Name: Detección de roturas de ADN en células humanas en división mediante el ensayo de cometa neutro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Aprende a detectar roturas de ADN en células humanas en división mediante el ensayo de cometa neutro. Este método evalúa daño durante la replicación y el estrés replicativo.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio de Dungrawala por sus aportes y comentarios. Este trabajo fue financiado por la subvención de los NIH R35GM137800 a la EH.

Este protocolo (Figura 1) utiliza principalmente líneas celulares cancerosas U2OS adherentes, pero es adaptable a una amplia variedad de células adherentes y en suspensión cultivadas en cultivo de tejidos. Las soluciones y tampones utilizados en este estudio se detallan en la Tabla 1. Los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de los materiales
<ol><li>Antes del día del experimento, coloque la botella provista con agarosa de bajo punto de fusión (1% de agarosa de bajo punto de fusión en PBS) en un baño de agua caliente durante 5-10 minutos para asegurarse de que la agarosa se haya derretido por completo. NOTA: No caliente el biberón en el microondas.</li>
	<li>Una vez fundida, alícuota rápidamente 100 μL de la agarosa en tubos de centrífuga de 1,5 mL según sea necesario y almacene los tubos a 4 °C. La agarosa solidificada puede almacenarse a 4 °C hasta 1 año.</li>
	<li>El día del experimento, retire el número necesario de tubos de centrífuga del almacenamiento a 4 °C. Derrita la agarosa colocando los tubos en un bloque de calor o baño de agua a 42 °C. NOTA: Coloque los tubos a 42 °C antes de recolectar las células para asegurarse de que la agarosa esté completamente derretida para la resuspensión (paso 3.7).</li>
	<li>Prepare el tampón de lisis y el tampón TAE el día del experimento y guárdelos a temperatura ambiente y 4 °C, respectivamente, hasta que estén listos para usar. Además, alícuota 1x PBS en tubo cónico de 15 mL y colóquelo en la nevera para utilizarlo en la etapa de resuspensión (paso 3.5).</li>
	<li>Marque las identificaciones de las muestras en el extremo esmerilado de los portaobjetos de cometas de 2 pocillos y guárdelas a temperatura ambiente hasta que estén listas para usar.</li>
</ol>2. Preparación de las muestras
<ol><li>Antes del día del experimento, siembre las células en una placa de 6 pocillos y cultive durante la noche a 37 °C con 5% de CO2. En el caso de las células U2OS, se sembraron aproximadamente 2-3 x 105 células para cada muestra. NOTA: Es posible que sea necesario ajustar los números de celda en función del tipo de celda utilizado para los análisis.</li>
	<li>El día del experimento, trate las células con las condiciones según el diseño experimental. Como control positivo para demostrar la inducción de roturas dependientes de la replicación, se deben tratar las células con 1 μM de CPT durante 1 h. CPT es un inhibidor de la topoisomerasa-1 que induce roturas de doble cadena de una manera dependiente de la replicación14.</li>
</ol>3. Resuspensión y lisis celular
<ol><li>Aspire los medios de cultivo celular y enjuague dos veces con 1x PBS.</li>
	<li>Añadir 300 μL de tripsina a cada pocillo. Incubar la placa en una incubadora de cultivo de tejidos durante 2-3 min. NOTA: La incubación prolongada en tripsina puede generar resultados falsos durante los análisis de cometas.</li>
	<li>Añada 700 μL de medio de cultivo celular a cada pocillo. Vuelva a suspender suavemente y transfiera las muestras a tubos de centrífuga de 1,5 ml. NOTA: Se recomienda contar las células en este paso para obtener la densidad de células adecuada en el paso 3.6 para reducir la frecuencia de colas superpuestas durante el análisis.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 2400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspire el medio y vuelva a suspender las células en 1 mL de PBS frío 1x.</li>
	<li>Repita los pasos 3.4 y 3.5 dos veces y vuelva a suspender las células en PBS frío 1x a una densidad celular de 2 x 105 células por ml. NOTA: Se recomienda evaluar la viabilidad celular en este paso para garantizar la presencia de un número adecuado de células viables. Se recomienda al menos un 90% de viabilidad.</li>
	<li>Vuelva a suspender 10 μL de la suspensión celular en 100 μL de agave derretida y, con la misma punta de pipeta, mezcle suavemente y extienda la mezcla uniformemente en un pocillo del portaobjetos. Repita este paso para todas las muestras según sea necesario. NOTA: Evite retirar todas las alícuotas del baño de agua a 42 °C de una vez para evitar que la agarosa se solidifique. Este paso debe realizarse preferiblemente por el baño de agua, y cada muestra se resuspende y se extiende de forma escalonada. Evite introducir burbujas mientras se extiende la agarosa en el portaobjetos, ya que las bolsas de aire afectarán a la migración de las colas del cometa durante la electroforesis (paso 4.5) e introducirán grietas en el paso de secado (paso 5.3)</li>
	<li>Guarde los portaobjetos a 4 °C en la oscuridad durante 15-20 minutos para asegurarse de que la agarosa se haya solidificado completamente (Figura 2A).</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en frascos Coplin y sumérjalos en tampón de lisis durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Enjuague los portaobjetos una vez con tampón TAE frío y sumerja los portaobjetos en tampón TAE frío durante 30 minutos a 4 °C.</li>
