Name: Estrategia alternativa para analizar la invasión celular in vitro de cultivos 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Aprende a analizar la invasión de células tumorales in vitro utilizando heteroesferoides tridimensionales que incorporan células cancerosas y no neoplásicas. Este método evalúa la colocalización espacial y la dinámica de invasión en matriz extracelular.

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Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación de Apoyo a la Investigación Científica del Estado de São Paulo (FAPESP 20/10544-1 y 20/10664-7). Algunas imágenes se generaron utilizando BioRender.com.

El uso de células humanas primarias fue aprobado por el Comité Institucional de Ética en Investigación en Seres Humanos (CAAE 57895822.0.0000.5416) de la Facultad de Odontología de Araraquara - UNESP. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de células para cultivo celular en 3D
NOTA: Todos los pasos de esta sección deben realizarse dentro de una campana de flujo laminar.
<ol><li>Obtener suspensiones unicelulares de las células que formarán el heteroesferoide. NOTA: En este experimento, generamos esferoides (ver paso 2) que consisten en una línea celular OSCC (SCC9), fibroblastos (fibroblastos primarios asociados al cáncer de biopsias de cáncer de lengua) y monocitos (monocitos primarios de donantes sanos). Seleccionar el tipo de células de acuerdo con los intereses experimentales.</li>
	<li>Verifique el número de células y la viabilidad con un hemocitómetro y tinción con azul de tripano. NOTA: La proporción de células en este protocolo es de 5:3:2 (5.000 neoplásicas: 3.000 fibroblastos: 2.000 monocitos), totalizando 10.000 células por esferoide. Optimizar la proporción y el número total de células de acuerdo con los intereses experimentales.</li>
	<li>Diluir por separado las células en tubos de 1,5 ml con medio no suplementado adecuado para cada tipo de célula (por ejemplo, para células neoplásicas - DMEM/F12; para fibroblastos - DMEM; para monocitos - RPMI) para lograr una densidad de siembra adecuada de 5.000 células neoplásicas por pocillo, 3.000 fibroblastos por pocillo y 2.000 monocitos por pocillo, o 500.000 células por mililitro. NOTA: Para asegurar un número adecuado de células para el experimento, utilice un 20% más del total requerido, considerando las posibles pérdidas durante las etapas de tinción y centrifugación.</li>
	<li>Etiquete los diferentes tipos de células por separado utilizando distintas tinciones vitales fluorescentes que permanecen en las células vivas a través de varias generaciones. Añada concentraciones optimizadas de colorante fluorescente al medio que contiene células (p. ej., neoplásico: CFSE - colorante verde; fibroblasto: CMTPX - colorante rojo; monocito, violeta BMQC - colorante azul) e incube a 37 °C durante 20 min. NOTA: Seleccione sondas fluorescentes con diferentes espectros de excitación y emisión para evitar la superposición espectral de acuerdo con las especificaciones del microscopio confocal que se utilizará.</li>
	<li>Centrifugar las células a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para formar un pellet de celda. Aspire el medio con una pipeta de 200 μL y vuelva a suspender en 1 mL de 1x PBS.</li>
	<li>Centrifugar a 400 x g durante 5 min para formar un pellet de células y volver a suspender el número total de células en 1 mL de medio de cultivo suplementado de acuerdo con el tipo de célula/línea celular utilizada (p. ej., neoplásico - 100 μg/mL de estreptomicina, 100 UI/mL de penicilina, 10% (vol) de FBS y 400 μg/mL de hidrocortisona; fibroblastos y monocitos - 100 μg/mL de estreptomicina, 100 UI/mL de penicilina, 10% (vol) FBS). Verifique la intensidad de la fluorescencia en el microscopio y cuente las células con tinción con azul de tripano.</li>
</ol>2. 3D cultivo celular
NOTA: Este estudio empleó el método de campo magnético de bioimpresión11 para crear heteroesferoides. Aquí, las células se magnetizan utilizando nanopartículas magnéticas biocompatibles y se someten a fuerzas magnéticas suaves. Optimizar la relación entre las nanopartículas y las células según el tipo de célula. También se pueden utilizar métodos alternativos para establecer cultivos de esferoides. Realice los pasos de esta sección en una campana de flujo laminar.
