Name: Neuromodulación simultánea de ultrasonido focalizado y registro de fotometría de fibra en ratón de movimiento libre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprende neuromodulación con ultrasonido focalizado y fotometría de fibra en ratones de movimiento libre. Este método permite registrar dinámicas de calcio como indicador de neuroactividad en tiempo real.

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Este trabajo está financiado en parte por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32371151), el Instituto de Investigación de Innovación de Alto Nivel de Guangdong (2021B0909050004), el Fondo de Investigación Colaborativa del Consejo de Subvenciones de Investigación de Hong Kong (C5053-22GF), el Fondo General de Investigación (15224323 y 15104520), el Fondo de Tecnología de Innovación de Hong Kong (MHP/014/19), la financiación interna de la Universidad Politécnica de Hong Kong (G-SACD y 1-CDJM), y la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Liaoning- Fondo Abierto Conjunto del Laboratorio Estatal Clave de Robótica (2022-KF-22-03). Los autores desean agradecer las instalaciones y el apoyo técnico del Centro Universitario de Investigación en Ciencias de la Vida (ULS) y el Centro Universitario de Investigación en Neurociencia del Comportamiento y de Sistemas (UBSN) de la Universidad Politécnica de Hong Kong.

Todos los procedimientos y el manejo de los animales cumplieron con las pautas éticas de la NSFC y los requisitos de protocolo aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Inteligencia, Ciencia y Tecnología de Guangdong.
1. Preparación del transductor
<ol><li>Prepare una placa piezoeléctrica con un diámetro interior de 3 mm, un diámetro exterior de 7 mm y una frecuencia central de 500 kHz. NOTA: El diámetro exterior se puede ajustar en función de la región específica del cerebro a la que se dirige y debe maximizarse mientras se mantiene la precisión de la estimulación y sin exceder el límite del cráneo del ratón.</li>
	<li>Conecte el cable a los dos lados de la placa piezoeléctrica con pasta de plata epoxi (Figura 1). Después de que la pasta de plata epoxi se haya solidificado, use un multímetro para medir la resistencia en ambos extremos del cable para asegurarse de que sea aproximadamente 0.</li>
	<li>Aplique una capa de cinta adhesiva de doble cara sobre una superficie limpia de lámina de vidrio. Se adhiere a la placa piezoeléctrica y al anillo de cobre, con una altura de 8 mm, un diámetro exterior de 8 mm y un diámetro interior de 7,6 mm, firmemente a la lámina de vidrio. NOTA: El diámetro interior del anillo de cobre está determinado por el tamaño de la placa piezoeléctrica para garantizar que la placa esté cubierta por el anillo de cobre.</li>
	<li>Inserte firmemente el tubo de polipropileno con un diámetro exterior de 3 mm en el centro de la placa piezoeléctrica y adhiéralo firmemente a la lámina de vidrio (Figura 1).</li>
	<li>Prepare una cantidad adecuada de pegamento de resina epoxi y aspírelo. Extraiga el epoxi con una jeringa desechable e inyéctelo lentamente en el anillo de cobre. Espere unas 10 h hasta que el epoxi se haya solidificado (Figura 1).</li>
	<li>Suelde los extremos sueltos de dos cables en el conector de la tuerca de bayoneta con un soldador electrónico. Retire la lámina de vidrio. Limpie la superficie del transductor con alcohol (Figura 1).</li>
</ol>2. Parámetros de informes para FUN
<ol><li>Coloque el hidrófono y el transductor en un tanque de agua lleno de agua desionizada (Figura 2A). Asegúrese de que el haz central (eje Z) del sistema de posicionamiento esté alineado con el eje del transductor. Esta alineación se puede lograr, en primer lugar, descubriendo un campo máximo en el plano focal a través del escaneo 2D; en segundo lugar, identificar un máximo de campo en otro plano con un máximo claro; en tercer lugar, comparar las coordenadas X e Y de los dos máximos y, a continuación, ajustar iterativamente la posición y/o la orientación del transductor si es necesario28.</li>
	<li>Ajuste la punta del hidrófono con la superficie del transductor a una distancia de 1 mm, manteniendo esta distancia constante mientras coloca el hidrófono en el centro del borde derecho del transductor. Inicie el programa de escaneo para capturar el campo acústico libre en el plano XZ (Figura 2B). NOTA: El método de construcción del hidrófono se puede encontrar en https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control.</li>
	<li>Mueva el hidrófono a lo largo del eje Z para determinar las profundidades asociadas con la presión máxima espacial. En este experimento, la presión máxima espacial aparece a una distancia de 3,4 mm de la superficie del transductor; mantenga esta distancia cuando mueva el hidrófono a la esquina inferior derecha del transductor en el plano XY. Encienda e inicie el programa de escaneo para capturar el campo acústico libre en el plano XY (Figura 2B).</li>
	<li>Coloque el transductor en el cráneo de un ratón que se sometió a una cirugía como se describe en el paso 4. Adquiera el campo acústico transcraneal en el plano XZ y el plano XY (Figura 2D) a través del barrido con hidrófono como se describe en 2.1-2.3.</li>
