Name: Fabricación y caracterización de parches de microagujas para la carga y entrega de exosomas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Aprende a fabricar parches de microagujas para la carga y entrega eficiente de exosomas. Este método mejora la estabilidad de los exosomas mediante preservación en seco y permite su aplicación clínica directa.

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F.L.Q. agradece el apoyo del Programa Pionero de Investigación y Desarrollo de Zhejiang (2022C03031), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFA0910103), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (22274141, 22074080), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2022ZD28) y el Programa de Becarios Taishan de la Provincia de Shandong (tsqn201909106). H.C. agradece el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82202329). Los autores reconocen el uso de instrumentos en la Instalación Central de Instrumentación Compartida en el Instituto de Medicina de Hangzhou (HIM) de la Academia China de Ciencias.

Este estudio no requiere autorización ética, ya que la piel de cerdo utilizada para los experimentos descritos en la sección 3 se compró como orejas de cerdo comestibles en el mercado y no se obtuvo de animales de experimentación.
1. Aislamiento de exosomas
<ol><li>Cultivo celular<ol><li>Cultive células de cáncer epitelial de ovario de ratón ID8 en el medio de cultivo Eagle Medium Modified (DMEM) de Dulbecco que contiene un 10% de suero fetal bovino y una solución de penicilina-estreptomicina al 1% (100×) (ver Tabla de Materiales) en placas de Petri con un diámetro de 15 cm.</li>
		<li>Incubar las células ID8 en una incubadora de CO2 (ver Tabla de Materiales) a 37 °C y 5% de CO2 hasta que la densidad celular alcance el 90%.</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento de exosomas<ol><li>Retire el medio de cultivo de las placas de Petri y lávelas dos veces con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco. Añadir 20 mL de DMEM sin suero fetal bovino (ver Tabla de Materiales) y solución de penicilina-estreptomicina (ver Tabla de Materiales). Continuar la incubación a 37 °C y 5% de CO2 durante 48 h.</li>
		<li>Recoja el sobrenadante de cultivo celular de 20 placas de Petri de 15 cm de diámetro. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante para eliminar las células libres.</li>
		<li>Centrifugar a 2000 x g durante 10 min 4 °C y recoger el sobrenadante para eliminar los restos celulares.</li>
		<li>Conecte el sistema de filtración al vacío desechable de 0,22 μm (consulte la tabla de materiales) a la bomba de vacío de agua circulante (consulte la tabla de materiales). Cree un vacío para permitir que el sobrenadante pase a través de la membrana de poliéter sulfona de 0,22 μm y entre en la cámara inferior del sistema de filtración, eliminando eficazmente las vesículas o impurezas mayores de 0,22 μm del sobrenadante.<ol><li>Para conectar la bomba de vacío, encienda el interruptor de la bomba y luego conéctelo a la entrada de aire del sistema de filtración al vacío. Al cerrar, desconecte primero la conexión con la bomba y luego apague la bomba de vacío. Este procedimiento ayuda a evitar el reflujo de la bomba de vacío y la contaminación del fluido de cultivo.</li>
		</ol></li>
		<li>Añadir 15 mL de sobrenadante al tubo interior del tubo de ultrafiltración de 100 kDa (ver Tabla de Materiales). Centrifugar a 3500 x g durante 10 min a 4 °C y retirar el líquido del tubo exterior. NOTA: Retenga las partículas de más de 100 kDa en la membrana del tubo interior, mientras que las proteínas de menos de 100 kDa se centrifugarán al tubo exterior junto con la solución. Los exosomas eran mayores de 100 kDa y se agregaron en la membrana del tubo interno.</li>
		<li>Repita los pasos anteriores hasta que el volumen total del líquido esté dentro de los 5 ml. Recoja el líquido de la cámara de aire y agregue 1 ml de DPBS. Utilice una pipeta para pipetear repetidamente en el tubo interior, asegurando la resuspensión de los exosomas adjuntos en DPBS, y luego recójalos.</li>
		<li>Centrifugar a 10000 x g durante 60 min a 4 °C y transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 6 mL de cierre rápido (ver Tabla de Materiales). Selle el tubo con un sellador térmico.</li>
		<li>Centrifugar a 100.000 x g durante 2 h 4 °C utilizando una ultracentrífuga (ver Tabla de Materiales). Abra el tubo de centrífuga de cierre rápido, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 μL de DPBS. Esta es la solución del exosoma. NOTA: Durante el proceso de resuspensión del pellet, es necesario pipetear y agitar la pared del tubo al menos 200 veces con una pipeta.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fabricación de exo@MN
<ol><li>Preparación del molde maestro<ol><li>Construya un modelo de microaguja con una matriz de 10 x 10 utilizando software CAD, con puntas de forma cónica con los siguientes parámetros: una altura de 1200 μm, un diámetro de base de 400 μm y un paso (distancia entre microagujas adyacentes) de 900 μm.</li>
		<li>Utilice resina HTL como material e imprima el molde maestro de la microaguja utilizando una impresora 3D (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Sumerja el molde maestro en etanol absoluto durante 1 h para eliminar cualquier resina adherida a la superficie.</li>
		<li>Exponga el molde a la luz ultravioleta durante 5 minutos para que se seque.</li>
		<li>Sumergir el molde una vez más en etanol absoluto durante 1 h, seguido de un secado a 60 °C en un horno de secado durante 1 h. El molde maestro está listo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación del molde de producción<ol><li>Mezcle los componentes A y B del polidimetilsiloxano (PDMS, consulte la tabla de materiales) en una proporción de 10:1. Remueve bien y vierte la mezcla en un molde maestro.</li>