<ol><li>Agregue nanopartículas magnéticas en una proporción de 1 μL de nanopartículas por cada 20.000 células, y vuelva a suspender completamente mezclando 10 veces.</li>
	<li>Centrifugar las celdas a 400 x g, temperatura ambiente, durante 5 min, y volver a suspender mezclando 10 veces. Repita este ciclo de centrifugación/resuspensión dos veces más. NOTA: Las células magnetizadas formarán una bolita de color marrón.</li>
	<li>Después de completar el último ciclo de centrifugación, aspire el medio y vuelva a suspender las células en 34 μL por pocillo (34 μL/5.000 células neoplásicas; 34 μL/3.000 células de fibroblastos; 34 μL/2.000 células monocitarias) de medio de cultivo suplementado (DMEM/F12 que contiene 100 μg/mL de estreptomicina, 100 UI/mL de penicilina y 5% (vol) FBS) para las células neoplásicas. NOTA: Calcule el volumen en función del tamaño del pozo. Este protocolo utilizó placas de 96 pocillos, con un total de 100 μL de medio por pocillo.</li>
	<li>Mezcle todas las células en un nuevo tubo para co-cultivar, y luego vuelva a suspender.</li>
	<li>Transfiera 100 μL de células cocultivadas a cada pocillo de una placa de fijación ultrabaja.</li>
	<li>Inserte el campo magnético de accionamiento de esferoide debajo de la placa para inducir la agregación y la formación de esferoides, y colóquelo en la incubadora (5% CO2, 37 °C) durante 3 h. NOTA: El tiempo de exposición al campo magnético puede variar según el tamaño o la composición del esferoide.</li>
	<li>Retire el campo magnético y coloque la placa en la incubadora (5% CO2, 37 °C) durante al menos 24 h para permitir la producción de proteínas de la matriz extracelular y las interacciones célula a célula/célula a matriz.</li>
</ol>3. Preparación de membrana microporosa recubierta de matriz extracelular
NOTA: Realice los pasos de esta sección en una campana de flujo laminar.
<ol><li>Agregue 50 μL de la matriz extracelular disponible comercialmente al centro de una membrana microporosa de 24 pocillos usando una punta de 200 μL. NOTA: Mantenga la matriz extracelular sobre hielo húmedo. No toque la membrana microporosa al colocar la matriz encima.</li>
	<li>Retire las burbujas con una aguja estéril y asegúrese de que la matriz cubra toda la superficie de la membrana.</li>
	<li>Colocar la membrana en la incubadora (37 °C) durante 1 h para permitir la formación de gel de la matriz extracelular.</li>
</ol>4. Ensayo de invasión
NOTA: Realice los pasos de esta sección en una campana de flujo laminar.
<ol><li>Añadir 500 μL de medio de cultivo DMEM/F12 suplementado con un 10% de suero fetal bovino a la cámara inferior de la membrana microporosa como quimioatrayente.</li>
	<li>Retire con cuidado el medio de los esferoides formados y agregue suavemente 50 μL/pocillo de medio DMEM/F12 fresco no suplementado sobre el heteroesferoide. NOTA: Este paso se puede realizar utilizando una unidad de retención para el método de campo magnético de bioimpresión.</li>
	<li>Corta el borde de una punta de baja retención de 200 μL con unas tijeras estériles. NOTA: El tamaño de la punta dependerá del tamaño del esferoide.</li>
	<li>Recoja el esferoide y 50 μL de medio con la punta de baja retención. NOTA: Realice este paso lentamente y con cuidado para evitar la disgregación del esferoide.</li>
	<li>Coloque el esferoide suavemente sobre la matriz extracelular. NOTA: No toque la matriz extracelular gelificada.</li>
	<li>Añadir con cuidado 150 μL de DMEM/F12 medio no suplementado gota a gota hasta alcanzar un volumen total de 200 μL.</li>
	<li>Coloque la placa en la incubadora (5% CO2, 37 °C) durante 48 h. NOTA: El tiempo de incubación puede variar según la línea celular o el protocolo.</li>
</ol>5. Adquisición de imágenes
<ol><li>Utilice un microscopio confocal para obtener imágenes.</li>