	<li>Lea las amplitudes de presión en el punto focal, que es la región de pico espacial en el campo acústico libre y el campo acústico transcraneal. La amplitud de presión en el punto focal en el campo acústico libre es de 730k Pa, y en el campo acústico transcraneal es de 580k Pa. Lea las dimensiones focales a -3 dB (Figura 2C,E), y la posición en los planos XY y XZ dentro del campo acústico transcraneal para evaluar si el campo acústico de este transductor puede cubrir las áreas cerebrales objetivo.</li>
	<li>Calcule el Índice Mecánico (IM), que está limitado por el documento de orientación de la FDA a estar por debajo de 1.9 para mitigar la cavitación. El cálculo de la IM viene dado por la ecuación: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) donde pr,.3 representa la presión de cresta rarefacción en MPa ajustada por un coeficiente de atenuación de 0,3 dB cm-1 MHz-1, y f0 es la frecuencia de funcionamiento en MHz. La presión rarefaccional máxima del campo transcraneal medida es de 580 kPa, a 3,4 mm del transductor, el f0 es de 500 kHz, por lo que el pr,.3 reducido es de 576,6 kPa. El IM es de 0,82.</li>
	<li>Calcule la intensidad promedio del pulso de pico espacial (Isppa), que debe estar por debajo de 190 W/cm2 en la dirección del plano de acuerdo con el documento de orientación de la FDA. El cálculo de la intensidad viene dado por la ecuación: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq02.jpg" style="margin: auto;">(2) donde psp (t) es la presión acústica variable en el tiempo en la ubicación del pico espacial, Z es la impedancia acústica característica del medio (aproximadamente 1.5 x 106 Rayls para tejidos blandos), y la DP es la duración del pulso. En el caso de la envolvente cuadrada, esto se reduce a la ecuación: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq03.jpg" style="margin: auto;">(3) donde A es la amplitud de la presión de pico espacial. La A medida en la localización focalizada por ultrasonido es de 580 kPa, y la Z del cerebro es de aproximadamente 1,58 x 106 Rayls, por lo que laI sppa de la envoltura cuadrada es de 10,65 W/cm2 y laI sppa de la envoltura sinusoidal es de 10,65 W/cm2.</li>
	<li>Calcule la intensidad media del tiempo de pico espacial (Ispta), que está limitada por el documento de orientación de la FDA a estar por debajo de 430 mW/cm2 en la dirección del avión. El cálculo de la intensidad viene dado por la ecuación: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq04.jpg" style="margin: auto;">(4) donde T es el período de tiempo sobre el cual se calcula el promedio. En el caso de la envolvente cuadrada, esto se reduce a la ecuación: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67090/67090eq05.jpg" style="margin: auto;">(5) donde eltren de pulsos de CC es el ciclo de trabajo del pulso. Aquí, el tren de impulsos de CC es del 1% porque se utilizaron ondas continuas, por lo que I spta es igual a la intensidad media del pulso de pico espacial, 106,5 mW/cm2 para una envolvente cuadrada. El MI, Isppa e Ispta se pueden calcular utilizando el software (Figura 3A). Un código basado en MATLAB para facilitar su uso se puede encontrar en https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation.</li>
	<li>Informe los parámetros de temporización de pulsos, incluidos Amax, duración del pulso, intervalo de repetición de pulsos, duración del tren de pulsos y envolvente (Figura 3B).</li>
</ol>3. Preparación del animal para la cirugía
<ol><li>Peso de ratones transgénicos GCaMP6s machos de 8 semanas de edad, con un peso aproximado de unos 20 g. Prepare una solución que contenga ketamina a 10 mg/mL y xilacina a 2 mg/mL en solución salina estéril. Administrar la solución de ketamina/xilacina por inyección intraperitoneal a una dosis de 100 mg/kg de ketamina y 20 mg/kg de xilacina utilizando una aguja de 26 g y una jeringa desechable de 1 mL. Comience la preparación quirúrgica una vez que el animal no responda a los estímulos dolorosos, como el pellizco de los dedos de los pies.</li>
	<li>Use un fader para recortar el pelo de la cabeza del animal y desinfecte el área con etanol al 70% y povidona yodada antes del procedimiento quirúrgico.</li>
	<li>Coloque el ratón en posición prona sobre el marco estereotáxico y asegúrese de que el cráneo esté nivelado. Coloque un ungüento oftálmico protector sobre los ojos del animal para mantener la humedad.</li>
</ol>4. Procedimiento quirúrgico
<ol><li>Haga una incisión a lo largo de la sutura sagital, comenzando desde el hueso occipital hasta el comienzo del hueso nasal. Use tijeras quirúrgicas para quitar la piel que cubre ambos hemisferios.</li>
	<li>Use solución salina estéril para limpiar el cráneo y eliminar cualquier resto de periostio.</li>
	<li>Aplique peróxido de hidrógeno al 3% sobre el cráneo expuesto con un hisopo de algodón durante aproximadamente 2 s-3 s para crear microporos. Enjuague bien con solución salina estéril y asegúrese de que el área esté completamente seca.</li>
	<li>Cree una craneotomía con orificio de fresa de 0,6 mm de diámetro utilizando una broca estéril esterilizada en autoclave sobre la ubicación del área del cerebro según lo determinado por el atlas estereotáxico alineado con bregma y lambda. Lave cualquier residuo con solución salina estéril y asegúrese de un secado completo. Tenga cuidado de no dañar ningún tejido.</li>
	<li>Inserte la férula de fibra óptica (implante) en el soporte de la sonda y conéctelo al brazo estereotáxico.</li>