</ol>4. Electroforesis
<ol><li>Coloque la cámara electroforética sobre una superficie plana y nivele el sistema usando las cuatro perillas de nivelación en los bordes del aparato. Inserte compresas frías en la cámara inferior para mantener la solución fría durante la electroforesis.</li>
	<li>Vierta aproximadamente ~ 850 mL de tampón TAE frío 1x en el aparato.</li>
	<li>Retire los portaobjetos a 4 °C y colóquelos en la bandeja de electroforesis en la orientación adecuada para permitir la migración del ADN roto. NOTA: La bandeja tiene capacidad para diez portaobjetos de 2 pocillos. Coloque los portaobjetos en el centro de la bandeja si trabaja con un número menor de muestras. Si trabaja con un número impar de portaobjetos, incluya un portaobjetos en blanco de modo que cada pozo tenga capacidad para 2 portaobjetos.</li>
	<li>Coloque suavemente la capa de bandeja de portaobjetos provista encima de la bandeja para cubrir las diapositivas. NOTA: Para el correcto funcionamiento del aparato, el volumen del tampón TAE no debe ser inferior a la superficie inferior de la superposición ni exceder la superficie superior de la superposición.</li>
	<li>Después de conectar los cables, ajuste la potencia a 21 V y realice la electroforesis (1 V/cm) durante 40 min. NOTA: Es posible que sea necesario ajustar el tiempo de electroforesis en función del tipo de célula utilizada para los análisis. Las colas largas en las muestras no tratadas indican un tiempo de ejecución excesivo. Por el contrario, las colas cortas en las muestras de control positivo pueden reflejar un tiempo de ejecución insuficiente.</li>
</ol>5. Manchas
<ol><li>Una vez finalizada la electroforesis, retire los portaobjetos del aparato y sumérjalos en la solución de precipitación de ADN durante 30 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deseche la solución de precipitación de ADN y sumerja los portaobjetos en una solución de etanol al 70% durante 30 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deseche la solución de etanol al 70%. Retire los portaobjetos y séquelos en un horno de hibridación a 45 °C durante 30 min en la oscuridad (Figura 2B). NOTA: Los portaobjetos se pueden dejar en un lugar oscuro y seco durante la noche para el paso de secado.</li>
	<li>Incubar los pocillos con 100 μL de 1x solución verde SYBR durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Decantar la solución SYBR Green inclinando los portaobjetos y eliminando el exceso frotando suavemente el borde del pocillo con una toallita sin pelusa.</li>
	<li>Coloca los portaobjetos en un cajón y déjalos secar durante 30 min.</li>
	<li>Proceda con la toma de imágenes de las diapositivas.</li>
</ol>6. Imagenología y análisis
<ol><li>Configure el microscopio para fines de obtención de imágenes. NOTA: Todas las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio de epifluorescencia. Se utilizó un aumento de 10x con una apertura numérica de 0,45 con un tiempo de exposición de 1/40s y una ganancia de +6dB. Se utilizó el modo de captura monocromo de 8 bits con agrupación 2 x 2 y corrección del balance de negros.</li>
	<li>Coloque los portaobjetos en la platina del microscopio y comience a tomar imágenes con el filtro FITC. NOTA: Utilice primero la muestra no tratada para probar el tiempo de exposición. La mayoría de las células no exhiben colas de cometa ya que el ADN es más compacto. Cambie al pocillo con células tratadas con CPT e imagen utilizando el mismo tiempo de exposición. En esta muestra se observarán colas de cometas con longitudes aumentadas debido a la migración de extremos de ADN rotos.</li>
	<li>Adquiera imágenes de al menos 100 cometas por muestra utilizando el mismo tiempo de exposición en tres réplicas técnicas. NOTA: Las colas de los cometas al final de los cubreobjetos tienden a migrar de manera desigual y actúan como valores atípicos en la distribución de la muestra. La mayoría de los cometas capturados para los análisis están presentes cerca del centro del cubreobjetos (Figura 3).</li>
	<li>Exporte imágenes y puntúe los cometas, ya sea manualmente (usando la Imagen J) o mediante el uso de software de puntuación de cometas disponible gratuitamente. Los cometas que se distinguen individualmente y que están completamente contenidos en el campo de visión se seleccionan para la puntuación. Los cometas superpuestos o parcialmente visibles no se consideran para análisis posteriores (Figura 4). NOTA: Los usuarios pueden puntuar cometas en la Imagen J utilizando el siguiente complemento: https://cometbio.org/index.html. En la Figura 5 se incluyen los detalles de la puntuación de los cometas utilizando el software CometScore.</li>
	<li>Traza los momentos de cola adquiridos a partir de los análisis como diagramas de caja y bigotes que representan valores de percentil 10-90. Realizar pruebas de normalidad para determinar si se deben utilizar pruebas paramétricas o no paramétricas para los análisis estadísticos. NOTA: En la mayoría de los casos, las pruebas no paramétricas se aplican utilizando la prueba de Mann-Whitney si se comparan solo dos muestras o la prueba de Kruskal-Wallis con comparaciones múltiples de Dunn si se comparan tres o más muestras.</li>
</ol>