	<li>Configure el microscopio en función de las características de excitación y emisión de las tinciones fluorescentes vitales utilizadas (por ejemplo, colorante CFSE, láser de 488 nm y longitud de onda de detección de 520 nm; fibroblasto: colorante CMTPX, láser de 561 nm y longitud de onda de detección de 610 nm; monocito, colorante violeta BMQC, láser de 405 nm y longitud de onda de detección de 516 nm).</li>
	<li>Cargue la placa en la platina del microscopio.</li>
	<li>Localice esferoides/células utilizando el campo claro con un aumento de 10x.</li>
	<li>Ajuste el zoom a un aumento de 40x.</li>
	<li>Ajuste la potencia del láser y la ganancia del detector para cada canal fluorescente.</li>
	<li>Identifique el punto de inicio de Z-Stack como el plano focal de la membrana localizando los poros de la membrana utilizando el campo claro.</li>
	<li>Capture tres imágenes por debajo y de cinco a ocho imágenes por encima de la membrana a lo largo del eje z para cada canal, incluido el campo brillante. Asegure intervalos de 10 μm entre imágenes, cubriendo una profundidad total de 90-120 μm en el eje z.</li>
	<li>Guarde el proyecto como un archivo de extensión .czi después de generar las imágenes.</li>
</ol>6. Extracción de imágenes
NOTA: El uso del software de imagen se explica a continuación.
<ol><li>Abra el archivo .czi utilizando el software de edición de imágenes (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Haga clic en Procesamiento en la esquina superior derecha, luego seleccione Único. A continuación, haga clic en Método y elija Exportación de imagen.</li>
	<li>Seleccione el archivo en Entrada.</li>
	<li>Haga clic en el botón Parámetros , luego seleccione la siguiente configuración: Tipo de archivo (Formato de archivo de imagen etiquetada - . TIFF), Compresión (LZM), Redimensionar (100%), Aplicar curva de visualización y color de canal, Imágenes de canal individuales, Usar nombres de canal, Definir subconjuntos (Canal, seleccionar todos los canales), Posición Z (extraer todo), Región (Completo), Mosaicos (Exportar mosaicos seleccionados) y Exportar a (seleccione el archivo de destino). NOTA: Para extraer imágenes de canales combinados, seleccione los siguientes ajustes: Tipo de archivo (Formato de archivo de imagen etiquetada - . TIFF), Compresión (LZM), Redimensionar (100%), Aplicar curva de visualización y color de canal, Imagen de canales combinados, Usar nombres de canales, Definir subconjuntos (Canal, seleccione los canales específicos para superponer), Posición Z (extraer todo), Región (Completo), Mosaicos (Exportar mosaicos seleccionados) y Exportar a (seleccione el archivo de destino).</li>
	<li>Haga clic en el icono Aplicar ubicado en la esquina superior derecha. NOTA: Este paso exportará simultáneamente imágenes de los diferentes canales.</li>
</ol>7. Análisis de imágenes
NOTA: El uso del software libre se explica en este paso.
<ol><li>Haga clic en Archivo en la esquina superior izquierda, seleccione Abrir, elija la imagen y luego haga clic en Aceptar.</li>
	<li>Haga clic en Analizar, luego en Establecer medidas y seleccione Área, Densidad integrada y Etiqueta de visualización. Haga clic en Aceptar.</li>
	<li>Haga clic en Analizar y, a continuación, en Medir. NOTA: Asegúrese de que el área de todas las imágenes sea la misma. "Densidad integrada" muestra dos valores: (1) Densidad integrada sin procesar (RawIntDen): suma de todos los valores de píxel de la imagen; (2) Densidad integrada (intden): producto del valor medio de grises y del área. Dado que la imagen es de color RGB y el área de todas las imágenes es la misma, considere usar RawIntDen como valor de medición de fluorescencia. Las diferencias en los valores de fluorescencia (intensidad y cantidad) entre las imágenes pueden indicar variaciones en la invasión celular y la intensidad de la proliferación. Otro método para normalizar el patrón de invasión en la matriz extracelular hacia la membrana microporosa utilizando cocultivos de diferentes tipos celulares es calcular la relación de los valores de RawIntDen: Relación RawIntDen =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67114/67114eq01.jpg" style="margin: auto;"> Una relación de 1 representa la imagen/ubicación a lo largo del eje z con la mayor invasión/localización de células para ese tipo de célula específico.</li>
</ol>