		<li>Coloque el molde de PDMS a una presión de 1 psi durante 15 minutos para eliminar las burbujas de aire de la mezcla de PDMS.</li>
		<li>Curar el molde de PDMS a 60 °C durante 2 h y luego desmoldar para obtener el molde de producción de la microaguja.</li>
		<li>Limpie el molde de producción con agua ultrapura antes de usarlo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de la solución<ol><li>Cuantifique el contenido de proteínas de la solución de exosomas utilizando un kit de ensayo de BCA (consulte la tabla de materiales). Agregue una cantidad adecuada de DPBS para lograr una concentración de 10 μg/μL para la solución de exosomas.</li>
		<li>Prepare una solución de 200 mg/mL de trehalosa (ver Tabla de Materiales) utilizando DPBS como solvente. Revuelva durante 20 minutos para asegurar una disolución completa.</li>
		<li>Prepare una solución de 200 mg/mL de ácido hialurónico (AH, ver Tabla de Materiales) utilizando DPBS como disolvente. Revuelva durante la noche para asegurar la disolución completa.</li>
		<li>Prepare una solución de 150 mg/mL de polivinilpirrolidona (PVP, ver Tabla de Materiales) utilizando etanol absoluto como solvente. Revuelva durante la noche para asegurar la disolución completa.</li>
		<li>Mezclar la solución de exosomas (10 μg/μL) y la solución de trehalosa (200 mg/mL) en una proporción de volumen de 1:1. Luego, agregue un volumen igual de solución de HA (200 mg / mL). Mezcle bien para obtener la solución de punta.</li>
	</ol></li>
	<li>Fabricación de exo@MN<ol><li>Procese la superficie del molde de PDMS utilizando un limpiador de plasma (ver Tabla de Materiales) durante 30 s a un grado bajo para mejorar su hidrofilicidad.</li>
		<li>Añada 40 μL de la solución de puntas al molde de PDMS. Centrifugar a temperatura ambiente (RT) y 3000 x g durante 3 min para asegurar que el líquido llene la capa de agujas del molde.</li>
		<li>Retirar el exceso de líquido del molde y secar a RT en un horno de secado al vacío (ver Tabla de Materiales) durante 1 día.</li>
		<li>Agregue 200 μL de solución de PVP al molde de PDMS. Centrifugar 3000 x g durante 3 min en RT para asegurarse de que el líquido llene la capa de soporte del molde.</li>
		<li>Seque el molde en RT en un horno de secado durante 1 día, luego desmolque para obtener el parche exo@MN. NOTA: Mantenga el parche de exo@MN almacenado en un horno de secado hasta que esté listo para usar.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Diagrama del proceso de preparación de exosomas; centrifugación, secado al vacío, adición de polímeros para estabilización." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Proceso de fabricación de exo@MN parches. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. Caracterización de exo@MN parches
<ol><li>Observación de la morfología<ol><li>Pegue el reverso del parche sobre una superficie inclinada 45° y colóquelo bajo un microscopio estereoscópico (consulte la tabla de materiales).</li>
		<li>Enciende el iluminador y captura la morfología del parche con un objetivo 4x.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopía electrónica de barrido (SEM)<ol><li>Fije el parche a la etapa de muestra con adhesivo conductor y trátelo con un recubridor fino automático (consulte la tabla de materiales) durante 30 s.</li>
		<li>Capture imágenes del parche exo@MN utilizando SEM (ver Tabla de Materiales) con un voltaje de aceleración de 1 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayos mecánicos<ol><li>Corte una matriz de 3 x 3 del parche y colóquela con las puntas hacia arriba en la plataforma rígida de un medidor de tracción (consulte la tabla de materiales). Ajuste la altura de la sonda para acercarla a las puntas de las agujas sin tocarlas.</li>
		<li>Ajuste los parámetros para que se detengan cuando la presión alcance los 20 N automáticamente. Comprima las puntas de las agujas verticalmente a una velocidad de 0,5 mm/min y registre el perfil de carga frente al desplazamiento.</li>
	</ol></li>
	<li>Disolución<ol><li>Compra orejas de cerdo frescas en el mercado y córtalas en trozos (5 cm x 5 cm x 0,3 cm). Extienda la piel de cerdo sobre una mesa y use papel para secar la humedad de la superficie.</li>
		<li>Prepare cuatro parches secos de microagujas con las puntas de las agujas hacia abajo sobre la piel del cerdo, espaciando ligeramente cada parche. Con los dedos pulgar e índice, presione verticalmente cada parche de microaguja. Retire un parche cada 15 s.</li>
		<li>Coloque inmediatamente el parche retirado en un horno de secado y seque durante 5 min. Corte una columna de puntas de microagujas, colóquelas horizontalmente debajo de un microscopio (consulte la Tabla de materiales) y use una lente de objetivo de 4x para observar la disolución de las puntas.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Caracterización de exosomas en exo@MN parche
NOTA: Las puntas de las microagujas de exo@MN se disuelven en 100 μL de solución de DPBS para realizar la siguiente caracterización de los exosomas liberados.
<ol><li>Microscopía electrónica de transmisión (TEM)<ol><li>Trate la malla de cobre (ver Tabla de Materiales) con un tratamiento hidrofílico usando un limpiador de iones (ver Tabla de Materiales) durante 5 min.</li>
		<li>Dispense 10 μL de la muestra en el lado de carbono de la malla de cobre. Déjalo reposar durante 1 minuto, luego retira el líquido secándolo con papel de filtro por los bordes.</li>
		<li>Añadir 10 μL de acetato de uranilo al 3% (ver Tabla de Materiales) a la muestra. Déjalo reposar durante 10 s, luego retira el líquido secando con papel de filtro de los bordes.</li>