Investigación del alcance de las roturas de ADN que se producen durante la replicación del ADN 

<ol><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+as+a+requirement+for+development+of+the+contact+effect+in+Chinese+hamster+v79+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids.</a> Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+radiation-induced+DNA+damage+and+repair+in+tumor+and+normal+cells+measured+using+the+%26%2334%3Bcomet%26%2334%3B+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the &#34;comet&#34; assay.</a> Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).</li>
<li>Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>De Lapuente, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+and+its+applications+in+the+field+of+ecotoxicology%3A+A+mature+tool+that+continues+to+expand+its+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives.</a> Front Genet. 6, 180(2015).</li>
<li>Azqueta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+comet+assay+in+human+biomonitoring%3A+An+hcomet+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective.</a> Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288(2020).</li>
<li>Speit, G., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+sensitive+genotoxicity+test+for+the+detection+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage.</a> Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).</li>
<li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+DNA+modifications+with+the+comet+assay%3A+A+compendium+of+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols.</a> Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).</li>
<li>Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet-fish+technique%3A+A+tool+for+detection+of+specific+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair.</a> Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).</li>
<li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+kinase+atr%3A+Ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr%3A+An+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atr: An essential regulator of genome integrity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled DNA repair.</a> Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).</li>
<li>Strumberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+topoisomerase+I+cleavage+complexes+on+the+leading+strand+of+ribosomal+DNA+into+5%27-phosphorylated+DNA+double-strand+breaks+by+replication+runoff%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).</li>
<li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+inhibitors%3A+Camptothecins+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond.</a> Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).</li>
<li>Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camptothecin+induces+protein-linked+DNA+breaks+via+mammalian+DNA+topoisomerase+i%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i.</a> J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+brca2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li>
<li>Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+underlying+mechanism+for+the+parp+and+BRCA+synthetic+lethality%3A+Clearing+up+the+misunderstandings%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings.</a> Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).</li>
<li>Mcglynn, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromodeoxyuridine+comet+assay%3A+Detection+of+maturation+of+recently+replicated+DNA+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells.</a> Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).</li>
<li>Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+human+rad18-dependent+DNA+post-replication+repair+by+alkaline+bromodeoxyuridine+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay.</a> PLoS One. 8 (8), e70391(2013).</li>
<li>Thakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging+strand+gap+suppression+connects+BRCA-mediated+fork+protection+to+nucleosome+assembly+through+PCNA-dependent+CAF-1+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lagging strand gap suppression connects BRCA-mediated fork protection to nucleosome assembly through PCNA-dependent CAF-1 recycling.</a> Nat Commun. 13 (1), 5323(2022).</li>
<li>Vaitsiankova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp+inhibition+impedes+the+maturation+of+nascent+DNA+strands+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).</li>
<li>Dungrawala, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radx+promotes+genome+stability+and+modulates+chemosensitivity+by+regulating+rad51+at+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Radx promotes genome stability and modulates chemosensitivity by regulating rad51 at replication forks.</a> Mol Cell. 67 (3), 374-386.e5 (2017).</li>
<li>Townsend, A., Lora, G., Engel, J., Tirado-Class, N., Dungrawala, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dcaf14+promotes+stalled+fork+stability+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dcaf14 promotes stalled fork stability to maintain genome integrity.</a> Cell Rep. 34 (4), 108669(2021).</li>
<li>Lemacon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mre11+and+exo1+nucleases+degrade+reversed+forks+and+elicit+mus81-dependent+fork+rescue+in+brca2-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mre11 and exo1 nucleases degrade reversed forks and elicit mus81-dependent fork rescue in brca2-deficient cells.</a> Nat Commun. 8 (1), 860(2017).</li>
<li>Leung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr+protects+ongoing+and+newly+assembled+DNA+replication+forks+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms.</a> Cell Rep. 42 (7), 112792(2023).</li>
<li>Bhowmick, R., Mehta, K. P. M., Lerdrup, M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrator+facilitates+RNApii+removal+to+prevent+transcription-replication+collisions+and+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrator facilitates RNApii removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability.</a> Mol Cell. 83 (13), 2357-2366.e8 (2023).</li>
<li>Mosler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-loop+proximity+proteomics+identifies+a+role+of+ddx41+in+transcription-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">R-loop proximity proteomics identifies a role of ddx41 in transcription-associated genomic instability.</a> Nat Commun. 12 (1), 7314(2021).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+rad51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different rad51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).</li>
<li>Sestili, P., Cantoni, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotically+driven+radial+diffusion+of+single-stranded+DNA+fragments+on+an+agarose+bed+as+a+convenient+measure+of+DNA+strand+scission%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission.</a> Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).</li>
<li>Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fast+halo+assay%3A+An+improved+method+to+quantify+genomic+DNA+strand+breakage+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level.</a> Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).</li>
<li>Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+strand+breaks+in+individual+apoptotic+cells+by+the+in+situ+terminal+deoxynucleotidyl+transferase+and+nick+translation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays.</a> Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).</li>
<li>Hanada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-specific+endonuclease+mus81+contributes+to+replication+restart+by+generating+double-strand+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Este protocolo describe un ensayo NC para evaluar las roturas de ADN en células humanas en proceso de replicación activa. El protocolo es relativamente sencillo de realizar, y los investigadores pueden adaptarlo fácilmente a condiciones de pH alto para análisis alcalinos8. Incluye dos pasos críticos, como se describe en los pasos 3.7 y 4.5. En el paso 3.7, es esencial esparcir la agarosa derretida con células de manera uniforme a través del pozo para evitar que los cometas se superpongan durante el análisis. Asegúrese de que los agregados celulares se disuelvan antes de volver a suspender las células en agarosa. Evitar la liberación de la punta de la pipeta mientras se esparce la agarosa ayudará a minimizar la introducción de burbujas. Las condiciones para la electroforesis son cruciales para lograr una migración adecuada de la cola del cometa para la obtención de imágenes y el análisis. Los investigadores deben tener en cuenta la naturaleza de las líneas celulares utilizadas para el análisis, ya que el alcance de la migración de la cola y el porcentaje de células que exhiben colas de cometa varían según el tipo de célula (Figura 9). Por lo tanto, se recomienda determinar empíricamente el tiempo de ejecución de la electroforesis antes de la experimentación.
Si no se observan colas de cometa en muestras de control positivas (células tratadas con CPT), la eficacia del fármaco debe corroborarse en paralelo utilizando enfoques alternativos, como la inmunotinción para el marcador de daño en el ADN γH2AX. La migración extensa de la cola puede impedir el análisis de la inducción de ruptura. Minimizar el tiempo de electroforesis y evaluar la morfología de las células antes del análisis puede evitar la obtención de colas de cometas demasiado largas. Un secado insuficiente de las diapositivas puede dar lugar a imágenes borrosas y borrosas de los cometas. Asegúrese de que la agarosa en el portaobjetos del cometa se seque y se aplane uniformemente antes de teñir con 1x solución SYBR. Si el rango de inducción del pliegue es estrecho, la realización de una curva dosis-respuesta con CPT puede ayudar a determinar un rango de trabajo óptimo para fines experimentales. La aplicación de estos consejos para la solución de problemas ayudará a maximizar los resultados de estos ensayos.
Esta metodología de ensayo es rentable y altamente sensible en comparación con otras técnicas utilizadas para estudiar la inducción de roturas de ADN, como el ensayo Halo29,30, el ensayo TUNEL31 y la electroforesis en gel de campo pulsado32. Sin embargo, la técnica de ensayo actual tiene ciertas limitaciones. No proporciona un número preciso de lesiones de ADN, pero ofrece una estimación relativa de la acumulación de roturas en comparación con las células no dañadas. Además, no puede evaluar la inducción de rupturas que se produce de forma dependiente del ciclo celular. Para excluir cambios en la inducción de rupturas debidos a diferencias en la progresión del ciclo celular, los análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo deben realizarse en paralelo.

