Name: Experimentos de relajación de RMN 15N para la investigación de la dinámica estructural de proteínas de picosegundos a nanosegundos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Aprende experimentos de relajación de RMN 15N para investigar la dinámica estructural de proteínas desde picosegundos hasta nanosegundos. Este protocolo permite analizar movimientos específicos de residuos en proteínas intrínsecamente desordenadas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo para RMN 15N Experimentos de relajación y hetNOE en el estudio de la dinámica de proteínas

Este protocolo describió la configuración de los experimentos de relajación de RMN 15N por Lakomek et al.69 y Stief et al.70. Nos centramos en las secuencias de pulsos de RMN utilizando un esquema de detección HSQC de sensibilidad mejorada. Los experimentos 15N R1 y R1ρ se implementan como se describe en detalle por Stief et al.70, y el experimento hetNOE es descrito por Lakomek et al.69.
Al configurar los experimentos de relajación de RMN, el 15N R1ρ es el más crítico, ya que elegir un período de relajación máximo demasiado largo o una amplitud de RF demasiado alta del bloqueo de giro puede dañar la sonda. Para el período de relajación, es deseable muestrear la curva de decaimiento completa por igual desde el 100% de intensidad hasta el 25% de intensidad (en comparación con el experimento de referencia). En el caso de proteínas que se relajan lentamente, como las IDP, con 15N T2 veces largas, con frecuencia no será asequible muestrear la curva de desintegración en toda su extensión porque la deposición de potencia en la sonda debe ser limitada.
Para la amplitud de radiofrecuencia (RF) de 15N, teóricamente, cuanto mayor sea la amplitud de RF, νspin-lock, mejor, ya que se pueden reenfocar más procesos de intercambio. Como regla general, los procesos de intercambio más lentos que 1 / (2π νspin-lock ) se pueden reenfocar. Sin embargo, se aplican limitaciones de potencia de RF. Por ejemplo, en nuestra mano, no superaríamos un período máximo de bloqueo de espín de 65 ms cuando se aplica una amplitud de RF de 2 kHz para mantenernos seguros. Al mismo tiempo, la amplitud de RF de bloqueo de espín en un espectrómetro de 600 MHz debe ser superior a 1 kHz, por ejemplo, 1,4 kHz a 600 MHz, lo que ha demostrado ser suficiente para la pequeña proteína globular gb369. Para cubrir los anchos espectrales y evitar efectos de resonancia fuera de resonancia a intensidades de campo más altas, la amplitud de RF correspondiente debe escalar con el campo magnético, por ejemplo, 1,5 veces mayor a 900 MHz (νspin-lock <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67088/67088eq03.jpg" style="margin: auto;"> 2 kHz). Sin embargo, debe permanecer dentro de las limitaciones de la sonda. (Consulte la lista local de limitaciones de potencia del espectrómetro y póngase en contacto con el gerente de su instalación de RMN para obtener asesoramiento).
Para la elección del espaciamiento de los retardos de relajación entre el experimento de referencia (retardo acortado) y el período de retardo más largo (determinado por los factores discutidos anteriormente), preferimos un espaciado igual de los puntos de datos del retardo de relajación y elegimos un número de 8 (si el tiempo de medición asignado y la relación señal-ruido lo permiten). El primer incremento (y los siguientes) estará dominado por los residuos más intensos (y frecuentemente más lentos). Por lo tanto, dependiendo del rango dinámico de la proteína, las señales de RMN de varios residuos en la secuencia de proteínas pueden haber decaído después del período de relajación máxima elegido. Al espaciar equitativamente los puntos de retardo, nos aseguramos de que las curvas de relajación de los residuos que se relajan rápidamente también estén cubiertas por un número suficiente de puntos de datos que muestreen la curva de relajación.
Además, una buena elección del retraso de recuperación es esencial para obtener datos de relajación precisos y evitar daños a largo plazo en la sonda. Elegimos un retardo de recuperación de al menos D1 = 2 s para evitar cualquier daño a la sonda. Para obtener resultados precisos, también se debe dar tiempo suficiente a la polarización longitudinal de la proteína 1H y 15N para que vuelva al equilibrio o al menos a un estado estable y estacionario. El 1H T1 suele variar entre 1 s y 4 s a 600 MHz para una proteína de tamaño pequeño o mediano (hasta 20 kDa); para proteínas más grandes y campos más altos, el 1H T1 aumentará aún más. Para la pequeña proteína globular gb3, encontramos que D1 = 3,5 s es suficiente para los experimentos 15N R1 y R1ρ . Para el IDP pequeño Syb-2 presentado en este protocolo, recientemente demostramos que D1 = 2 s era adecuado70.