		<li>Añadir 10 μL de acetato de uranilo al 3% a la muestra. Déjalo reposar durante 1 minuto, luego retira el líquido secándolo con papel de filtro por los bordes y sécalo al aire RT.</li>
		<li>Captura de imágenes de los exosomas utilizando TEM (ver Tabla de Materiales) con un voltaje de aceleración de 80 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)<ol><li>Diluya la solución de exosomas con DPBS para lograr una concentración de partículas de 1 x 107 partículas/mL. Inyecte lentamente 1 mL de la solución de exosoma en la cámara de muestra del NTA utilizando una jeringa de 1 mL (ver Tabla de Materiales).</li>
		<li>Establezca el tipo de procedimiento operativo estándar (SOP) del instrumento en EV-488 para detectar la distribución del tamaño de los exosomas.</li>
	</ol></li>
	<li>Western blot (WB)<ol><li>Prepare el tampón de lisis mezclando el tampón de lisis del ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA): fluoruro de fenilmetanosulfonilo (ver Tabla de Materiales) en una proporción de 100:1. Lise los exosomas en hielo durante 20 minutos, vórtices cada 10 minutos.</li>
		<li>Centrifugar la solución a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Recoja el sobrenadante para medir la concentración de proteínas.</li>
		<li>Agregue 5 veces el tampón de carga SDS-PAGE (consulte la Tabla de materiales) al sobrenadante en una proporción de volumen de 1 : 4 y mezcle bien. Calentar a 100 °C durante 10 min para desnaturalizar las proteínas.</li>
		<li>Añadir 5 μL de un marcador de proteína preteñido de 180 kDa (ver Tabla de Materiales) y 10 μg de muestra desnaturalizada a un gel prefabricado al 4%-20% (ver Tabla de Materiales). Haga funcionar el sistema de electroforesis (consulte la tabla de materiales) a 60 V durante 10 min y luego a 140 V durante 50 min.</li>
		<li>Transfiera las proteínas del gel a una membrana de PVDF (ver Tabla de Materiales) preactivada con metanol. Realizar el sistema de electroforesis a 290 mA durante 90 min en hielo.</li>
		<li>Incubar la membrana de PVDF en una solución de leche desnatada al 5% durante 1 h. Lave tres veces con solución salina tamponada tris con interpolación (TBST, consulte la Tabla de materiales) durante 5 minutos cada una.</li>
		<li>Corta las bandas objetivo en función de la posición de la proteína. Incubar las bandas con el anticuerpo anti-ratón CD63 y el anticuerpo anti-ratón Alix (ver Tabla de Materiales) diluidos a la concentración adecuada de acuerdo con las instrucciones del fabricante, e incubar durante la noche a 4 °C.</li>
		<li>Lave las bandas tres veces con TBST. Incubar con IgG anti-conejo conjugada con HRP (ver Tabla de Materiales) en RT durante 1 h. A continuación, vuelva a lavar tres veces con TBST.</li>
		<li>Aplique un reactivo de detección de súper ECL (consulte la Tabla de materiales) para cubrir la superficie de las bandas, y exponga y capture inmediatamente las bandas con un generador de imágenes en gel (consulte la Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopía de barrido láser confocal (CLSM)<ol><li>Cultive 5 x 105 DC en un plato confocal utilizando 2 mL de medio Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) (ver Tabla de Materiales). Añadir exosomas o exo@MN, e incubar a 37 °C durante 24 h.</li>
		<li>Añada una gota de Hoechst 33342 a cada placa confocal e incube en la oscuridad a 37 °C durante 20 min.</li>
		<li>Realice imágenes con un CLSM (consulte la Tabla de materiales) utilizando una lente de objetivo de 60x. Aplique una gota de aceite de inmersión (consulte la tabla de materiales) sobre la lente y coloque la placa confocal sobre la plataforma. Ajuste los ejes x/y/z para localizar el plano focal adecuado de las células.</li>
		<li>Inicie la generación de imágenes con canales DAPI/TRITC/TD, seleccione una resolución de 1024 px y establezca el modo rápido en 1/8 s.</li>
	</ol></li>
	<li>Citometría de flujo<ol><li>Cultive las CD en una placa de 6 pocillos, cada pocillo contiene 5 x 105 celdas y 2 mL de medio 1640. Añadir volúmenes iguales de solución de DPBS, exosomas, microagujas sin exosomas y exo@MN, respectivamente, e incubar a 37 °C durante 24 h.</li>
		<li>Transfiera el medio de cada pocillo a tubos centrífugos. Centrifugar a 300 x g durante 3 min a 4 °C y retirar el sobrenadante.</li>
		<li>Agregue 0,5 μL de anticuerpo FITC-CD11c, 2,5 μL de anticuerpo APC-CD80 y 0,5 μL de anticuerpo Pacific Blue I-A/I-E (ver Tabla de Materiales) a 100 μL de solución de BSA al 5% (ver Tabla de Materiales). Mezclar bien, resuspender las células e incubar en una coctelera en hielo y en la oscuridad durante 20 min.</li>
		<li>Añadir 1 mL de DPBS y centrifugar a 300 x g durante 3 min a 4 °C, luego retirar el sobrenadante. Repita el lavado dos veces para eliminar los anticuerpos no unidos y, a continuación, proceda a analizar los canales fluorescentes correspondientes mediante citometría de flujo (ver Tabla de Materiales).<ol><li>En primer lugar, en el diagrama de dispersión FSC-A/SSC-A, dirija la población de células principales como P1. En el diagrama de dispersión SSC-A/SSC-H de la población de células P1, conecte una región P2 cuadrada a lo largo de la diagonal para eliminar las células agregadas.</li>
			<li>Realice análisis de fluorescencia en la población de células P2 utilizando los canales FITC, APC y Pacific Blue. Establezca la condición de parada para recoger 10.000 celdas en la puerta P2.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>5. Análisis estadístico
<ol><li>Expresar datos cuantitativos como medias ± desviaciones estándar (DE). Evalúe la significación estadística utilizando el análisis de prueba t utilizando una aplicación de software de análisis de datos adecuada. Considere valores p inferiores a 0,05 para indicar significación estadística. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, ***p &lt; 0,001, ****p &lt; 0,0001.</li>
</ol>