El ensayo del cometa es un método de electroforesis en gel que se utiliza para detectar roturas de ADN a nivel de una sola célula. Se basa en el principio de que las roturas abiertas del ADN migran en condiciones electroforéticas, mientras que el ADN intacto permanece en gran medida estático. El ADN roto migra porque las roturas dan lugar a la relajación del ADN superenrollado, lo que provoca su reubicación espacial gradual hacia el ánodo en la cámara electroforética, lo que da lugar a una apariencia similar a la de un cometa observada por inmunofluorescencia 1,2. A continuación, se mide el grado de daño en el ADN cuantificando la cantidad de ADN roto que ha migrado en relación con el ADN compacto.
Los dos métodos de ensayo de cometas más utilizados son el ensayo de cometa alcalino (AC) y el ensayo de cometa neutro (NC). El ensayo AC se realiza en condiciones de desnaturalización utilizando una solución de pH alcalino alto, mientras que el ensayo NC se lleva a cabo en una solución con pH neutro. Tanto los ensayos NC como los AC pueden detectar de forma fiable las roturas de ADN que se producen en el núcleo. Sin embargo, la versión alcalina también es ventajosa para detectar sitios alcalino-lábiles3. Ambos formatos del ensayo requieren el uso de condiciones de lisis para garantizar que el ADN esté libre de proteínas antes de la electroforesis.
Este ensayo es un método simple para detectar roturas de ADN y ofrece varias ventajas únicas para determinar el daño celular en el ADN. El método es relativamente fácil de configurar y requiere reactivos que se pueden preparar en el laboratorio o comprar a proveedores comerciales. Al tratarse de una técnica de resolución de una sola célula, el ensayo requiere muy poco material de partida. En particular, el ensayo NC puede medir roturas con alta sensibilidad, y se ha informado que detecta entre 50 y 10.000 roturas por célula4. La versatilidad de esta técnica queda demostrada por su amplia gama de aplicaciones, incluyendo la ecotoxicología5, la biomonitorización humana6 y los estudios de genotoxicidad7. El ensayo también puede utilizarse de forma fiable en varios tipos de células y adaptarse para ensayos de alto rendimiento8 y para evaluar roturas en regiones genómicas específicas9. Por lo tanto, este ensayo sirve como una técnica rápida y confiable para investigar la formación de roturas a nivel de una sola célula.
El proceso de replicación del ADN es constantemente desafiado por varios estresores endógenos y exógenos10,11. El estancamiento de los replisomas debido a tales lesiones puede causar roturas del ADN y dar lugar a una mayor inestabilidad del genoma. Las roturas del ADN también surgen a menudo como intermediarios de replicación para facilitar la reparación del ADN12. Además, varios agentes quimioterapéuticos inducen roturas de doble cadena (DSB) dependientes de la replicación, como la camptotecina (CPT)13,14,15 y los inhibidores de PARP 16,17. Por lo tanto, este ensayo sirve como una metodología poderosa para estudiar la naturaleza de las lesiones de ADN, evaluar el procesamiento de las horquillas de replicación e investigar el potencial terapéutico de los agentes que dañan el ADN. Las adaptaciones del ensayo que implican el marcaje de ADN recién sintetizado con BrdU han sido útiles para estudiar los fenotipos de estrés asociados a la replicación 18,19,20,21. En particular, el ensayo NC es un método fiable para estudiar la inducción de la rotura del ADN en el contexto de la replicación, como se ha demostrado en estudios que implican la caracterización de proteínas de horquilla22,23, el análisis de intermediarios de replicación24,25 y la investigación de conflictos de transcripción-replicación en el mantenimiento del genoma26,27. En este artículo, describimos un protocolo de ensayo NC con el objetivo de cuantificar las roturas de ADN durante la replicación en células humanas. Este protocolo puede ser implementado fácilmente por investigadores interesados en evaluar el daño asociado al estrés de replicación en una amplia variedad de células humanas en división.