El hetNOE de 15N tiene la sensibilidad más baja, ya que la excitación comienza en 15N, y no se aplica 1 H-15N INEPT al comienzo de la secuencia de pulsos. Además, el período de saturación de 1H y el retraso de recuperación de 15N deben ser 5 veces 15N T1 para obtener datos precisos. Mientras que para el IDP Syb-2 presentado aquí, un retardo de saturación/recuperación de 5 s más un retardo de recuperación D1 adicional de 2 s (7 s en total) era suficiente, para proteínas más grandes y/o proteínas deuteradas, este tiempo puede ser sustancialmente más largo, por ejemplo, 10 s o más. Sin embargo, si los datos cualitativos son lo suficientemente buenos, se puede aceptar una ligera compensación sistemática. En ese caso, se pueden obtener resultados razonables ya a 3 veces 15N T1, ya que se alcanzará el 95% de la saturación. En ese caso, los valores hetNOE resultantes mostrarán un desplazamiento sistemático a valores más altos.
En este protocolo, trabajamos con 15N Syb-2 totalmente protonada, que es el más rentable. Se recomienda la deuteración de cadena lateral para reducir el número de vías de relajación y trabajar con los pares de espín de amida de la columna vertebral 1 H-15N más aislados. Sin embargo, al comparar 15N2H Syb-2 y 15N syb-2, observamos muy pocas diferencias entre las muestras deuteradas y las completamente protonadas70. A efectos prácticos, los datos de relajación de la RMN se registran con frecuencia en las muestras marcadas dobles o triples (15N13C o 2H15N13C). Las secuencias de pulsos de RMN discutidas son capaces de reenfocar la evolución del acoplamiento J entre 13C con núcleos de 1H o 15N. Obviamente, también las vías de relajación aumentarán cuando se introduzca el etiquetado 13C. Sin embargo, en nuestras manos, a efectos prácticos, el error introducido, si es que lo hay, es inferior al 5% y podría ser aceptable cuando sólo se necesitan datos cualitativos.
Cuando se trabaja con proteínas de diferentes tamaños para la detección, con frecuencia surge la cuestión de si elegir experimentos70 detectados por HSQC con sensibilidad mejorada o experimentos69 detectados por TROSY. En el caso de las proteínas pequeñas, los experimentos de RMN detectados por HSQC con sensibilidad mejorada ofrecen una ganancia de señal a ruido del doble (siempre que se pueda obtener una buena supresión de agua). En el caso de las proteínas más grandes, los experimentos detectados por TROSY serán los ganadores. El punto de equilibrio es de aproximadamente 20 kDa para las proteínas plegadas. En el caso de los IDP, para los que se pueden obtener constantes de velocidad R2 bajas que aumentan aproximadamente linealmente con el aumento de las longitudes de cadena, el punto de equilibrio puede desplazarse a pesos moleculares más altos. A efectos prácticos, recomendamos implementar los experimentos detectados por HSQC o TROSY con sensibilidad mejorada en caso de duda. A continuación, elija el que proporcione la mejor relación señal-ruido en el primer incremento.
El debate sobre si se deben elegir los experimentos detectados por HSQC o TROSY con sensibilidad mejorada solo se aplica cuando la relación señal-ruido es el criterio principal. Cuando se requieren los anchos de línea más pequeños y la resolución más alta, TROSY siempre ganará. TROSY también ofrece siempre la mejor supresión de agua, ya que se requieren menos pulsos de protones y no se requiere desacoplamiento de protones. Nos remitimos al artículo69 publicado anteriormente para una discusión más extensa.
Una observación más sobre el tema de la supresión del agua. Si bien establecer la ganancia del receptor (rg) en 16 puede ser suficiente en las consolas Bruker Avance NEO, una ganancia del receptor en el rango de 128-256 suele ser deseable para las consolas Bruker Avance (más antiguas). El rg alcanzable (determinado por el comando rga de Bruker) se obtiene frecuentemente a partir de la intensidad de la señal de agua residual al nivel de ruido. Una mala supresión de agua siempre introducirá ruido adicional en los espectros. Por lo tanto, incluso si se puede lograr un rg = 16 en una consola Bruker Avance NEO, la señal de agua restante puede contribuir sustancialmente al nivel de ruido. Por lo tanto, la relación señal-ruido se reduciría. En consecuencia, recomendamos apuntar a un nivel rg de 128-256. Las secuencias de pulsos70 presentadas han sido probadas a 600 MHz y 1200 MHz. Ambas intensidades de campo funcionan con la misma configuración de gradiente, tal como se indica en la secuencia de pulsos. Los recomendamos al menos como un buen punto de partida para una mayor optimización.