	<li>Alinee el implante directamente sobre la región de interés utilizando el brazo estereotáxico. Al insertar la fibra óptica en el tejido cerebral, avance la fibra lentamente a una velocidad de aproximadamente 2 mm/min.</li>
	<li>Mezcle el cemento dental para lograr una viscosidad que permita una fácil aplicación en todo el cráneo. Use un palillo de dientes estéril para esparcir una capa delgada de cemento dental sobre el cráneo y sobre la parte inferior del implante. Deja que se seque por completo.</li>
	<li>Separe el soporte de la sonda con cuidado. Prepare una tubería de polipropileno con una altura de 3 mm, un diámetro exterior de 3 mm y un diámetro interior de 2,6 mm, y luego corte la tubería en toda su longitud.</li>
	<li>Fije el tubo a la parte inferior del implante con unas pinzas. Vierta el polvo de cemento dental en la tubería, asegurándose de una longitud suficiente por encima del implante para registrar la señal de fibra óptica. Agregue el líquido requerido y espere unos minutos para que el cemento dental se solidifique.</li>
	<li>Ubique la abertura de la tubería y sujétela con cuidado para quitarla con pinzas. Prepare la mezcla de cemento dental para la aplicación, asegurándose de que se extienda una capa uniforme y delgada por todo el cráneo. Cubra la mayor superficie posible del cráneo con cemento dental. Espere unos minutos para que el cemento dental se solidifique. NOTA: No permita que el cemento dental entre en contacto con la piel del ratón.</li>
	<li>Perfore tres agujeros (1 mm de diámetro) en el anillo impreso en 3D, divididos uniformemente en el horizonte, con una altura de 7 mm, un diámetro exterior de 10 mm y un diámetro interior de 8,4 mm. Fije los tornillos (de 1 mm de longitud) en sus respectivos orificios.</li>
	<li>Inserte la parte superior del implante en el orificio del transductor prefabricado. Asegúrate de que la pared interior del anillo impreso en 3D sea lisa y, a continuación, colócalo alrededor del transductor colocado en el cráneo del ratón. Asegúrese de que el transductor esté centrado dentro del anillo.</li>
	<li>Aplique cemento dental en la unión entre el anillo y el cráneo, luego espere unos minutos para que el cemento dental se solidifique. Evite colocar el cemento dental en la conexión entre el transductor y el cráneo.</li>
	<li>Retire con cuidado el transductor y apriete firmemente los tornillos. Transfiera el ratón a una jaula caliente y asegúrese de que esté monitoreado hasta que esté completamente recuperado antes de devolverlo a su jaula original.</li>
	<li>Después de la cirugía, administrar Carprofeno subcutáneo (2 mg/kg) para la analgesia y continuar cada 24 h durante 3 días para controlar la inflamación y el dolor. Monitoree a los animales diariamente para detectar cualquier signo de angustia, pérdida de peso anormal, dolor o infección. Normalmente, altercer día después de la cirugía, todos los ratones deberían exhibir un comportamiento normal. Si se observa algún signo de angustia o enfermedad en un ratón después deltercer día, siga las pautas institucionales para la eutanasia.</li>
</ol>5. Estimulación y grabación de señales
<ol><li>A los 7 días después de la cirugía, abra el suministro de oxígeno a la máquina de anestesia con gas y ajuste el regulador de flujo de oxígeno para establecer el flujo de gas a 300-500 mL/min.</li>
	<li>Coloque el ratón en la cámara de inducción y cierre el suministro de gas anestésico a la mascarilla. Gire el dial del vaporizador para ajustar la concentración de anestésico adecuada (2%-2,5%).</li>
	<li>Después de anestesiar el ratón, colóquelo en el marco estereotáxico con una máscara anestésica. Cierre la línea de inducción para permitir que el gas anestésico fluya hacia la máscara anestésica. Ajustar la concentración adecuada de anestésico de mantenimiento (1%-1,5%).</li>
	<li>Limpie la superficie superior del implante con alcohol y, a continuación, inserte el cable de conexión de fibra óptica en el centro del transductor preparado.</li>
	<li>Inyecte agua en el espacio entre el implante y el anillo impreso en 3D con una aguja de 26 G y una jeringa desechable de 1 ml para humedecer el cráneo. Use toallas de papel para absorber el exceso de agua.</li>
	<li>Inyecte un agente de acoplamiento en el espacio entre el implante y el anillo impreso en 3D utilizando una aguja de 26G y una jeringa desechable de 1 ml para facilitar la fácil propagación del ultrasonido desde el transductor hasta el cerebro.</li>
	<li>Conecte el implante al cable de conexión de fibra óptica. Inserte con cuidado el transductor en el área que está llena con un agente de acoplamiento y apriete firmemente los tornillos.</li>
	<li>Coloque el mouse en un campo abierto y permita que se despierte. Conecte el transductor al sistema de excitación ultrasónica y conecte el cable de conexión de fibra óptica al sistema de grabación de fibra óptica, lo que permite la libertad de movimiento del mouse. NOTA: El latiguillo de fibra óptica tiene una longitud de 2 m y un diámetro de 1,25 mm. La intensidad de la luz para el canal 405 es de 20 μW y para el canal 470 es de 40 μW.</li>
	<li>Active tanto el dispositivo de excitación ultrasónica como el sistema de grabación de fibra óptica para sincronizar la modulación neuronal ultrasónica con la grabación de señales de fibra óptica.</li>
</ol>