<table><tbody><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Camptothecin</td><td>Selleckchem</td><td>S1288</td><td></td></tr><tr><td>Comet LMAgarose (LMA)</td><td>R& D systems</td><td>4250-050-02</td><td></td></tr><tr><td>CometAssay Electroforesis System II</td><td>R& D systems</td><td>4250-050-ES</td><td>Incluye tanque de electroforesis, tapa de seguridad, cables, bandejas portaobjetos de 2/20 pocillos y superposición de bandeja portaobjetos</td></tr><tr><td>Software</td><td>CometScore TriTek</td><td></td><td>de código abierto</td></tr><tr><td>CometSlide</td><td>R& Sistemas D</td><td>4250-050-03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM,</td><td>alta glucosa Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td>Microscopio de epifluorescencia <td>FisherSci</td><td>D128-4</td><td></td></tr><tr><td>Keyence</td><td></td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino - Premium</td><td>Bio-Techne</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Trypsin-EDTA (0,05%), rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 10.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T células</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>células hTERT-RPE-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Hidroxiurea</td><td>Millipore Sigma</td><td>H8627</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de PARP Olaparib</td><td>Selleckchem</td><td>S8096</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac&nbsp;</td><td>FisherSci</td><td>FB300Q</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos estériles con tratamiento</td> superficial <td>FisherSci</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I Tinción de gel de ácido nucleico (10,000x)</td><td>FisherSci</td><td>S7567</td><td></td></tr><tr><td>U2OS</td><td>cells ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>UVP&nbsp; HB-1000 Incubadora de hibridación</td><td>FisherSci</td><td>UVP95003001</td><td></td></tr></tbody></table>

detección de roturas de adn en células humanas en división mediante el ensayo de cometa neutro

Detection of DNA Breaks in Dividing Human Cells by Neutral Comet Assay

La replicación del ADN se ve constantemente desafiada por una amplia variedad de factores estresantes endógenos y exógenos que pueden dañar el ADN. Tales lesiones encontradas durante la duplicación del genoma pueden detener los replisomas y convertir las horquillas de replicación en roturas de doble cadena. Si no se reparan, estas roturas tóxicas del ADN pueden desencadenar reordenamientos cromosómicos, lo que conduce a una mayor inestabilidad del genoma y una mayor probabilidad de transformación celular. Además, las células cancerosas exhiben un estrés de replicación persistente, lo que hace que dirigirse a las vulnerabilidades de la horquilla de replicación en las células tumorales sea una estrategia atractiva para la quimioterapia. Una técnica muy versátil y potente para estudiar las roturas del ADN durante la replicación es el ensayo del cometa. Esta técnica de electroforesis en gel detecta de forma fiable la inducción y reparación de roturas de ADN a nivel de una sola célula. En este artículo, se describe un protocolo que permite a los investigadores medir el alcance del daño en el ADN en células humanas que se dividen mitóticamente utilizando agentes que detienen la horquilla en múltiples tipos de células. El acoplamiento de esto con la puntuación automatizada de cometas facilita un análisis rápido y mejora la fiabilidad en el estudio de la inducción de roturas de ADN.