Modelos 3D en Biología del Cáncer: Dinámica de Invasión en Heterosferoides

<ol><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+Mechanistic+insights+and+clinical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: Mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat Med. 12 (8), 895-904 (2006).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).</li>
<li>Friedl, P., Alexander, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+invasion+and+the+microenvironment%3A+Plasticity+and+reciprocity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer invasion and the microenvironment: Plasticity and reciprocity.</a> Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).</li>
<li>Wu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cancer+cell+invasion%3A+Patterns+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms.</a> Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 1-16 (2019).</li>
<li>Nagy, ÁG., Székács, I., Bonyár, A., Horvath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+automatic+monitoring+of+cancer+cell+invasion+into+an+epithelial+monolayer+using+label-free+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Simple and automatic monitoring of cancer cell invasion into an epithelial monolayer using label-free holographic microscopy.</a> Sci Rep. 12 (1), 1-13 (2022).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutat Res Rev Mutat Res. 752 (1), 10-24 (2013).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J Vis Exp. (88), e51046(2014).</li>
<li>Kapałczyńska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+A+comparison+of+different%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - A comparison of different.</a> Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2016).</li>
<li>Cacciamali, A., Villa, R., Dotti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+cultures%3A+Evolution+of+an+ancient+tool+for+new+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">3D cell cultures: Evolution of an ancient tool for new applications.</a> Front Physiol. 13, 1-15 (2022).</li>
<li>Trindade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+3D+cell+culture+State+of+the+art+and+current+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Magnetic 3D cell culture State of the art and current advances.</a> Life Sci. 286, 1-8 (2021).</li>
<li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell Int. 21 (1), 1-19 (2021).</li>
<li>Lin, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cancer+cell+invasion+and+T-cell+cytotoxicity+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture.</a> J Vis Exp. (160), e61392(2021).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Los cultivos tridimensionales de esferoides son un enfoque poderoso para investigar varios aspectos de la biología celular. En este estudio, presentamos un protocolo para evaluar la invasión de células neoplásicas utilizando heteroesferoides que imitan el microambiente tumoral en un enfoque multicapa y más dinámico. Este método permite evaluar la colocalización y los patrones de invasión en presencia de células estromales no neoplásicas.
Hay algunos pasos críticos que merecen consideración. En...

La invasión es un proceso en el que las células neoplásicas migran a través de la matriz extracelular hacia el tejido circundante 1,2. A medida que el tumor progresa, las células neoplásicas se exponen a microambientes cada vez más complejos. El microambiente tumoral incluye varios componentes de la matriz extracelular y tipos de células no neoplásicas. Las células estromalas, incluidos los fibroblastos y los macrófagos residentes, remodelan el microambiente mediante la secreción de componentes de la matriz extracelular y factores de crecimiento, y citocinas, que a su vez influyenen las funciones de las células neoplásicas. Las células leucocitarias estromales e infiltrantes también interactúan directamente con las células neoplásicas, entre sí y con la matriz extracelular en un microambiente tridimensional. En conjunto, la composición de TME influye en la eficacia y el patrón de invasión de células neoplásicas4.
La naturaleza compleja del microambiente tumoral requiere la implementación de metodologías eficaces para comprender las interacciones intercelulares dentro del tejido tumoral. La mayoría de los ensayos in vitro utilizados para evaluar la invasión se han realizado principalmente en modelos 2D tradicionales y/o cultivos de tipo unicelular 5,6,7,8, lo que simplifica en exceso el complejo proceso de invasión y tiene múltiples limitaciones, como la falta de arquitectura tisular, componentes estromales y reproducibilidad in vivo. Los cultivos de esferoides representan un modelo de cultivos 3D in vitro que imita la morfología de la masa tumoral, lo que permite interacciones célula-célula y célula-matriz que involucran características físicas y bioquímicas9. El uso de modelos de cultivo 3D ha crecido en las últimas décadas, y existen evidencias de que varios resultados biológicos, como la respuesta al tratamiento, la morfología celular y la expresión génica, son diferentes en comparación con el modelo 2D 9,10.
Este protocolo demuestra un método para evaluar la invasión in vitro en una matriz extracelular humana utilizando el cultivo de células esferoides, en 3D. Además, empleamos heteroesferoides compuestos por células neoplásicas, fibroblastos y monocitos para imitar el microambiente tumoral con dos tipos de células no neoplásicas relevantes. La obtención de imágenes de células por microscopía confocal a lo largo de diferentes planos de invasión hacia una membrana microporosa permite la visualización de este proceso en un contexto más dinámico y multicapa.

