Name: Análisis específico de hebras de proteínas en cadenas replicantes de ADN mediante el enriquecimiento y secuenciación del método de ADN naciente asociado a proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprende el método eSPAN para analizar la deposición de histonas parentales en levadura y células madre embrionarias de ratón. Esta técnica revela la dinámica de la replicación cromatínica y la herencia epigenética.

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Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud R35GM118015 (Z.Z.), R01GM130588 (C.Y.) y el Hormel Startup Fund (C.Y.).

<ol><li>Bell, S. P., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+recognition+of+eukaryotic+origins+of+DNA+replication+by+a+multiprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex.</a> Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).</li>
<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).</li>
<li>Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA replication fork.</a> Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).</li>
<li>Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+DNA+polymerase+epsilon+participates+in+leading-strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication.</a> Science. 317 (5834), 127-130 (2007).</li>
<li>Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Division of labor at the eukaryotic replication fork.</a> Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).</li>
<li>Daigaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+profile+of+replicative+polymerase+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A global profile of replicative polymerase usage.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).</li>
<li>Koyanagi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+replicative+DNA+polymerase+usage+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome.</a> Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).</li>
<li>Reijns, M. aM., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging-strand+replication+shapes+the+mutational+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome.</a> Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).</li>
<li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribose-seq%3A+Global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+DNA+polymerase+delta+in+initiating+and+terminating+leading+strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication.</a> Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+shows+protein+binding+at+replication+forks+and+PCNA+unloading+from+lagging+strands+when+forks+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall.</a> Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).</li>
<li>Gan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mcm2-ctf4-polalpha+axis+facilitates+parental+histone+h3-h4+transfer+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands.</a> Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+preventing+asymmetric+histone+segregation+onto+replicating+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands.</a> Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm2+promotes+symmetric+inheritance+of+modified+histones+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication.</a> Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+alpha+interacts+with+H3-H4+and+facilitates+the+transfer+of+parental+histones+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands.</a> Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+Evidence+that+histone+h4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut%26tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).</li>
<li>Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+brdu+incorporation+in+tk%28%2B%29+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains.</a> Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li>
<li>Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+vectors+for+simplified+construction+of+brdu-incorporating+strains+of+saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).</li>
<li>Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+of+DNA+synthesis+and+proteins+association+with+DNA+replication+forks+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).</li>
<li>Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+strand-specific+profiling+of+replicating+chromatin+with+enrichment+and+sequencing+of+protein-associated+nascent+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).</li>
<li>Rosebrock, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+budding+yeast+cell+cycle+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of the budding yeast cell cycle by flow cytometry.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+nucleosome+positions+in+yeast+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution.</a> Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Replication landscape of the human genome.</a> Nat Commun. 7, 10208(2016).</li>
<li>Foltman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+replisome+components+cooperate+to+process+histones+during+chromosome+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication.</a> Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).</li>
<li>Jia, J., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+MCM2-7+helicase+subunit+MCM2+in+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance.</a> Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).</li>
<li>Alabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+chromatin+capture+proteomics+determines+chromatin+dynamics+during+DNA+replication+and+identifies+unknown+fork+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components.</a> Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).</li>
<li>Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2d+gel+electrophoresis+to+detect+DNA+replication+and+recombination+intermediates+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).</li>
<li>Ramachandran, S., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mince-seq%3A+Mapping+in+vivo+nascent+chromatin+with+edu+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing.</a> Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+and+sister+chromatid-resolved+profiling+of+protein+occupancy+in+replicated+chromatin+with+CHOR-seq+and+SCAR-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq.</a> Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nanogram-range+immunoprecipitated+DNA+in+chip-seq+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application.</a> BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+parental+h3k9me3+in+s+phase+silences+l1+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements.</a> Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).</li>
<li>Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp1+roles+in+DNA+repair+and+DNA+replication%3A+The+basi%28c%29s+of+parp+inhibitor+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance.</a> Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).</li>
<li>Hanzlikova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase+as+a+sensor+of+unligated+Okazaki+fragments+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication.</a> Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La detección de proteínas asociadas a cadenas de replicación avanzadas y rezagadas es importante para comprender los mecanismos de replicación de la cromatina y el proceso asociado, que son directamente relevantes para la investigación del cáncer humano y los mecanismos de resistencia a los fármacos. Se han empleado varios métodos, como el gel 2D, la inmunoprecipitación nativa de Cromatina (nChIP), iPOND y la captura incipientede cromatina 29,30,31, para estudiar la replicación del ADN y procesos ...