Parches de microagujas para la administración sostenida de exosomas en aplicaciones biomédicas

<ol><li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).</li>
<li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (640), 6977(2020).</li>
<li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).</li>
<li>Nair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+nanoparticle+system+integrating+tumor-derived+exosomes+and+poly%28amidoamine%29+dendrimers%3A+Implications+for+an+effective+gene+delivery+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Mater%22%5BJournal%5D)">Hybrid nanoparticle system integrating tumor-derived exosomes and poly(amidoamine) dendrimers: Implications for an effective gene delivery platform.</a> Chem Mater. 35 (8), 3138-3150 (2023).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell-derived+exosomes+elicit+tumor+regression+in+autochthonous+hepatocellular+carcinoma+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell-derived exosomes elicit tumor regression in autochthonous hepatocellular carcinoma mouse models.</a> J Hepatol. 67 (4), 739-748 (2017).</li>
<li>Oskouie, M. N., Aghili Moghaddam, N. S., Butler, A. E., Zamani, P., Sahebkar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+curcumin-encapsulated+and+curcumin-primed+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of curcumin-encapsulated and curcumin-primed exosomes.</a> J Cell Physiol. 234 (6), 8182-8191 (2019).</li>
<li>Yuan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+exosomes+as+natural+nanocarriers+for+protein+delivery+to+inflamed+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain.</a> Biomaterials. 142, 1-12 (2017).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+The+next+generation+of+endogenous+nanomaterials+for+advanced+drug+delivery+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Exosomes: The next generation of endogenous nanomaterials for advanced drug delivery and therapy.</a> Acta Biomater. 86, 1-14 (2019).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+hek293t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from hek293t cells.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).</li>
<li>Wen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+in+a+radiation+injury+bone+marrow+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a radiation injury bone marrow murine model.</a> Int J Mol Sci. 20 (21), 5468-5482 (2019).</li>
<li>Cheng, Y., Zeng, Q., Han, Q., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH%2C+temperature+and+freezing-thawing+on+quantity+changes+and+cellular+uptake+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes.</a> Protein Cell. 10 (4), 295-299 (2019).</li>
<li>Jana, B. A., Shivhare, P., Srivastava, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin-PVP+dissolving+microneedle-mediated+therapy+for+controlled+delivery+of+nifedipine+for+rapid+antihypertension+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertens+Res%22%5BJournal%5D)">Gelatin-PVP dissolving microneedle-mediated therapy for controlled delivery of nifedipine for rapid antihypertension treatment.</a> Hypertens Res. 47 (2), 427-434 (2024).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapidly+dissolvable+microneedle+patch+with+tip-accumulated+antigens+for+efficient+transdermal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">A rapidly dissolvable microneedle patch with tip-accumulated antigens for efficient transdermal vaccination.</a> Macromol Biosci. 23 (12), e2300253(2023).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+delivery+of+nucleic+acid+molecules+into+skin+by+combined+use+of+microneedle+roller+and+flexible+interdigitated+electroporation+array%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Efficient delivery of nucleic acid molecules into skin by combined use of microneedle roller and flexible interdigitated electroporation array.</a> Theranostics. 8 (9), 2361-2376 (2018).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+immune+suppressive+microenvironment+in+tumor+draining+lymph+nodes+to+enhance+anti-pd1+immunotherapy+via+nanovaccine+complexed+microneedle%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Res%22%5BJournal%5D)">Reverse immune suppressive microenvironment in tumor draining lymph nodes to enhance anti-pd1 immunotherapy via nanovaccine complexed microneedle.</a> Nano Res. 13 (6), 1509-1518 (2020).</li>
<li>Kim, Y. C., Park, J. H., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedles+for+drug+and+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Microneedles for drug and vaccine delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (14), 1547-1568 (2012).</li>
<li>Bui, V. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolving+microneedles+for+long-term+storage+and+transdermal+delivery+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dissolving microneedles for long-term storage and transdermal delivery of extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 287, 121644(2022).</li>
<li>Nir, Y., Potasman, I., Sabo, E., Paz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fear+of+injections+in+young+adults%3A+Prevalence+and+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Fear of injections in young adults: Prevalence and associations.</a> Am J Trop Med Hyg. 68 (3), 341-344 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., Jiang, G., Yu, W., Liu, D., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedles+fabricated+from+alginate+and+maltose+for+transdermal+delivery+of+insulin+on+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Microneedles fabricated from alginate and maltose for transdermal delivery of insulin on diabetic rats.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 85, 18-26 (2018).</li>
<li>Roy, G., Garg, P., Venuganti, V. V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle+scleral+patch+for+minimally+invasive+delivery+of+triamcinolone+to+the+posterior+segment+of+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Microneedle scleral patch for minimally invasive delivery of triamcinolone to the posterior segment of eye.</a> Int J Pharm. 612, 121305(2022).</li>
<li>Creighton, R. L., Woodrow, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle-mediated+vaccine+delivery+to+the+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa.</a> Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180(2019).</li>
<li>Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachable+microneedle+patches+deliver+mesenchymal+stromal+cell+factor-loaded+nanoparticles+for+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair.</a> ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).</li>
<li>Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+prospect+of+immunotherapy+for+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Colorectal+Dis%22%5BJournal%5D)">Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer.</a> Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2 (9), 1800021(2018).</li>
<li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Sci Rep. 6, 36162(2016).</li>
<li>Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid%3A+More+than+a+carrier%2C+having+an+overpowering+extracellular+and+intracellular+impact+on+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer.</a> Carbohydr Polym. 317, 121081(2023).</li>
<li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryomicroneedles+for+transdermal+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cryomicroneedles for transdermal cell delivery.</a> Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).</li>
</ol>

