Determinación de la función ciliar y la impermeabilidad de la membrana del epitelio pseudoestratificado de la vía aérea pulmonar

Nuestra investigación tiene como objetivo medir dos propiedades biofísicas críticas del epitelio pseudoestratificado de las vías respiratorias, que se pueden obtener diferenciando células epiteliales bronquiales humanas normales en una interfaz aire-líquido. Identificamos diferentes características de diferentes virus respiratorios mediante el uso de epitelio pseudoestratificado de la vía aérea. Por ejemplo, la inflamación del citoesqueleto provocada por el virus respiratorio sincitial, que es un mecanismo no canónico de la bronquiolitis.

También identificamos que la hiperplasia de células caliciformes aumenta la replicación del SARS-CoV-2 en el epitelio de las vías respiratorias por enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Nos centramos en dilucidar el mecanismo de modulación de la señalización del citoesqueleto impulsada por el virus respiratorio sincitial para identificar nuevas dianas terapéuticas para combatir la infección por VRS y la bronquiolitis inducida por virus. Para comenzar, tome una suspensión de células epiteliales bronquiales humanas normales, o NHBE.

Con una pipeta P200, añada 50.000 células resuspendidas en 200 microlitros de medio completo de células epiteliales de las vías respiratorias, o AEC, en el lado apical del inserto. Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo celular de dióxido de carbono humidificado al 85% y al 95%. Una vez que las células estén confluentes, transfiera los insertos a un pocillo vacío con pinzas estériles.

Con una pipeta P1000, aspire todo el medio AEC basal. A continuación, se añadan 500 microlitros de medio de diferenciación completo de ALI fresco suplementado con 2% de penicilina-estreptomicina y 1% de anfotericina B al pocillo basal. Con pinzas estériles, transfiera los insertos al pocillo basal con el medio ALI completo agregado.

Con una pipeta P200, aspire suavemente el medio AEC apical del pocillo e incube. Después de 48 horas, transfiera los insertos a un pocillo vacío con pinzas estériles. Con una pipeta P1000, aspire el medio antiguo y añada 500 microlitros de medio ALI completo fresco.

Vuelva a colocar los insertos en el pocillo con medio fresco utilizando pinzas estériles. El día 26, con una pipeta P200, añadir 100 microlitros de DPBS en la cara apical de los insertos. Incubar a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo celular humidificada durante 30 minutos.

A continuación, aspire el DPBS con una pipeta P200. Para comenzar, encienda el microscopio, la computadora conectada y la cámara de entorno. Abra la puerta de la cámara y coloque la placa que contiene los insertos con células NBHE en la platina del microscopio.

Una vez que la placa esté en el escenario, cierre la cámara. Luego, use la perilla de operación de la platina del microscopio para mover la placa y mostrar los insertos. En la pantalla de la computadora, haga clic en el icono del sistema SAVA para abrir el programa SAVA.

En la interfaz del software, haga clic en Configurar experimento. En la siguiente pestaña, haga clic en Crear experimento. A continuación, en la nueva pestaña, introduzca el directorio en el que se almacenarán los datos en el campo Introducir nombre del directorio del experimento y proporcione detalles en el campo Introducir descripción del experimento y, a continuación, haga clic en Aceptar. Ahora, haga clic en el experimento que se creó y se muestra en el directorio en la sección Experimentos.

A continuación, haga clic en Modificar y proporcione los detalles de la muestra en el campo Descripción de la muestra. Haga clic en Agregar y, a continuación, haga clic en Salir para salir de la pestaña. En la interfaz principal del software, seleccione el experimento creado en el menú desplegable de la ranura Experimento.

Luego, haga clic en Grabar video para monitorear la frecuencia de latido ciliar en la pantalla de la computadora. La pantalla mostrará el movimiento ciliar enfocado. Para cada inserción, grabe seis campos aleatorios diferentes durante 2,1 segundos a 120 fotogramas por segundo.

Haga clic en Guardar video para monitorear los datos de frecuencia de latido ciliar. Para analizar los datos, haga clic en Analizar video en la interfaz del software. Y en la siguiente pestaña, haga clic en Aceptar. Luego vaya a la siguiente pestaña y haga clic en Analizar todo.

Descargue la hoja de cálculo generada para cada experimento en la carpeta Adquisición de datos SAVA del equipo. Tome la frecuencia media gaussiana para la presentación de datos. La frecuencia de los latidos ciliares alcanzó al menos tres hercios tanto para el epitelio de las vías respiratorias de los adultos sanos como para los pacientes con EPOC, mostrando una función ciliar comparable.

Para comenzar, encienda el ohmímetro EVOM2 voltios usando el interruptor de encendido. Conecte la resistencia de prueba al EVOM2 en la ranura de entrada. Supervise la lectura en la pantalla EVOM2.

Si la lectura está por encima o por debajo de 1.000, gire el interruptor ADJ en el EVOM2 con pinzas hasta que muestre una lectura uniforme de 1.000 para calibrar el dispositivo. Ahora, tome un inserto vacío para la lectura de control experimental. Con una pipeta P200, añada 100 microlitros de DPBS en el lado apical del inserto vacío.

A continuación, añada 500 microlitros de DPBS en el lado basal con una pipeta P1000. A continuación, desconecte la resistencia de prueba y conecte el electrodo STX2 a la ranura de entrada del EVOM2. A continuación, limpie suavemente el electrodo STX2 con etanol al 70%.

Inserte el electrodo STX2 en el inserto vacío con DPBS, manteniendo la pata del electrodo más corta en la parte apical y la pata del electrodo más larga en la parte basal. Ahora, registre la lectura estable en la pantalla EVOM2. A continuación, con una pipeta P200, añada 100 microlitros de DPBS en el lado apical del inserto.

Inserte el electrodo STX2 en el inserto con el epitelio diferenciado de las vías respiratorias de 26 días, como se muestra anteriormente. A continuación, registre la lectura estable en la pantalla EVOM2. Los valores de resistencia eléctrica transepitelial aumentaron en adultos con EPOC, lo que indica una mayor impermeabilidad de la membrana en la EPOC.