Protocolo integrado para la fotometría FUN y de fibra en ratones que se mueven libremente

<ol><li>Wang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+for+noninvasive%2C+focal+pharmacologic+neurointervention%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound for noninvasive, focal pharmacologic neurointervention.</a> Front Neurosci. 14, 514541(2020).</li>
<li>Bystritsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+low-intensity+focused+ultrasound+pulsation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">A review of low-intensity focused ultrasound pulsation.</a> Brain stimulation. 4 (3), 125-136 (2011).</li>
<li>Di Ianni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ultrasound+neuromodulation+in+awake+and+freely+behaving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">High-throughput ultrasound neuromodulation in awake and freely behaving rats.</a> Brain stimulation. 16 (6), 1743-1752 (2023).</li>
<li>Legon, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound+modulates+the+activity+of+primary+somatosensory+cortex+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans.</a> Nat Neurosci. 17 (2), 322-329 (2014).</li>
<li>Badran, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonication+of+the+anterior+thalamus+with+mri-guided+transcranial+focused+ultrasound+%28tfus%29+alters+pain+thresholds+in+healthy+adults%3A+A+double-blind%2C+sham-controlled+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">Sonication of the anterior thalamus with mri-guided transcranial focused ultrasound (tfus) alters pain thresholds in healthy adults: A double-blind, sham-controlled study.</a> Brain stimulation. 13 (6), 1805-1812 (2020).</li>
<li>Yaakub, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound-mediated+neurochemical+and+functional+connectivity+changes+in+deep+cortical+regions+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound-mediated neurochemical and functional connectivity changes in deep cortical regions in humans.</a> Nat Comm. 14 (1), 5318(2023).</li>
<li>Murphy, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tool+for+monitoring+cell+type-specific+focused+ultrasound+neuromodulation+and+control+of+chronic+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A tool for monitoring cell type-specific focused ultrasound neuromodulation and control of chronic epilepsy.</a> Proc Natl Acad Sci. 119 (46), e2206828119(2022).</li>
<li>Niu, X., Yu, K., He, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+focused+ultrasound+induces+sustained+synaptic+plasticity+in+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimulation%22%5BJournal%5D)">Transcranial focused ultrasound induces sustained synaptic plasticity in rat hippocampus.</a> Brain Stimulation. 15 (2), 352-359 (2022).</li>
<li>Tufail, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+pulsed+ultrasound+stimulates+intact+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits.</a> Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+torpor-like+hypothermic+and+hypometabolic+state+in+rodents+by+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metabol%22%5BJournal%5D)">Induction of a torpor-like hypothermic and hypometabolic state in rodents by ultrasound.</a> Nat Metabol. 5 (5), 789-803 (2023).</li>
<li>Kubanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote%2C+brain+region-specific+control+of+choice+behavior+with+ultrasonic+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Remote, brain region-specific control of choice behavior with ultrasonic waves.</a> Sci Adv. 6 (21), 4193(2020).</li>
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<li>Xian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+deep+neural+circuits+with+sonogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Modulation of deep neural circuits with sonogenetics.</a> Proc Natl Acad Sci. 120 (22), e2220575120(2023).</li>
<li>Mohammadjavadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+peripheral+auditory+pathway+activation+does+not+affect+motor+responses+from+ultrasound+neuromodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+stimulation%22%5BJournal%5D)">Elimination of peripheral auditory pathway activation does not affect motor responses from ultrasound neuromodulation.</a> Brain stimulation. 12 (4), 901-910 (2019).</li>
<li>Harris, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophone+measurements+for+biomedical+ultrasound+applications%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Ultrasonics+Ferroelect+Freq+Cont%22%5BJournal%5D)">Hydrophone measurements for biomedical ultrasound applications: A review.</a> IEEE Trans Ultrasonics Ferroelect Freq Cont. 70 (2), 85-100 (2022).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Este enfoque combina FUN con el registro de fotometría óptica, lo que permite investigar la función cerebral del ratón y el mecanismo FUN in vivo . Se describe el proceso operativo completo, desde la fabricación del transductor hasta los procedimientos quirúrgicos, lo que permite a los investigadores realizar DIVERSIÓN de forma independiente desde fuera del campo.
Un aspecto crucial del protocolo es garantizar que el implante óptico se inserte suavemente en el transductor, que el cemento dental que atraviesa el cráneo sea lo suficientemente delgado para la penetración del ultrasonido en el cerebro, que el implante óptico esté conectado de forma segura al cráneo para evitar que se desprenda durante el experimento y que la salida de energía del transductor sea suficiente para una neuromodulación efectiva. El espesor del cemento dental que rodea el implante debe ser igual o menor que el diámetro del orificio del transductor. Por lo tanto, es aconsejable utilizar la misma tubería de polipropileno tanto para el proceso de fabricación del transductor como para la cirugía. Dado que la tubería de polipropileno no se adhiere al cemento dental, se selecciona moldear el cemento dental alrededor del implante, con un corte lateral, para facilitar la extracción fácil de la tubería de polipropileno.
El registro electrofisiológico y el registro de fotometría óptica son tecnologías comúnmente utilizadas para monitorear la actividad cerebral in vivo, que ofrecen una alta resolución espacio-temporal. Sin embargo, el registro electrofisiológico captura la señal de actividad de disparo de las neuronas conectadas directamente a los electrodos. Las ondas de ultrasonido podrían hacer vibrar directamente los electrodos, induciendo efectos de confusión innecesarios. Afortunadamente, la tecnología de fotometría de fibra, que es menos invasiva, captura la actividad de las neuronas debajo de ella, lo que podría reducir el efecto de confusión de la vibración del ultrasonido en el implante 7,19,26. Como resultado, la tecnología de neuromodulación simultánea por ultrasonido focalizado y registro de fotometría de fibra en ratones que se mueven libremente permite el estudio de los mecanismos in vivo de la neuromodulación ultrasónica y permite la observación de las respuestas conductuales de los ratones sin la interferencia de la anestesia.
Sin embargo, la resolución espacial de la fotometría de fibra está restringida ya que no puede monitorear la actividad de los subcircuitos subcelulares y microcircuitos24. Además, proporciona una representación indirecta de la actividad neuronal, ya que no registra directamente las señales eléctricas producidas por la actividad neuronal.

