustrato para estudiar las respuestas de las células endoteliales

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