H. C., F.L.Q y S.J.M son inventores de una solicitud de patente que se ha presentado sobre la base de los datos de este manuscrito. H.C. es el fundador científico de Medcraft Biotech. Inc.

En la actualidad, los principales métodos de aislamiento de exosomas son la ultracentrifugación, la centrifugación en gradiente de densidad, la ultrafiltración, la precipitación, las perlas magnéticas de inmunoafinidad y la microfluídica24. Debido a la limitada capacidad de carga de las microagujas causada por su pequeño espacio en la punta de la aguja, es necesario aumentar la concentración de exosomas para cargar más. Por lo tanto, elegimos la ultrafiltración para concentrar el sobrenadante del cultivo celular y luego utilizamos la ultracentrifugación para aislar los exosomas. La concentración de exosomas se incrementó con una pequeña cantidad de resuspensión líquida para que las microagujas pudieran cargarse con decenas o cientos de microgramos de exosomas. Sin embargo, este método da como resultado una presencia significativa de proteínas en la solución aislada del exosoma. Además, se produce una pérdida sustancial de exosomas durante el proceso de centrifugación. Hoy en día, una de las limitaciones de la aplicación terapéutica de los exosomas es la falta de métodos efectivos para aislar exosomas con alta pureza y en grandes cantidades. A medida que se explora cada vez más el potencial clínico de los exosomas, existe la necesidad de desarrollar técnicas más avanzadas en el futuro para abordar los desafíos asociados con su extracción.
La tecnología clave en este estudio es el diseño de microagujas basadas en exosomas. Con el fin de minimizar el desperdicio de exosomas y lograr efectos terapéuticos más fuertes, se adoptó un método de fundición de dos pasos para fabricar exo@MN parches. La trehalosa ha sido reportada previamente como un material adecuado para la preservación liofilizada de exosomas25, mientras que el AH exhibe una excelente biocompatibilidad, hidrofilicidad y funciones en la inhibición de la inflamación y la promoción de la reparación de la piel26. La fabricación de puntas de aguja cargadas con exosomas utilizando estos dos materiales ayuda a mantener la actividad biológica de los exosomas, lo que permite su rápida disolución y liberación dentro de la piel. Además, este enfoque minimiza el riesgo de infección y contribuye a la rápida recuperación de la piel. A través de la centrifugación y el secado al vacío, los exosomas se concentraron en las puntas de las microagujas. Teniendo en cuenta la incompatibilidad del etanol y la trehalosa, se seleccionó como material de soporte el PVP disuelto en etanol absoluto. Este método de fabricación en capas mejoró efectivamente la eficiencia de entrega de los exosomas.
La escasa estabilidad de los exosomas in vitro, ya sea almacenados a 4 °C, 37 °C o -80 °C, puede provocar cambios en la estructura del exosoma o su degradación11. Para resolver este problema, varios estudios han explorado los métodos de almacenamiento de los exosomas, como la liofilización. La tecnología de microagujas proporciona otra estrategia novedosa. Al secar en RT, la tecnología de microagujas puede mejorar la estabilidad de los exosomas y se puede utilizar directamente para la administración de exosomas sin otros tratamientos. Además, el proceso de extracción de exosomas es complejo y propenso a la degradación, lo que dificulta las aplicaciones a gran escala. El almacenamiento de exosomas extraídos mediante la tecnología de microagujas no simplifica los pasos de extracción, pero reduce el número de extracciones necesarias. Una sola extracción puede producir una gran cantidad de parches exo@MN, que se pueden almacenar durante un período prolongado. El uso de microagujas de exosomas del mismo lote para cada tratamiento minimiza el impacto potencial de las variaciones entre diferentes lotes en los resultados terapéuticos, mejorando así la repetibilidad y la fiabilidad de la nanoplataforma de exosomas27. Esto proporciona más posibilidades para la aplicación clínica de los exosomas.
En futuras investigaciones, vale la pena explorar métodos que permitan un control preciso de la carga útil y minimizar las variaciones del fármaco entre las puntas de las agujas. Esto se puede lograr a través de la optimización de procesos, la implementación de medidas de control de calidad y la utilización de técnicas avanzadas. Abordar estos aspectos contribuirá significativamente al desarrollo de sistemas de administración de fármacos fiables y coherentes.