La neuromodulación de ultrasonido focalizado (FUN) se ha convertido en una herramienta de neuromodulación prometedora y versátil, que permite explorar la función y la organización del cerebro con un gran potencial1. FUN es capaz de entregar energía acústica de forma no invasiva a cualquier posición dentro del tejido cerebral conuna precisión milimétrica. Su capacidad para modular transitoria y reversiblemente la neuroactividad en la estructura cerebral profunda, con alta especificidad espacio-temporal, de forma segura y no invasiva, presenta un atractivo atributo que complementa la técnica de neuromodulación clínica existente3. Se ha confirmado la demostración de una FUN efectiva tanto en sujetos humanos 4,5,6 como en varios modelos animales, que abarcan especies pequeñas 7,8,9,10 y grandes 11,12,13,14,15,16,17.
Al observar el efecto de FUN en tipos neuronales específicos a través de la monitorización de la neuroactividad durante FUN, podemos profundizar en el mecanismo detrás de este proceso18,19. La fotometría de fibra basada en indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) se ha utilizado ampliamente en la última década como un método versátil para rastrear la actividad poblacional específica del tipo de célula in vivo 20,21,22,23,24. Por lo tanto, la aplicación simultánea de FUN y fotometría de fibra puede enriquecer significativamente nuestra comprensión integral de FUN. Sin embargo, el uso de transductores individuales voluminosos requiere fijación a un marco, mientras que los animales necesitan ser anestesiados e inmovilizados en un marco estereotáxico 7,19,25,26. Este enfoque puede no ser adecuado para ciertos tipos de experimentos relacionados con la percepción, la cognición y la evaluación del comportamiento. Es crucial establecer un protocolo que facilite la amalgama de FUN y fotometría de fibra sin impedir la movilización de los ratones7.
En este estudio, presentamos un protocolo refinado utilizado en nuestros estudios anteriores para complementar sin problemas y con gracia el método para diseñar un solo transductor y su fijación temporal en los ratones, así como la fijación segura de un implante de fibra óptica para facilitar el paso suave del transductor 7,19,26. Permite a los investigadores registrar la neuroactividad modulada por ultrasonido en ratones sin restricciones. Optamos por una envoltura más lisa, como una envoltura sinusoidal, para reducir la confusión auditiva27. La viabilidad de este protocolo se confirma mediante el registro simultáneo de la neuroactividad en el núcleo talámico anterior de ratones que se mueven libremente durante FUN. Demuestra que la energía del transductor es suficiente para lograr la neuromodulación, y los métodos de fijación para el implante de fibra óptica y el transductor pueden garantizar su estabilidad.