Análisis de la inducción de rotura por reactivos de estrés de replicación Las células U2OS se trataron con DMSO, 4 mM de hidroxiurea (HU) o 100 nM de CPT durante 4 h y se analizaron para determinar la acumulación de roturas mediante el ensayo NC (Figura 6A). Mientras que CPT induce rupturas durante la fase S al bloquear la topoisomerasa-113, el agotamiento de los grupos de nucleótidos inducido por HU detiene las horquillas de replicación que se convierten progresivamente en DSB28. Los datos indican que la exposición a HU o CPT desencadena la inducción de rupturas en la fase S, que es detectable por ensayo NC.
Análisis de la inducción de rotura comparando la lisis a diferentes temperaturas Las células U2OS no tratadas se incubaron en tampón de lisis a temperatura ambiente (RT) o a 4 °C antes de los análisis de inducción de ruptura (Figura 6B). Los resultados indican que la temperatura a la que se realiza la lisis tiene un impacto mínimo en la migración de las colas en el ensayo.
Análisis temporal de roturas por hidroxiurea (HU) Las células U2OS se dejaron sin tratar o se trataron con 4 mM de HU durante 4 h y 8 h antes de los análisis de inducción de ruptura mediante el ensayo NC (Figura 7). Los resultados indican que el estancamiento prolongado de las bifurcaciones de replicación con HU provoca el colapso de la bifurcación de replicación en DSB.
Análisis dependiente de la dosis de las roturas por camptotecina Las células U2OS se trataron con dosis aumentadas de CPT durante 1 h y se recolectaron para análisis de rotura utilizando el ensayo NC (Figura 8). Mientras que la acumulación de roturas es mínima en las células no tratadas con CPT, el grado de inducción de roturas aumenta gradualmente con el aumento de la dosis de CPT, lo que demuestra la utilidad del ensayo en el estudio de los efectos dependientes de la dosis sobre la acumulación de roturas durante la replicación del ADN.
Análisis comparativo de roturas entre varios tipos de células Se evaluaron los niveles basales de roturas de ADN en tres tipos de células mitóticas divergentes: células epiteliales pigmentarias de la retina inmortalizadas con hTERT (hTERT-RPE-1), virus de simio 40 (SV40), antígeno T grande que expresa, células renales embrionarias humanas (HEK293T) y células de osteosarcoma óseo (U2OS) (Figura 9). Cada línea celular demostró una migración diferencial de los momentos de cola en ausencia de estrés de replicación adicional, que puede deberse a diferencias en la distribución del ciclo celular, la organización de la cromatina o el número de horquillas de replicación activas. Cada tipo de célula también se expuso a 1 μM de CPT durante 1 h para validar un aumento en las roturas de ADN dependientes de la replicación.
Análisis de la inducción de rotura por ensayo de CA Las células U2OS se trataron con DMSO, 4 mM de HU, 1 μM de CPT o 10 μM de olaparib, inhibidor de PARP (PARPi) y se analizaron para la inducción de ruptura (Figura 10). Las células se trataron con DMSO, HU y PARPi durante 2 h, mientras que el tratamiento con CPT fue durante 1 h. Los resultados indican que la exposición al estrés de replicación provoca la acumulación de roturas, lo cual es observable por el ensayo AC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática del ensayo NC. (A) El número requerido de células se siembra el día anterior en un plato de 6 pocillos. (B) Después de los tratamientos farmacológicos, las células se tripsinizan y se cosechan en PBS frío. (C) Las células se resuspenden suavemente en agarosa fundida en una proporción de 10:1 (10 μL de agarosa por 1 μL de suspensión celular) utilizando una punta de pipeta. (D) La suspensión celular se transfiere a un pocillo deslizante con una punta de pipeta y se extiende uniformemente para cubrir completamente la superficie del pocillo con agarosa. (E) Después de la incubación a 4 °C, los portaobjetos se sumergen en tampón de lisis, seguido de tampón TAE en frío 1x. (F) Las muestras se someten a electroforesis utilizando el aparato adecuado. (G) A continuación, los portaobjetos se sumergen en la solución de precipitación de ADN, seguida de una solución de etanol al 70%. (H) Después del secado, los pocillos se tiñen con 1x solución SYBR Green. (I) Las imágenes de los portaobjetos se obtienen utilizando un microscopio de epifluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig02.jpg"> Figura 2: Vista lateral de la agarosa en los pozos de deslizamiento del cometa. (A) Después de la incubación a 4 °C (paso 3.8), la agarosa solidificada aparece como una "burbuja" con forma convexa. (B) Después de secarse a 45 °C (paso 5.3), la agarosa aparece aplanada en el pocillo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig03.jpg"> Figura 3: Imágenes y análisis de cometas. (A) Los cometas dentro del círculo interior del pozo (resaltados en azul) se seleccionan para el análisis. Los cometas hacia el borde exterior del pozo se excluyen debido a los momentos de cola atípicamente más largos, lo que los marca como valores atípicos. (B) Al menos 100 cometas representativos son seleccionados al azar de la región de color azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig04.jpg"> Figura 4: Imagen representativa de los cometas obtenida del ensayo NC. El panel de la derecha muestra un campo de visión representativo de los núcleos teñidos de verde SYBR, mientras que el panel de la izquierda resalta la región (contorno verde) utilizada para marcar los cometas. Los núcleos que son parcialmente visibles o apilados cerca unos de otros (contorno rojo, panel derecho) no se incluyen en el análisis. Los cometas seleccionados para la puntuación deben distinguirse individualmente, estar completamente contenidos dentro del campo de visión y exhibir una intensidad de tinción uniforme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig05.jpg"> Figura 