En los organismos eucariotas, la duplicación del genoma se inicia desde múltiples sitios llamados orígenes de replicación, donde el complejo de reconocimiento de origen (ORC) se une e inicia la maquinaria proteica de reclutamiento, incluida la helicasa CMG, para iniciar la replicacióndel ADN 1. La maquinaria respondesora en cada origen de replicación forma dos bifurcaciones que se muevenbidireccionalmente 2,3. Las bifurcaciones de replicación gemela replican las dos cadenas parentales de ADN mediante la síntesis continua de la cadena principal y la síntesis discontinua de la cadena rezagada. Dada esta naturaleza asimétrica de cada horquilla de replicación, los componentes de replicación, incluidas las ADN polimerasas en las cadenas delantera y rezagada, son diferentes. Análisis genéticos previos basados en ADN polimerasas mutantes demuestran que el ADN Pol ε y el ADN Pol δ son las principales polimerasas responsables de la replicación de la cadena que lidera y rezaga respectivamente, 4,5. Se han desarrollado varios métodos para detectar la preferencia de hebras de la ADN polimerasa, incluyendo Pu-seq 6,7, HydEn-seq8 y emRiboSeq o RiboSeq 9,10. Estos métodos genéticos para diseccionar la especificidad de la cadena se limitan a las ADN polimerasas y requieren introducir mutaciones en cada proteína 4,5,11,12. Rastrear la asociación de cualquier proteína objetivo con cadenas delanteras y rezagadas de las horquillas de replicación del ADN proporcionará información valiosa sobre la replicación del ADN. En este esfuerzo, primero desarrollamos la técnica eSPAN (enriquecimiento y secuenciación de ADN naciendo asociado a proteínas, Figura 1) en células de levadura. Como estudio de prueba de principio, primero demostramos que Pol δ y Pol δ están enriquecidos en hebras guía y rezagada, respectivamente. También descubrimos la preferencia de hebras de componentes clave de replicación del ADN, incluyendo la helicasa replicativa de ADN, la proteína de unión al ADN de cadena simple (proteína de replicación A), la lámpara de antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) y su factor de replicación cargador C (RFC)13. Es importante destacar que nosotros y otros hemos utilizado este método para descubrir los mecanismos de transferencia parental de histonas, un proceso que fue intratable durante más de 4 décadas14, 15, 16, 17.
El método eSPAN implica dos pasos secuenciales: enriquecimiento de la proteína objetivo por ChIP18 o CUT&Tag 19 y enriquecimiento del ADN naciente asociado a la proteína mediante inmunoprecipitación con BrdU. En una cepa estándar de levadura (W303 o S288C), el BrdU o EdU extracelular no puede entrar en las células ni incorporarse en los cromosomas. Estas cepas carecen de un transportador nucleódico adecuado para la captación de timidina ni de la timidina quinasa necesaria para fosforilar la timidina en TMP, que convierte BrdU (o EdU) en BrdUMP (EdUMP). La expresión del transportador nucleódico equilibrativo humano 1 (hENT1) y del virus del herpes simple timidina quinasa (HSV-TK) potencia la absorción de timidina y la conversión de BrdU (o EdU) en BrdUMP (EdUMP)20. Por lo tanto, para realizar el experimento eSPAN en levadura, las cepas tuvieron que insertarse con una estructura BrdU-Incorporadora (BrdU-Inc) (HSV-TK y hENT1)13,21.
Anteriormente, proporcionamos el protocolo eSPAN para proteínas de replicación de ADN en lalevadura 22. Recientemente, integramos el método CUT&Tag en el protocolo eSPAN en células de mamíferos para abordar pasos técnicamente complejos que requieren optimización, como la reticulación, el corte de cromatina, y para minimizar el número de célulasiniciales 17,23. Aquí, proporcionamos eSPAN de histonas para visualización utilizando células de levadura (Figura 2). Este método se utiliza principalmente para analizar la distribución de formas modificadas de histonas en cadenas de ADN replicantes. Aunque analizamos varias marcas de histonas, usamos H3K4me3, una marca en la histona parental H3, como ejemplo. Para analizar componentes y factores replicsomas implicados en la reparación del ADN en bifurcaciones de replicación, recomendamos cortar la cromatina en pequeños fragmentos mediante la sonicación, como se describe en nuestra primerapublicación 22. Para las células de mamíferos, adoptamos los procedimientos modificados Cut&Tag para reemplazar el paso ChIP descrito en lalevadura 23. Esta modificación reduce la cantidad de material de partida (células) y, lo más importante, permite la generación de bibliotecas eSPAN para la secuenciación sin el uso de kits de preparación de ADN monocatenario. Para el protocolo de levadura, optamos por no usar el método Cut&Tag porque la cantidad de material inicial era suficiente. Más importante aún, descubrimos que los procedimientos Cut&Tag no eran consistentemente efectivos para las células de levadura en nuestras manos.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL de tubos de baja unión de ADN &nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Buffer de amplificagase 10x</td><td>Lucigen</td><td>A1905B</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS y nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10 TBS</td><td>BioRad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>16 G x 1-1/2 in. BD PrecisionGlid Needle</td><td>BD Biociencias</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>KIT DE BIBLIOTECA ACCEL-NGS 1S MÁS ADN</td><td>Tecnologías integradas de ADN</td><td>10009817</td><td>kit de preparación de la biblioteca de ADN ssDNA y de baja entrada &nbsp;</td></tr><tr><td>Bioanalizador Agilent 2100 &nbsp;</td><td>Agilent</td><td>Bioanálisis 2100</td><td></td></tr><tr><td>Kit Agilent DNA 1000 &nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5607-1504</td><td></td></tr><tr><td>Ampligase&nbsp;</td><td>Lucigen</td><td>A0110K</td><td>Manipula el paraformaldehído con cuidado, es sólido inflamable y peligroso.