<table><tbody><tr><td>Jeringa desechable de 1 ml</td><td>DOUBLE-DOVE</td><td>1 ml</td><td>Agujas de inyección Aguja</td></tr><tr><td>de calibre 26</td><td>Jin mao</td><td>JM-J02</td><td>Agujas de preparación</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Dong de alcohol&nbsp;</td><td>0.7</td><td>Desinfectar</td></tr><tr><td>el alcohol</td><td>Dong de alcohol&nbsp;</td><td>0.75</td><td>Limpie la superficie del transductor</td></tr><tr><td>Tuerca de bayoneta Conector</td><td>Risym</td><td>75-5</td><td>El otro extremo del cable de conexión está conectado al dispositivo de excitación ultrasónica anillo de</td></tr><tr><td>cobre</td><td>Guowei Materiales metálicos Guowei</td><td>Diámetro exterior, espesor de la pared, altura (8 mm, 0,2 mm, 8 mm)</td><td>La carcasa protectora exterior del transductor</td></tr><tr><td>jeringa desechable</td><td>DOUBLE-DOVE</td><td>1ml</td><td>La inhalación de resina epoxi permite inyectar pequeñas cantidades precisas en la tubería de cobre</td></tr><tr><td>cinta de doble cara</td><td>3M</td><td>3M55236</td><td>Se utiliza para fijar el transductor y el cable para garantizar que el pegamento epoxi plata no se mueva antes del secado</td></tr><tr><td>soldador electrónico</td><td>Victor</td><td>868A+</td><td>Los hilos soldados están conectados al</td></tr><tr><td>pegamento de resina epoxi</td> BNC <td>Kraft</td><td>K 9741</td><td>Selle la parte posterior del transductor pasta</td></tr> de <tr><td>plata epoxi</td><td>Vonroll</td><td>CB-052</td><td>El cable está unido a los polos positivo y negativo de la lámina cerámica piezoeléctrica y la resistencia se mantiene baja</td></tr><tr><td></td><td>JOQO</td><td>YP-7021</td><td>Retire el vello de la cabeza de la</td></tr><tr><td>máquina de anestesia de gas</td><td>del ratón RWD</td><td>R500</td><td>Se utiliza para la anestesia en lámina de vidrio de ratones</td></tr><tr><td></td><td>Vidrio cuadrado</td><td>de 80 mm * 80 mm</td><td>Se puede usar una superficie de operación temporal para colocar cerámicas piezoeléctricas y cables para recubrir la superficie de la placa de vidrio con cinta de doble cara</td></tr><tr><td>ketamina / xilacina &nbsp;</td><td>Shutai/shengxin</td><td>Zoletil 50/2ml*10</td><td>Anestesiar el ratón</td></tr> agente <tr><td>de acoplamiento médico</td><td>Bestman</td><td>120g</td><td>El acoplante actúa como medio para conducir la señal de ultrasonido</td></tr> ratón <tr><td></td><td>Bai shi tong</td><td>GCaMp6</td><td>Sujeto de prueba</td></tr><tr><td>ungüento oftálmico</td><td>Yun Zhi</td><td>0.5% x 2.5 g x1</td><td>Humedece el área de los ojos para prevenir la ceguera</td></tr><tr><td>&nbsp; placa piezoeléctrica</td><td>Fábrica de electrónica Jiaming Diámetro</td><td>, poro, espesor (7 mm, 3 mm, 3,56 mm)</td><td>La energía eléctrica se emite en forma de tubo de</td></tr><tr><td>polipropileno</td> ultrasónico Fábrica de <td>tubos Baihao</td><td>Diámetro exterior, diámetro interior, longitud (3 mm, 2 mm, 500 mm)</td><td>Evite que la resina epoxi tape los agujeros y deje los agujeros</td></tr><tr><td>povidona-yodo</td><td>lefeke</td><td>500ml</td><td>Desinfectar</td></tr><tr><td>registro de señal de fibra</td><td>Thinker Tech Nanjing Biotech</td><td>Sistema de grabación de fibra óptica de un solo canal de tres colores</td><td>Registre señales de fotometría de fibra</td></tr><tr><td>marco estereotáxico</td><td>RWD</td><td>68805</td><td>Fije la cabeza del ratón y localice la región del cerebro</td></tr><tr><td>solución salina estéril</td><td>Shijiazhuang si yao</td><td>500ML, 4.5g</td><td>Como solvente, disuelve la</td></tr><tr><td>estimulación del medicamento del ultrasonido &nbsp;</td><td>Tecnología de cerebro profundo</td><td>DB-USNM</td><td>Proporciona una entrada estable a la</td></tr><tr><td>máquina de pesaje</td> del transductor <td>Qin bo shi</td><td>1718</td><td>Pesar el cable del ratón</td></tr><tr><td></td><td>Jinpeng Cable Factory</td><td>0,3 mm2</td> <td>se suministra al transductor</td></tr></tbody></table>

neuromodulación simultánea de ultrasonido focalizado y registro de fotometría de fibra en ratón de movimiento libre

Simultaneous Focused Ultrasound Neuromodulation and Fiber Photometry Recording in Free-Moving Mouse