5: Puntuación representativa de los cometas obtenida del ensayo NC. (A) Los núcleos individuales se delinean utilizando el software CometScore. (B) La vista de espectro completo (panel izquierdo) está habilitada y el umbral (barra de corte) se ajusta para lograr una intensidad de señal óptima con un fondo mínimo. La señal de "espectro completo" debe corresponder a la imagen de "un solo tono" (imagen superior, panel derecho) y no exceder el contorno (imagen inferior, panel derecho). (C) La línea amarilla vertical en el recuadro está alineada con el centro de la cabeza del cometa, utilizando la parte más ancha de la cabeza del cometa como referencia para la consistencia. (D) La puntuación de cada cometa analizado se informa en la esquina superior derecha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig06.jpg"> Figura 6: Análisis de la inducción de rotura por reactivos de estrés de replicación. (A) Las células U2OS se trataron con DMSO, 100 nM de camptotecina (CPT) o 4 mM de hidroxiurea (HU) antes del análisis de inducción de rotura. El gráfico representativo muestra un aumento de la acumulación de roturas en las células tratadas con CPT o HU. (B) Las células U2OS no tratadas se sembraron en portaobjetos de cometa y se incubaron para lisis (paso 3.9) a temperatura ambiente (RT) o 4 °C para comparar el efecto de la temperatura de lisis. Los momentos de cola de los análisis se trazan como diagramas de caja y bigotes que representan valores de percentil 10-90, con valores medianos representados por líneas horizontales dentro de los cuadros. Los valores de p se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis con comparaciones múltiples de Dunn (valor de p de corte de 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig07.jpg"> Figura 7: Análisis temporal de roturas inducidas por hidroxiurea. Las células U2OS no se trataron o se trataron con 4 mM de HU durante 4 h u 8 h antes del análisis de inducción de la ruptura. El gráfico representativo muestra un aumento gradual en la acumulación de roturas en las células tratadas con HU. Los momentos de cola de los análisis se trazan como diagramas de caja y bigotes que representan valores de percentil 10-90, con valores medianos representados por líneas horizontales dentro de los cuadros. Los valores de p se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis con comparaciones múltiples de Dunn (valor de p de corte de 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig08.jpg"> Figura 8: Análisis dependiente de la dosis de las roturas inducidas por la camptotecina. Las células U2OS se trataron con DMSO o concentraciones crecientes de CPT (25 nM, 100 nM, 500 nM y 1 μM) durante 1 h antes del análisis de rotura. Los momentos de cola de los análisis se trazan como diagramas de caja y bigotes que representan valores de percentil 10-90, con valores medianos representados por líneas horizontales dentro de los cuadros. El gráfico representativo muestra un aumento dependiente de la dosis en los descansos inducidos por CPT. Los valores de p se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis con comparaciones múltiples de Dunn (valor de p de corte de 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig09.jpg"> Figura 9: Análisis comparativo de roturas en múltiples tipos de células. Las células hTERT-RPE-1, HEK293T y U2OS se trataron con DMSO o 1 μM CPT durante 1 h. El gráfico representativo muestra la extensión relativa del daño en el ADN en los tres tipos de células en presencia o ausencia de CPT. Los momentos de cola de los análisis se trazan como diagramas de caja y bigotes que representan valores de percentil 10-90, con valores medianos representados por líneas horizontales dentro de las cajas. Los valores de p se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis con comparaciones múltiples de Dunn (valor de p de corte de 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig10.jpg"> Figura 10: Análisis de la inducción de ruptura por el ensayo AC. Las células U2OS se trataron con DMSO, 4 mM de HU, 1 μM de CPT o 10 μM de inhibidor de PARP Olaparib antes del análisis de inducción de ruptura. Las células se trataron con DMSO, HU e inhibidor de PARP durante 2 h, mientras que el tratamiento con CPT fue durante 1 h. El gráfico representativo muestra un aumento de la acumulación de roturas en las células tratadas con inhibidores de CPT, HU o PARP. Los momentos de cola de los análisis se trazan como diagramas de caja y bigotes que representan valores de percentil 10-90, con valores medianos representados por líneas horizontales dentro de los cuadros. Los valores de p se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis con comparaciones múltiples de Dunn (valor de p de corte de 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig10large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reactivo</td>
			<td>Solución de trabajo</td>
		</tr><tr><td>Tampón de lisis</td>
			<td>SDS al 0,5%, Tris-Cl de 200 mM (pH 7,4), EDTA de 50 mM</td>
		</tr><tr><td>1x Tampón TAE</td>
			<td>40 mM de Tris base, 20 mM de ácido acético, 1 mM de EDTA en pH 8,45</td>
		</tr><tr><td>Solución de precipitación de ADN</td>
			<td>Acetato de amonio 1 M, etanol al 87%</td>
		</tr><tr><td>Solución de etanol al 70%</td>
			<td>70% Etanol en agua destilada</td>
		</tr><tr><td>1x Solución SYBR Green</td>
			<td>1x SYBR Verde en 1x tampón TAE</td>
		</tr><tr><td>Medios de cultivo DMEM</td>
			<td>DMEM con 7.5% FBS</td>
		</tr><tr><td>Medios de cultivo DMEM/F12</td>
			<td>DMEM/F12 con 7.5% FBS</td>
		</tr><tr><td>Solución alcalina de desenrollado (para uso en el ensayo de cometas alcalinos)</td>
			<td>200 mM de NaOH, 1 mM de EDTA en pH&gt;13</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Lista de tampones y soluciones.