Como se mencionó en la introducción, los experimentos de relajación de RMN discutidos cubren solo el rango de tiempo de picosegundos a nanosegundos. Para obtener información sobre la dinámica de microsegundos a milisegundos, nos referimos a los experimentos de dispersión de relajación, los experimentos CPMG y una extensión de los experimentos R1ρ con amplitudes de bloqueo de espín cambiantes (o frecuencias portadoras) 44,46,58,59,60,61,85,86 . La dinámica más lenta que microsegundos puede ser capturada 15N CEST (transferencia de saturación de intercambio químico) RMN62, espectroscopía de intercambio (EXSY, milisegundos a segundos) o RT (tiempo real) RMN (segundos a horas)63,64. El efecto PRE (mejora de la relajación paramagnética) de las sondas paramagnéticas, así como de los acoplamientos dipolares residuales (RDC), se puede utilizar para evaluar todo el rango de dinámicas de ps a ms 65,66,67,68.
Todos estos experimentos cubren solo la dinámica de la columna vertebral. Para investigar la dinámica de la cadena lateral, Kay y sus colaboradores introdujeron otra plétora de experimentos de RMN, proporcionando información sobre la dinámica de la cadena lateral para proteínas de hasta 1 MDa 2,87.
Para obtener más información cuantitativa sobre la dinámica de la columna vertebral de las proteínas, es necesario un análisis combinado de los tres parámetros de RMN, 15N R1, R2 y hetNOE, que a veces involucra incluso otros parámetros, como las constantes de tasa de relajación correlacionadas entre sí. Se han desarrollado diferentes métodos de análisis sofisticados. El llamado enfoque sin modelo se ha aplicado ampliamente en la RMN biomolecular 43,88,89,90,91. Además, el mapeo de densidad espectral puede proporcionar información valiosa 55,92,93. Si bien estos son métodos de análisis potentes para proteínas globulares con un tiempo de correlación rotacional bien definido, su aplicabilidad es limitada para los IDP. Un dominio plegado es necesario para definir un tiempo de correlación rotacional39. Esto se puede eludir parcialmente cuando la función de correlación C(t) se puede modelar mediante la suma de funciones que decaen exponencialmente en caso de que las diferentes escalas de tiempo involucradas puedan estar bien separadas 23,31,84. En ausencia de un tiempo de correlación rotacional bien definido, los enfoques alternativos que implican una distribución de tiempos de correlación, por ejemplo, el análisis IMPACT94 o el análisis DETECTOR95,96, son una alternativa. Además, un análisis combinado de los datos de relajación de la RMN y las simulaciones de MD también es prometedor para los desplazados internos97; En la actualidad, todavía nos enfrentamos a limitaciones de muestreo y campo de fuerza para simulaciones de átomos completos de IDP más grandes31,98.

<table><tbody><tr><td>Espectrómetro Bruker 600 MHz AVANCE III HD&NBSP;</td><td>Bruker</td><td>https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html</td><td>experimentos de RMN realizados&nbsp;</td></tr></tbody></table>

experimentos de relajación de rmn 15n para la investigación de la dinámica estructural de proteínas de picosegundos a nanosegundos

NMR 15N Relaxation Experiments for the Investigation of Picosecond to Nanoseconds Structural Dynamics of Proteins

Experimentos de relajación de RMN 15N para la investigación de la dinámica estructural de proteínas de picosegundos a nanosegundos

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide ...

nmr-15n-relaxation-experiments-for-investigation-picosecond-to

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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15. N CPMG Dispersión De Relajación Para La Investigación De La Dinámica Conformacional De Proteínas En La Escala De Tiempo μs-ms

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Combinando húmedo y Técnicas de laboratorio de simulación para guiar la cristalización de proteínas grandes que contengan espiral de la bobina

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Seccionamiento transversal de arroz maduro (Oryza sativa L.) Núcleos para imágenes de microscopía electrónica de barrido utilizando puntas de pipeta como soporte de inmovilización

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