La neuromodulación por ultrasonido focalizado (FUN) representa un enfoque prometedor para la perturbación no invasiva de los circuitos neuronales en regiones cerebrales profundas. Es compatible con la mayoría de las modalidades existentes para monitorizar las funciones cerebrales in vivo. La integración con las modalidades de registro de la función cerebral no solo nos permite abordar los órdenes y trastornos de funciones cerebrales específicas con retroalimentación de circuito cerrado, sino que también nos proporciona información mecanicista sobre la diversión en sí. Aquí, proporcionamos un protocolo modificado, simple, confiable y robusto para la aplicación simultánea de FUN y fotometría de fibra Registro de fluorescencia GCaMP6s en ratones que se mueven libremente. Esto implica la fabricación de un transductor único de buen tamaño y su colocación temporal en los ratones, junto con la fijación segura de un implante de fibra óptica para facilitar el paso suave del transductor. La combinación de FUN y fotometría de fibra proporciona el registro óptico de las respuestas de los circuitos neuronales a FUN en tiempo real en regiones profundas del cerebro. Para demostrar la eficacia de este protocolo, se utilizaron ratones Thy1-GCaMP6s como ejemplo para registrar la neuroactividad en el núcleo talámico anterior durante la FUN mientras los ratones se mueven libremente. Creemos que este protocolo puede promover el uso generalizado de FUN tanto en el campo de la neurociencia como en el campo de la ecografía biomédica.

La distribución de la presión acústica en el campo acústico libre en el plano XY y el plano XZ situados a 3,4 mm de distancia de la superficie del transductor, correspondiente a la posición del núcleo talámico anterior del ratón, se muestra en la Figura 2B,C. Estas mediciones se adquirieron a través del escaneo de hidrófonos en el dominio XY y el dominio XZ. La distribución de la presión acústica en el campo acústico transcraneal en el plano XY y el plano XZ situados a 3,4 mm de distancia de la superficie del transductor se muestra en la Figura 2D,E. La presión acústica libre medida es de 730 kPa, y la presión acústica transcraneal medida es de 580 kPa para una frecuencia central de 500 kHz. El grosor del cráneo medido es de aproximadamente 0,2 mm, en promedio. Suponemos que la relación de dispersión es aproximadamente lineal, por lo que el cráneo tiene un coeficiente de atenuación de 19,98 dB/cmMHz. El transductor ligero, que pesa alrededor de 1,66 g, permite que el ratón se mueva con facilidad, lo que facilita la observación del comportamiento de respuesta del ratón bajo FUN y el rastro de movimiento.
Las señales de fibra óptica se registraron bajo FUN (Figura 4B,D), siendo la envolvente cuadrada y sinusoidal, respectivamente. En el experimento se utilizaron cinco ratones machos. El cuadrado duró 300 ms, mientras que el sinusoidal continuo duró 471 ms, lo que puede garantizar que la energía total sea la misma en dos FUNs diferentes (Figura 4A,C). Una mejora en la señal de fibra óptica indica un aumento en la actividad neuronal. La respuesta neuronal es rápida bajo el FUN, lo que sugiere que el transductor tiene suficiente energía y excelentes capacidades de enfoque.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig01.jpg"> Figura 1: Proceso de producción del transductor. Esto implica, a su vez, conectar una lámina piezoeléctrica a un cable y luego empaquetarla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig02v2.jpg"> Figura 2: Configuración y caracterización de la medición del campo ultrasónico para el transductor ultrasónico. (A) La configuración para la medición del campo de ultrasonido incluye un hidrófono, un sistema de motor, un software de control, un generador de señales y un osciloscopio. (B, D) Diagrama esquemático de las mediciones de transductores ultrasónicos en campos acústicos libres y transcraneales y los resultados de las mediciones de campos sonoros transversales y longitudinales. (C, E) Diagrama del campo sonoro transversal en la posición focal del transductor, con la línea roja que indica el campo sonoro en la posición de -3 dB. (F, G) Diagrama de forma de onda de la salida medida por el hidrófono para el transductor. El área dentro de la caja discontinua roja y el área dentro de la caja discontinua azul representan los períodos antes de que la forma de onda alcance una amplitud estable y el período de timbre del transductor al final, respectivamente. El área dentro del cuadro discontinuo naranja representa la parte estable de la forma de onda, que se utiliza para calcular la amplitud de la presión, anotada como p. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig02largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig03.jpg"> Figura 3: Software de cálculo y parámetro de ultrasonido. (A) Una interfaz casera de cálculo de parámetros de ultrasonido. Se calcularon MI, Isppa, yI spta . La interfaz se puede obtener de https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. (B) Esquemas de formas de onda de presión ultrasónica. Se utiliza una envolvente de pulso sinusoidal y una envolvente de pulso rectangular. El período (T) representa la duración de un solo ciclo de la frecuencia de funcionamiento. Un pulso, conocido como sonicación continua única, dura una duración específica llamada duración del pulso (PD). Por lo general, los pulsos se repiten en una secuencia conocida como tren de pulsos. El intervalo de tiempo entre dos pulsos consecutivos en un tren de pulsos se denomina intervalo de repetición de pulsos (PRI), calculado como el recíproco de la frecuencia de repetición de pulsos (PRF). Toda la secuencia de pulsos, conocida como tren de pulsos, tiene una duración específica conocida como duración del tren de pulsos. El intervalo de tiempo significa la duración de un solo intento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67090/67090fig04v2.jpg"> Figura 4: Señal de fotometría de fibra durante FUN. (A, C) Parámetros ecográficos envueltos por cuadrado (B) y sinusoidal (D). (B, D) La señal de fotometría de fibra respectivamente durante FUN de (A) y (C). La sombra verde es la duración de la DIVERSIÓN. La línea continua es la media, y los tonos de azul y rojo son la media y la desviación estándar de las señales registradas. En el experimento se utilizaron cinco ratones machos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67090/67090fig04largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El protocolo incluye la fabricación de transductores, la notificación de parámetros, el procedimiento quirúrgico y el registro de señales para todo el flujo de trabajo operativo de neuromodulación de ultrasonido focalizado concurrente y registro de fotometría de fibra en ratones que se mueven libremente.