Los exosomas, que son pequeñas vesículas liberadas por las células en la matriz extracelular, se han propuesto como potenciales bioterapéuticos y vectores de administración de fármacos para el tratamiento de varias enfermedades y cánceres1. Durante su proceso de biogénesis, los exosomas encapsulan varias moléculas biológicamente activas desde el interior de las células, incluidas las proteínas funcionales y los ácidos nucleicos2. Como resultado, cuando son absorbidos por las células receptoras durante el proceso de transporte, los exosomas tienen la capacidad de modular la expresión génica y las funciones celulares en las células diana3. Como una especie de mensajero de información natural, los exosomas se han aprovechado plenamente en la regeneración de tejidos, la regulación inmunitaria y como portadores de entrega4. A través de técnicas de ingeniería, se pueden enriquecer ligandos específicos en la superficie de los exosomas, lo que permite la inducción o inhibición de eventos de señalización en las células receptoras o se dirige a tipos específicosde células 5. Los agentes quimioterapéuticos también pueden cargarse en exosomas para el tratamiento del cáncer6. Además, los exosomas tienen la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica para la entrega de carga terapéutica, lo que los hace muy prometedores para el tratamiento de trastornos cerebrales7. En comparación con los liposomas, los exosomas presentan una mayor absorción celular y una mejor biocompatibilidad8. Son capaces de entrar eficientemente en otras células, al tiempo que demuestran una mejor tolerancia y una menor toxicidad9. Sin embargo, la inyección tradicional en bolo de exosomas es propensa al secuestro y a la rápida eliminación por parte del hígado, los riñones y el bazo enel torrente sanguíneo. Además, los exosomas tienen poca estabilidad in vitro y son susceptibles a condiciones de almacenamiento que restringen sus aplicaciones clínicas11.
Las microagujas, un conjunto de puntas de aguja de tamaño micrométrico, tienen la capacidad de penetrar las barreras fisiológicas para la administración de fármacos de moléculas pequeñas12, proteínas13, ácidos nucleicos14 y nanomedicinas15. Las microagujas están diseñadas con precisión para atacar las lesiones en la superficie de la piel, y sus puntas dispersas garantizan una distribución uniforme del fármaco en el sitio objetivo, amplificando así su impacto terapéutico16. El diseño y la composición del material de las microagujas facilitan el almacenamiento en seco de sustancias bioactivas como proteínas y ácidos nucleicos, mejorando su estabilidad17. Los métodos tradicionales de inyección tienen una duración de acción relativamente corta y pueden causar dolor, induciendo miedo en los pacientes18. La longitud de la microaguja, del tamaño de un micrómetro, minimiza el trauma tisular y evita la estimulación nerviosa, eliminando así el dolor y mejorando la distensibilidad del paciente19. Además, la facilidad de uso de las microagujas permite a los pacientes autoadministrarse el tratamiento sin necesidad de personal especializado16. Además de la piel, las microagujas también se pueden utilizar en tejidos como los ojos20, la mucosa oral21, el corazón22 y los vasos sanguíneos23. La aplicación de microagujas para la administración clínica de exosomas proporciona una estrategia prometedora y prospectiva.
Por lo tanto, presentamos un parche de microagujas (exo@MN) cargado con exosomas y divulgamos su método de fabricación. Los parches de microagujas se fabricaron utilizando un método de fundición de dos pasos, junto con centrifugación y secado al vacío, que promueve la agregación de exosomas en las puntas de las microagujas, mejorando así la eficiencia de la administración. Tanto las puntas de las agujas como el soporte se construyeron con materiales que exhiben una excelente biocompatibilidad y solubilidad en agua. Se incorporaron trehalosa y ácido hialurónico (AH) como materiales de punta para proporcionar protección a los exosomas, y se eligió polivinilpirrolidona (PVP) disuelto en etanol absoluto como material de soporte. La morfología del parche de microagujas se caracterizó mediante microscopía y microscopio electrónico de barrido (SEM). Las pruebas mecánicas de la microaguja se evaluaron utilizando un tensímetro para confirmar su capacidad para penetrar en la piel, y se investigó que la tasa de liberación en la piel de cerdo era de 60 s. Además, se caracterizó la morfología, el tamaño y el contenido de proteínas de los exosomas frescos y de los exosomas en exo@MN mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM), análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y Western blot (WB). La internalización de exosomas por células dendríticas (CD) se caracterizó mediante microscopio láser confocal de barrido (CLSM) y la maduración de las CD se evaluó mediante citometría de flujo. La caracterización morfológica y las funciones biológicas de los dos tipos de exosomas son esencialmente consistentes.

