Análisis específico de hebras de proteínas en cadenas replicantes de ADN mediante el enriquecimiento y secuenciación del método de ADN naciente asociado a proteínas

Nuestra investigación se centra en el mecanismo de la herencia epigenética. En concreto, la replicación del ADN acopló el proceso de reciclaje de histonas parentales, que representan el primer paso emisor en la herencia epigenética. Se identificó que la deposición de múltiples histonas parentales que están involucradas en la replicación del ADN desempeñan un papel importante en el reciclaje de histonas parentales.

Esto incluye el complejo D helicasa, la ADN polimerasa y el complejo de replicación para la protección. Los enfoques genéticos y bioquímicos tradicionales han sido valores utilizados en este campo de investigación. Tradicionalmente, se emplean métodos de secuenciación de alto rendimiento para comprender el proceso de transferencia de histonas parentales.

Antes de que se desarrollara el enriquecimiento y la secuenciación del ADN asociado a proteínas, o método de experimento, era un desafío estudiar el proceso de transferencia de histonas parentales. El método experimental proporcionó una herramienta poderosa para abordar estas preguntas fundamentales. Para comenzar, lima los gránulos de células de levadura y vuelve a suspenderlos mediante un suave vórtice.

A continuación, lavar el mismo con 0,4 mililitros de tampón de lisis CHIP que contiene inhibidores de la proteasa y una mezcla de antibióticos para evitar la contaminación bacteriana. Centrifugar la mezcla a 5.000 g durante un minuto. A continuación, añada 0,1 mililitros de tampón de lisis CHIP con inhibidores de la proteasa y mezcla de antibióticos al pellet.

Seguido de aproximadamente 100 microlitros de perlas de vidrio de 0,5 milímetros. Lise las células mediante cordones durante tres ciclos en una cámara frigorífica de cuatro grados centígrados. Con una aguja caliente de calibre 16, perfora agujeros en la parte inferior del tubo.

Recoja el lisado anidando el tubo perforado en un tubo vacío de ADN de baja unión de 1,5 mililitros y centrifugue a 1.600 G durante dos minutos a temperatura ambiente. Aspire con cuidado el sobrenadante sin alterar el pellet. La fracción de restos celulares contendrá la cromatina.

Vuelva a suspender los gránulos celulares pipeteando en 0,35 mililitros de micrococo nucleasa suplementada o tampón de digestión MNase. A continuación, agregue 10 unidades de MNase a la suspensión. Mezcle suavemente invirtiendo de cuatro a seis veces e incube en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 20 minutos.

Apague la digestión de la MNasa añadiendo cinco microlitros de EDTA 0,5 molar a una concentración final de 10 milimolares. Mezcle suavemente por inversión y coloque el tubo en hielo durante al menos 30 minutos. Utilizando microtubos Bioruptor de 1,5 mililitros, sonique la mezcla de reacción a alta potencia durante tres minutos con ciclos de 30 segundos de encendido y 30 segundos de apagado.

A continuación, centrifugar a 10.000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a tubos nuevos y centrifugue nuevamente a 10.000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Luego, recoja aproximadamente 400 microlitros del sobrenadante.

Guarde 30 microlitros como entrada de ADN para la extracción de ADN y congele a menos 20 grados centígrados. Utilice los 370 microlitros restantes de lisado celular para la inmunoprecipitación de cromatina de histonas. Para comenzar, hierva unos 150 microlitros de la entrada obtenida previamente y las muestras CHIP H3K4me3 en un bloque de calor de 100 grados Celsius Durante cinco minutos, enfríe inmediatamente la muestra en hielo durante cinco minutos.

Luego, agregue la cantidad requerida de los componentes mencionados a la muestra. Mutar la muestra durante dos horas en un rotor a cuatro grados Celsius y 10 RPM. Transfiera la mezcla a un tubo de 1,5 mililitros que contenga 20 microlitros de perlas de proteína G Sepharose lavadas.

Mutar la mezcla durante una hora a cuatro grados centígrados en el rotor a 10 RPM. Girar los tubos a temperatura ambiente a 800 g durante un minuto. Lave las perlas tres veces con un mililitro de bromo-desoxiuridina fría o tampón de inmunoprecipitación BrdU, rotando durante tres minutos para cada lavado.

Vuelva a centrifugar el tubo y lave con un mililitro de tampón TE durante tres minutos. Vuelva a girar los tubos a 800 g durante un minuto a temperatura ambiente y aspire el sobrenadante con cuidado. Agregue 100 microlitros de tampón TE con 1%SDS a las cuentas.

Incubar la mezcla a 65 grados centígrados durante cinco minutos, luego girar a 800 G durante un minuto a temperatura ambiente. Purifique el sobrenadante en 18 microlitros de tampón de elución utilizando columnas de purificación de ADN para obtener las muestras de inmunoprecipitación BrdU y H3K4me3 eSPAN. Prepare la biblioteca de ADN monocatenario con las muestras mencionadas siguiendo el manual del kit de preparación de la biblioteca de ADN inoxidable y de baja entrada.

Purifique el producto de ligadura en 20 microlitros de tampón de elución de EDTA bajo. Amplifique la biblioteca de ADN utilizando 50 microlitros de mezcla de reacción del kit de preparación de la biblioteca de ADN monocatenario. Después del ciclo mostrado, amplifique la mezcla de PCR.

Purifique los productos de PCR mezclándolos con 60 microlitros de perlas, precalentadas a 30 grados centígrados. Mezcle bien los productos de PCR y las perlas. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Unir las cuentas en un soporte magnético durante tres minutos y lavarlas dos veces con 200 microlitros de etanol al 80% recién preparado. Seque las perlas al aire durante dos minutos y diluya el ADN en 20 microlitros de tampón de bajo EDTA provisto en el kit de preparación de la biblioteca de ADN. Mida la concentración de la biblioteca y la distribución del tamaño de los fragmentos utilizando sistemas de electroforesis de alta resolución.

Agrupe cantidades iguales de bibliotecas individuales, incluida la inmunoprecipitación de cromatina H3K4me3 de entrada, la inmunoprecipitación BrdU, las muestras de eSPAN para realizar una secuenciación final emparejada en paralelo. Un análisis de gel típico de la biblioteca de secuenciación de ADN de H3K4me3 eSPAN reveló un patrón de escalera de nucleosomas de cromatina. La banda principal de mononucleosomas apareció a 270 pares de bases, donde los adaptadores se añadieron al fragmento de ADN obtenido de la digestión.

Los diferentes mapeos de muestras revelaron picos en los nucleosomas individuales que rodean el origen, replicando de forma autónoma la secuencia 607 en células de tipo salvaje y mcm2-3A. El sesgo promedio de la hebra reveló que en las células de levadura de tipo salvaje, la deposición de histonas parentales exhibió un ligero sesgo hacia la hebra rezagada. Sin embargo, en el parental mutante, la histona H3H4 se transfirió a la hebra principal.