Neuromodulación simultánea de ultrasonido focalizado y registro de fotometría de fibra en ratón de movimiento libre

Focused ultrasound neuromodulation (FUN) represents a promising approach for non-invasive perturbation of neuronal circuits at deep brain regions. It is ...

simultaneous-focused-ultrasound-neuromodulation-fiber-photometry

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra un método para registrar la actividad neuronal en un ratón que se mueve libremente utilizando fotometría de fibra. En este método, las neuronas de una región específica del cerebro expresan un indicador de calcio codificado genéticamente. Se aplica un estímulo a esta región del cerebro y se mide el cambio dependiente del estímulo en la fluorescencia para identificar la actividad neuronal.

Registro de la actividad neuronal en ratones que se mueven libremente mediante fotometría de fibra

Fuente: Maruoka, H., et. al. Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos. J. Vis. Exp.  (2022) Este video muestra un procedimiento de microscopía de dos fotones para obtener imágenes de la actividad neuronal y la dinámica microglial en un ratón despierto durante la estimulación visual, destacando los transitorios de calcio y las interacciones celulares.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en un ratón despierto

Este protocolo detalla cómo implementar y realizar grabaciones de fotometría multifibra, cómo corregir artefactos independientes del calcio y consideraciones importantes para la toma de imágenes de fotometría de doble color.

Fotometría multifibra para registrar la actividad neuronal en animales en movimiento libre

Este protocolo describe la cuantificación de las variaciones hemodinámicas cerebrales volumétricas en el cerebro del ratón mediante ultrasonido funcional (fUS). Los procedimientos para el mapa de activación funcional 3D después de la estimulación sensorial, así como la conectividad funcional en estado de reposo se proporcionan como ejemplos ilustrativos, en ratones anestesiados y despiertos.

Activación 3D de todo el cerebro y mapeo de conectividad funcional en ratones utilizando imágenes de ultrasonido funcional transcraneal

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Utilizando un enfoque totalmente óptico, se induce un accidente cerebrovascular isquémico mientras se registra simultáneamente la actividad neuronal de Ca2+ utilizando un biosensor fluorescente en el núcleo de accidente cerebrovascular emergente de un ratón despierto y que se comporta.

Fototrombosis y fotometría de fibra simultáneas para inducir y monitorear el accidente cerebrovascular isquémico en ratones que se comportan

Este protocolo proporciona una descripción completa de un método para el registro simultáneo de señales de calcio de neuronas y astrocitos en múltiples regiones cerebrales relacionadas con la memoria y demuestra su aplicación en un paradigma de aprendizaje y comportamiento de la memoria.

Un método de fotometría de fibra bicolor para registrar la actividad de las neuronas astrocitos en múltiples regiones cerebrales durante comportamientos de aprendizaje y memoria

Este protocolo proporciona un método integrado que incluye la administración viral, la implantación de optrode, la inducción fototrombótica, el registro simultáneo de la actividad de astrocitos y neuronales, y la estimulación optogenética de los astrocitos. Este método integrado tiene como objetivo proporcionar una investigación simultánea de la relación astrocito-neurona a lo largo de las etapas agudas a crónicas del ictus isquémico.

Un método integrado para el modelado fototrombótico del ictus y el registro in vivo de la actividad neuronal y astrocítica en ratones en comportamiento

Este nuevo método permite la grabación simultánea intracelular de una motoneuron adulto solo ratón y la medición de la fuerza producida por sus fibras musculares. La investigación combinada de las propiedades eléctricas y mecánicas de las unidades motoras en los animales normales y genéticamente modificadas es un gran avance para el estudio del sistema neuromuscular.

Grabación simultánea intracelular de una motoneurona lumbar y la Fuerza producida por su unidad motora en el ratón adulto<em&gt; En vivo</em

Se describen procedimientos para realizar registros simultáneos del potencial o corriente de membrana y los cambios en la concentración de calcio intracelular. Las neuronas del núcleo supraquiasmático se llenan con el indicador de calcio bis-fura-2 mediante un electrodo de pinza de parche en la configuración de pinza de parche de toda la célula.

Registro electrofisiológico simultáneo e imágenes de calcio de neuronas del núcleo supraquiasmático

Aprende neuromodulación con ultrasonido focalizado y fotometría de fibra en ratones de movimiento libre. Este método permite registrar dinámicas de calcio como indicador de neuroactividad en tiempo real.

Neuromodulación simultánea de ultrasonido focalizado y registro de fotometría de fibra en ratón de movimiento libre

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