<table><tbody><tr><td>100x soluciones de penicilina-estreptomicina</td><td>Jrunbio Scientific</td><td>MA0110</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>180 kDa marcador de proteína pre-teñido</td><td>Thermo</td><td>26616</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>3% Acetato de uranilo</td><td>Henan Ruixin Experimental Supplies</td><td>GZ02625</td><td>Caracterización morfológica de exosomas</td></tr><tr><td>Impresora 3D</td><td>Tecnología BMF</td><td>Molde nanoArch S130</td><td> preparación</td></tr><tr><td>4%&ndash; 20% gel prefabricado</td><td>Genscript</td><td>ExpressPlus PAGE GEL</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>5&times; Búfer de carga SDS-PAGE</td><td>Titan 04048254</td><td></td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticuerpo Alix anti-ratón</td><td>Biolegend</td><td>12422-1-AP</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD63 anti-ratón</td><td>Biolegend</td><td>ab217345</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>APC anticuerpo CD80 anti-ratón</td><td>Biolegend</td><td>104713</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>Auto recubridor fino</td><td>ZIZHU</td><td>JBA5-100</td><td>Caracterización morfológica de la microaguja</td></tr><tr><td>Kit de ensayo BCA</td><td>Beyotime</td><td>P0012</td><td>Ensayo de concentración de proteínas</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Fisher</td><td>Muitifuge X1R pro</td><td>Centrífuga de celdas</td></tr><tr><td>Bomba de vacío de agua circulante</td><td>Yuhua Instrument</td><td>SHZ-D(III)</td><td>filtración</td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Eppendorf</td><td>CellXpert C170</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Microscopio de escaneo láser confocal</td><td>Nikon</td><td>A1HD25</td><td>Imágenes de fluorescencia</td></tr><tr><td>Malla de cobre</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology&nbsp;</td><td>JF-ZJKY/300</td><td>Caracterización morfológica de los exosomas</td></tr><tr><td>D- (+)-Trehalosa dihidratado</td><td>Aladdin</td><td>5138-23-4</td><td>Fabricación de microagujas&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' Águila modificada' s medio</td><td>Meilunbio</td><td>MA0212</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Dulbecco' Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Meilunbio</td><td>MA0010</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis</td><td>Bio-rad</td><td>PowerPac-basic</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Jrunbio</td><td>Scientific JR100</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>FITC anticuerpo anti-ratón CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117305</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>Citometría de flujo</td><td>BD</td><td>LSR Fortessa</td><td>Detección de fluorescencia</td></tr><tr><td>Generador de imágenes en gel</td><td>Cytiva</td><td>Amersham ImageQuant 800</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>HRP conjugado con HRP IgG</td><td>CST</td><td>7074S</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Resina HTL</td><td>Tecnología</td><td></td> BMF <td>Preparación</td></tr><tr>de<td>moldes Ácido hialurónico (MW = 300 kDa)</td><td>Bloomage Biotechnology</td><td>9004-61-9</td><td>Fabricación de microagujas&nbsp;</td></tr><tr><td>Aceite de inmersión</td><td>Nikon</td><td>MXA22168</td><td>Imágenes de fluorescencia</td></tr><tr><td>Limpiador de iones</td><td>JEOL</td><td>EC-52000IC</td><td>Caracterización morfológica de exosomas</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td>Observe el proceso de disolución de la punta de la microaguja</td></tr><tr><td>Célula de cáncer epitelial de ovario de ratón ID8</td><td>MeisenCTCC</td><td>&nbsp; CC90105</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Análisis de seguimiento de nanopartículas</td><td>Metrix</td><td>ZetaView</td><td>Análisis de tamaño de exosomas</td></tr><tr><td>Azul del Pacífico Anticuerpo I-A/I-E anti-ratón</td><td>Biolegend</td><td>107619</td><td>Anticuerpo</td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetanosulfonilo</td><td>Beyotime</td><td>ST507</td><td>Inhibidores de la proteasa</td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Hefei Kejing Tecnología de materiales</td><td>PDC-36G</td><td>Fabricación de microagujas&nbsp;</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano</td><td>Dow Corning</td><td>9016-00-6</td><td>Preparación de moldes</td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona (MW = 40 kDa)</td><td>Aladdin</td><td>9003-39-8</td><td>Fabricación de microagujas&nbsp;</td></tr><tr><td>Prisma&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>Versión 9</td><td>Análisis estadístico</td></tr><tr><td>Membrana de PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Centrífuga de cierre rápido</td><td>Beckman</td><td>344619</td><td>Extracción de exosomas</td></tr><tr><td>Tampón de lisis RIPA</td><td>Applygen</td><td>C1053</td><td>Membrana de lisis</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td><td>Meilunbio</td><td>MA0548</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>JEOL</td><td>JSM-IT800</td><td>Caracterización morfológica de la microaguja</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Caracterización de la morfología</td></tr><tr><td>Reactivo de detección Super ECL</td><td>Applygen</td><td>P1030</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Tensímetro</td><td>Instron</td><td>68SC-05</td><td>Ensayos mecánicos</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100plus</td><td>Caracterización morfológica de exosomas</td></tr><tr><td>Tris tamponado solución salina</td><td>Sangon Biotech</td><td>JF-A500027-0004</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Beyotime</td><td>ST825</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN-100</td><td>Extracción de exosomas</td></tr><tr><td>Tubo de ultrafiltración</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>Concentración de exosomas</td></tr><tr><td>Horno de secado al vacío</td><td>Shanghai Yiheng Technology</td><td>DZF-6024</td><td>Fabricación de microagujas Sistema de filtración al</td></tr><tr><td>vacío</td><td>Biosharp</td><td>BS-500-XT</td><td>Filtración</td></tr></tbody></table>

fabricación y caracterización de parches de microagujas para la carga y entrega de exosomas

Fabrication and Characterization of Microneedle Patches for Loading and Delivery of Exosomes

Los exosomas, como bioterapéuticos emergentes de "próxima generación" y vectores de administración de fármacos, tienen un inmenso potencial en diversos campos biomédicos, que van desde la administración de fármacos y la medicina regenerativa hasta el diagnóstico de enfermedades y la inmunoterapia tumoral. Sin embargo, el rápido aclaramiento mediante la inyección tradicional en bolo y la escasa estabilidad de los exosomas restringen su aplicación clínica. Las microagujas sirven como una solución que prolonga el tiempo de residencia de los exosomas en el sitio de administración, manteniendo así la concentración del fármaco y facilitando efectos terapéuticos sostenidos. Además, las microagujas también poseen la capacidad de mantener la estabilidad de las sustancias bioactivas. Por lo tanto, presentamos un parche de microagujas para cargar y administrar exosomas y compartimos los métodos, incluido el aislamiento de exosomas, la fabricación y la caracterización de parches de microagujas cargados con exosomas. Los parches de microagujas se fabricaron utilizando trehalosa y ácido hialurónico como materiales de punta y polivinilpirrolidona como material de soporte a través de un método de fundición de dos pasos. Las microagujas demostraron una resistencia mecánica robusta, con puntas capaces de soportar 2 N. Se utilizó piel de cerdo para simular la piel humana, y las puntas de las microagujas se derritieron completamente dentro de los 60 segundos posteriores a la punción de la piel. Los exosomas liberados por las microagujas mostraron morfología, tamaño de partícula, proteínas marcadoras y funciones biológicas comparables a las de los exosomas frescos, lo que permitió la absorción de las células dendríticas y promovió su maduración.