Este protocolo está diseñado para investigar el alcance del daño en el ADN que se produce durante la replicación del ADN. En condiciones neutras, la inducción de roturas de ADN puede evaluarse fácilmente en un corto período de tiempo. Además, el protocolo es adaptable a otros tipos de células y a diversos reactivos de estrés de replicación.

Detección de roturas de ADN en células humanas en división mediante el ensayo de cometa neutro

DNA replication is constantly challenged by a wide variety of endogenous and exogenous stressors that can damage DNA. Such lesions encountered during ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

El video muestra el ensayo del cometa para detectar daños en el ADN después de la exposición a agentes nocivos. En condiciones alcalinas, el ADN se desenrolla y se desnaturaliza, y tras la electroforesis, el ADN dañado y no dañado migra de manera diferente en el gel de agarosa, formando una estructura en forma de cometa. El ADN no dañado que migra lentamente forma la cabeza circular del cometa, mientras que los fragmentos de ADN dañados que migran rápidamente forman la cola alargada del cometa.

Ensayo Comet para la detección de daños en el ADN en células

El ensayo cometa es una manera eficaz de detectar saltos de simple y doble hebra, incluyendo álcali-lábiles y sitios DNA-DNA/DNA-protein enlaces cruzados en el ADN en todas las células incluyendo neuronas del hipocampo. El método se aprovecha de la migración diferencial de ADN en un campo eléctrico debido a las diferencias en la cantidad de daño en el DNA.

Ensayo de daño del ADN en las neuronas del hipocampo utilizando el ensayo cometa

Se describe aquí una plataforma que permite la detección ensayo cometa de daño en el ADN con un rendimiento sin precedentes. Los patrones de dispositivos células de mamífero en un microarray y permite el procesamiento paralelo de 96 muestras. El enfoque facilita el análisis de daño en el DNA nivel de base, daño en el ADN inducido por la exposición-y de reparación del ADN cinética.

CometChip: Un gran procesamiento Plataforma 96-Bueno, para medir el daño del ADN en las células en micromatriz Humanos

El ensayo cometa es un método eficiente para detectar daños en el ADN como sola y doble hebra de ADN se rompe. Se describen ensayos cometa alcalino y neutral para medir el daño del ADN en células de cáncer para evaluar el efecto terapéutico de la quimioterapia.

Evaluar In Vitro el daño de ADN utilizando el ensayo cometa

Este protocolo describe varios procedimientos para preparar muestras de tejido congelado de alta calidad en el momento de la necropsia para su uso en el ensayo del cometa para evaluar el daño del ADN: 1) tejido picado, 2) células epiteliales raspadas del tracto gastrointestinal, y 3) tejido en cubos muestras, que requieren homogeneización utilizando un dispositivo de picado de tejido.

Uso de tejido congelado en el ensayo de cometas para la evaluación del daño causado por el ADN

Aquí describimos dos modificaciones del ensayo de fibra de ADN para investigar las brechas de ADN de cadena simple en la replicación del ADN después de la inducción de la lesión. El ensayo de fibra S1 permite la detección de huecos post-replicativos utilizando la endonucleasa S1 específica de ssDNA, mientras que el ensayo de llenado de huecos permite la visualización y cuantificación de la reparación de huecos.

Detección de acumulación y reparación de brechas post-replicativas en células humanas utilizando el ensayo de fibra de ADN

El ensayo del cometa es un medio popular para detectar daños en el ADN. Este estudio describe un enfoque para ejecutar diapositivas en variantes representativas del ensayo de cometas. Este enfoque aumentó significativamente el número de muestras al tiempo que disminuyó el tiempo de ejecución del ensayo, el número de manipulaciones de portaobjetos y el riesgo de daño a los geles.

Un enfoque de ensayo cometario de alto rendimiento para evaluar el daño del ADN celular

Este protocolo describe un método eficaz para cuantificar la diferencia en el daño del ADN inducido por los inhibidores de tipo I y tipo II en células mutantes FLT3 mediante la aplicación del ensayo cometa.

Ensayo Comet para cuantificar el daño en el ADN en células 32D que expresan mutantes FLT3 después de la exposición a inhibidores de FLT3 de tipo I y tipo II

"ADN electrónico" sensores, reagentless, biosensores electroquímicos que funcionan bien, incluso cuando son desafiados directamente en la sangre y otras matrices complejas, se han adaptado a la detección de una amplia gama de ácidos nucleicos, proteínas y los analitos de moléculas pequeñas. Aquí se presenta un procedimiento general para la fabricación y el uso de este tipo de sensores.

Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

Demostramos la asamblea y la aplicación de un dispositivo a escala molecular, alimentado por una proteína de la topoisomerasa. La construcción es un sensor bio-molecular que las etiquetas de dos grandes tipos de ADN se rompe en secciones de tejido uniendo dos fluoróforos diferentes a sus fines.

En la Asamblea in vitro de la semi-artificial de la máquina molecular y su utilización para la detección del daño del ADN

Aprende a detectar roturas de ADN en células humanas en división mediante el ensayo de cometa neutro. Este método evalúa daño durante la replicación y el estrés replicativo.

Detección de roturas de ADN en células humanas en división mediante el ensayo de cometa neutro

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