<table><tbody><tr><td>Kit de bioimpresión de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-one</td><td>&nbsp; 655840</td><td>Campo magnético de accionamiento esferoide. Accionamiento de retención. Microplaca de 96 pocillos, superficie repelente de células</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Kit de proliferación celular</td><td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker rojo CMTPX</td><td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker violeta BMQC Dye</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>C10094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Matriz extracelular con Myogel</td><td>doi: 10.1186/s12885-015-1944-z</td><td></td><td>Mezcla compuesta por miogón (2,4 mg/mL), colágeno (0,8 mg/mL) y medio no suplementado de célula neoplásica&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma</td><td>H088</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Nanoshuttle-PL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657841</td><td>Aguja de nanopartículas magnéticas</td></tr><tr><td>23 G</td><td>Medix</td><td></td><td>AHMD004 25 x 0,60 mm (23 G x 1)</td></tr><tr><td>PBS pH 7,2 (1x)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>2012-027</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (5,000 U/mL)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>Axygen, Corning Inc.</td><td>TF-200-L-R-S Punta de</td><td>pipeta con barrera (filtro), 200 &micro; L Filtro de baja retención, corto, máxima recuperación</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>TransWell 24 pocillos</td><td>Costar, Corning Inc.</td><td>3422</td><td>Soportes permeables Transwell Inserto de 6,5 mm, placa de 24 pocillos; 0,8 y micro; m Membrana de policarbonato</td></tr><tr><td>Zen 3.4 (edición azul)</td><td>Zeiss Group</td><td></td><td>Software</td></tr></tbody></table>

estrategia alternativa para analizar la invasión celular in vitro de cultivos 3d

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

El cultivo de esferoides es un modelo 3D que proporciona una mejor replicación del microambiente in vivo en comparación con los cultivos bidimensionales (2D) tradicionales. La invasión es un resultado celular de sumo interés en la biología del cáncer. En este protocolo, hemos ideado una estrategia alternativa para evaluar la invasión de células cancerosas in vitro, empleando heteroesferoides compuestos por carcinoma oral de células escamosas (OSCC), fibroblastos asociados al cáncer (CAF) y monocitos. Estos heterosferoides tienen como objetivo imitar el microambiente tumoral (TME), incluyendo dos tipos de células no neoplásicas relevantes junto con las células cancerosas. Cada tipo de célula se marcó con marcadores fluorescentes vitales que emitían en distintas longitudes de onda antes de la formación de esferoides. Una vez formados, los heteroesferoides se sembraron en una capa de matriz extracelular derivada del leiomioma humano en el compartimento superior de una membrana microporosa. La invasión se evaluó en el eje z mediante microscopía confocal. Se obtuvieron imágenes digitales en los canales fluorescentes correspondientes a intervalos de 10 μm, cubriendo una profundidad de 90 μm en el eje z. El análisis se realizó utilizando un software de imagen gratuito mediante el cálculo de la intensidad de fluorescencia integrada en cada imagen y canal de fluorescencia. Este enfoque permite un análisis más dinámico de los patrones de invasión celular en un contexto de múltiples capas, así como el examen de la colocalización espacial de diferentes tipos de células durante la invasión.

Este estudio presenta un método alternativo para evaluar la invasión celular in vitro utilizando esferoides compuestos por diferentes tipos de células. Permite el análisis de los patrones de invasión celular en un contexto multicapa y el examen de la dinámica de colocalización celular durante la invasión (Figura 1).
Las imágenes de campo claro representan la localización de esferoides/células, identificadas por aglomerados oscuros/negros (<strong class="x...