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de exosomas, fabricación y caracterización de exo@MN parche. La Figura 1 ilustra el diagrama de flujo del proceso para la fabricación de exo@MN parche. Los exosomas se mezclaron con trehalosa y HA, y luego la mezcla se agregó al molde de microagujas y se centrifugó. Este proceso facilitó la agregación de exosomas en las puntas de las agujas, promoviendo una rápida liberación. Después del secado, se agregó una solución de PVP y se centrifugó para llenar el molde por completo. Tras el secado completo, se retiró el molde para obtener los parches exo@MN. La morfología de las microagujas se caracterizó mediante microscopía y SEM, como se muestra en la Figura 2. Las puntas del parche exo@MN exhibían una forma cónica dispuestas en una matriz de 10 x 10 con puntas de aguja afiladas e intactas. La punta de la microaguja puede soportar una fuerza de 2 N, lo que le permite penetrar a través de la barrera cutánea. Además, se empleó piel porcina como sustituto de la piel humana para simular la aplicación de parches exo@MN. Los parches se presionaron sobre la piel del cerdo para observar el tiempo de liberación, y las puntas de las microagujas se derritieron por completo en 60 s. Los parches exo@MN se disolvieron en DPBS y se caracterizaron, como se muestra en la Figura 3. Las imágenes TEM capturaron vesículas con estructuras típicas en forma de copa, consistentes con la morfología de los exosomas. La distribución del tamaño de partícula de la solución exo@MN por NTA reveló que las partículas se concentraban predominantemente dentro del rango de 50-250 nm. Sin embargo, también había algunas partículas más grandes presentes, que pueden atribuirse a las propiedades adhesivas del material HA, lo que provoca la agregación de exosomas. El análisis WB de las proteínas CD63/Alix en la solución exo@MN demostró que exo@MN era capaz de retener parcialmente las proteínas de los exosomas. La funcionalidad biológica de los exosomas liberados por el exo@MN se validó en la Figura 4, centrándose en la absorción de exosomas por parte de las células y la activación de las células dendríticas en comparación con los exosomas frescos. Las imágenes CLSM confirmaron la absorción eficiente tanto de exosomas frescos como de exosomas en el exo@MN por parte de las DC. Las imágenes representativas y las estadísticas proporcionales de la citometría de flujo demuestran que los exosomas en exo@MN poseen funciones biológicas que promueven la activación de las CD similares a los exosomas frescos.
<img alt="Diagrama de fabricación de microagujas, imagen SEM, gráfico de presión-desplazamiento, secuencia de prueba de penetración." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Caracterización de exo@MN parches. (A) Imágenes de microscopio estereoscópico de exo@MN parches. Barra de escala = 400 μm. (B) Imagen SEM de exo@MN parches. Barra de escala = 200 μm. (C) Los perfiles de carga frente a desplazamiento de exo@MN parche. (D) Imágenes microscópicas de exo@MN parches insertados en la piel del cerdo en diferentes momentos. Barra de escala = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Microscopía electrónica de exosomas; gráfico de distribución de tamaño; Western blot de marcadores proteicos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Caracterización de exosomas frescos y exosomas en exo@MN. (A) Morfología de exosomas por TEM. Barra de escala = 100 nm. (B) Distribución del tamaño de partícula de los exosomas por NTA. (C) CD63 y Alix de exosomas por WB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Resultados de microscopía de exosomas y citometría de flujo; tinción celular, análisis de flujo, expresión de CD80 MHCII." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Pruebas biológicas de exosomas frescos y exosomas en exo@MN. (A) Imágenes CLSM de exosomas tomados por DCs. Barra de escala = 10 μm. (B) Gráficos representativos de activación de DCs por citometría de flujo. (C) Cuantificación del porcentaje de CD11c+CD80+MHCII+ DCs. Los datos se presentan como media ± DE (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Los exosomas poseen un potencial clínico significativo, pero su aplicación práctica es limitada debido a la fácil eliminación in vivo y la poca estabilidad. Las microagujas presentan una solución al permitir la administración localizada mediante la perforación de barreras fisiológicas y la conservación en estado seco, abordando así las limitaciones de la administración de exosomas y ampliando su utilidad clínica.

Fabricación y caracterización de parches de microagujas para la carga y entrega de exosomas

Exosomes, as emerging &#34;next-generation&#34; biotherapeutics and drug delivery vectors, hold immense potential in diverse biomedical fields, ranging ...

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Research

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La matriz extracelular específica del tejido (ECM) es un mediador clave de la función celular. Este artículo describe métodos para la síntesis de espumas y microportadores que son estables en cultivo sin la necesidad de reticulación química para aplicaciones en 3D avanzados en modelos de cultivo celular in vitro o como matrices biodegradables pro-regenerativas puros ECM-derivado.

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Aprende a fabricar parches de microagujas para la carga y entrega eficiente de exosomas. Este método mejora la estabilidad de los exosomas mediante preservación en seco y permite su aplicación clínica directa.

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