La invasión es un fenómeno biológico importante en el desarrollo y la progresión del cáncer. Este proceso está influenciado por las células no neoplásicas y los componentes del microambiente tumoral. El propósito de este estudio es describir un método alternativo para analizar la invasión de células tumorales in vitro utilizando cultivos tridimensionales (3D).

Estrategia alternativa para analizar la invasión celular in vitro de cultivos 3D

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

alternative-strategy-to-analyze-in-vitro-cell-invasion-of-3d-cultures

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Investigación

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Cancer Research

Investigación del cáncer

Un ensayo para medir cuantitativamente el factor transformador del crecimiento (TGF)-β-inducida por invasión en geles de colágeno en 3 dimensiones se describe. Este ensayo se aprovecha de la serie MCF10A de líneas celulares, que representan diferentes etapas de desarrollo de cáncer de mama. Este método puede ser aprobada para su uso con otras líneas celulares y podrían ser utilizados para investigar otras posibles activadores o inhibidores de la invasión.

Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

Los modelos de la invasión de células tumorales en tres dimensiones de la matriz extracelular para reflejar mejor...

Modelado y de imagen de 3 dimensiones invasión celular colectiva

Este video describe la técnica de utilizar una matriz nativa para estudiar la invasión de células tumorales. La técnica utilizada en este ensayo proporciona la capacidad de evaluar las interacciones entre células epiteliales y mesenquimales en un entorno 3D sin la necesidad de una matriz sintética o extraña.

Ensayo de invasión de células tumorales: un método 3D in vitro basado en matrices nativas para evaluar las interacciones entre las células epiteliales y mesenquimales

De uso general, se describen métodos muy accesibles para el examen de la migración celular y la invasión in vitro. El primer método es el ensayo de cierre de la herida de células que mide la motilidad celular. El segundo método es la migración y la invasión de ensayo Transwell que evalúa la quimiotaxis y la capacidad invasiva de las células.

En la migración celular y la invasión ensayos in vitro

Este artículo proporciona metodologías detalladas para el uso de ensayos (3D) en tres dimensiones para cuantificar la invasión de células de cáncer de mama. En concreto, se discuten los procedimientos necesarios para configurar este tipo de ensayos, la cuantificación y el análisis de datos, así como los métodos para examinar la pérdida de integridad de la membrana que se produce cuando las células invaden.

La cuantificación de la invasividad de las células del cáncer de mama El uso de un modelo (3D) Tres Dimensiones

Este artículo de video describe un método in vitro modificado para examinar el papel de las hormonas, citocinas y/o factores de crecimiento en la invasión de células cancerosas.

Un Modificado<em&gt; In vitro</em&gt; Invasión Ensayo para determinar el papel potencial de hormonas, citoquinas y / o factores de crecimiento en la invasión de células del cáncer de Mediación

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Este método evalúa la invasión de células cancerosas desde esferoides a una matriz 3D circundante.  Los esferoides se generan mediante el método de cultivo de gota colgante y luego se incrustan en una matriz compuesta por materiales de membrana basal y colágeno tipo I.  Posteriormente, se monitorea la invasión de los esferoides.

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Mover hacia arriba: Un Simple y Flexible In Vitro invasión tridimensional protocolo

El actual protocolo describe un método integrado de investigación migración de la célula de cáncer y la invasión en una única plataforma en tiempo real, proporcionando una opción fácilmente reproducible y eficiente para estudiar la morfología y movilidad de la célula.

Un flujo de trabajo Simple migración/invasión usando a un sensor automatizado de células vivas

El enfoque presentado evalúa simultáneamente la invasión de células cancerosas en ensayos esferoides 3D y citotoxicidad de células T. Los esferoides se generan en un molde multimicropopo sin andamios. El cocultivo y la incrustación en la matriz de colágeno tipo I se realizan dentro del mismo dispositivo que permite monitorear la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad mediada de las células T.

Monitoreo de la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el cultivo 3D

Aprende a analizar la invasión de células tumorales in vitro utilizando heteroesferoides tridimensionales que incorporan células cancerosas y no neoplásicas. Este método evalúa la colocalización espacial y la dinámica de invasión en matriz extracelular.

Estrategia alternativa para analizar la invasión celular in vitro de cultivos 3D

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