</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo SPRI XP AMPure</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos anti-BrdU y nbsp;</td><td>BD Biociencias</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-H3K4me3 &nbsp;</td><td>ABCAM</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>Contador de celdas automatizado&nbsp;, modelo TC10</td><td>BioRad</td><td>145-0001</td><td></td></tr><tr><td>Bacitracina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11702</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptona&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>211830</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de Benzamidina &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B2417</td><td>Sólidos combustibles</td></tr><tr><td>BrdU&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Trata el BrdU con cuidado, ya que es un posible mutágeno y teratógeno.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivos celulares &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific y nbsp; Incubadora de CO2 con camisa de agua modelo Forma serie II</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo celular y nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Línea celular ES-E14&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chelex-100&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1422842</td><td>200&ndash; Tamaño de malla seca 400</td></tr><tr><td>Cloroformo&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas magnéticas recubiertas de concanavalina A (ConA) y perlas magnéticas recubiertas de Concanavilina A y perlas magnéticas</td><td>Policiencias</td><td>86057-10</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Millipore</td><td>300410-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>E. coli&nbsp; tRNA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>etanol y la información</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>Manipula el etanol con cuidado, es inflamable</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol y nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td>Manipula el isopropoñol con cuidado, es inflamable</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>sigma</td><td>221473</td><td>Manipula el KOH con cuidado, es corrosivo</td></tr><tr><td>Vacío a baja velocidad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soporte magnético y soporte magneto;</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>Ciclador térmico de PCR de gradiente Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td>5331</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Nucleasa microcócica &nbsp; (MNase)</td><td>Worthington</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación PCR MinElute &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Batedor de cuentas pequeñas</td><td>Mini BeadBeater 24 Disruptor</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrífugas y nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>Vibrador multiplataforma</td><td>Fisherbrand</td><td>02-217-765</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitadores multiplataforma</td><td>Índice de referencia</td><td>INCU-SHAKER 10L</td><td></td></tr><tr><td>Bloque térmico multitérmico y nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Termomezclador C</td><td></td></tr><tr><td>N-[Tris(hidroximetil)metilo]-3-aminopropanesulfónico ácido &nbsp; (GOLPES)</td><td>Sigma</td><td>T5130</td><td>200&ndash; Tamaño de malla seca 400</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Manipula el NaOH con cuidado, es corrosivo</td></tr><tr><td>NEBNext HiFi 2 veces; Mezcla maestra PCR</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Igepal CA-630</td><td>Termo Científica</td><td>J61055. AP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldhído</td><td>sigma</td><td>158127</td><td>Manipula el paraformaldehído con cuidado, es sólido inflamable y peligroso.</td></tr><tr><td>enzima pA-Tn5 &nbsp;</td><td>Addgene</td><td>121137</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc</td><td>Sigma</td><td>11429868001</td><td></td></tr><tr><td>Fenol-cloroformo-isoamílico alcohol &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15593049</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta P1000, P200, P20 y P2</td><td>Eppendorf</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Comprimido cóctel inhibidor de proteasa</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Comprimido cóctel inhibidor de proteasa &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G-perlas de sefarosa&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-02</td><td></td></tr><tr><td>Solución de precipitación de proteínas</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Solución de precipitación de proteínas</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td>Manipula el KOH con cuidado, es corrosivo</td></tr><tr><td>Solución de precipitación de proteínas &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>311584401</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR kit de purificación&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>Sigma</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro&nbsp;</td><td>Thermo Scientific.</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Pol</td><td>New England Biolabs, &nbsp;</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>extracto de levadura y nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>212730</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis específico de hebras de proteínas en cadenas replicantes de adn mediante el enriquecimiento y secuenciación del método de adn naciente asociado a proteínas

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

La duplicación genómica se orquesta mediante proteínas respondesomes, incluidas las helicasas, que desenrollan el ADN de doble cadena en cadenas simples antiparalelas individuales, cada una requiriendo modos de replicación distintos: continua (adelantadora) y discontinua (lag). Comprender las interacciones de las proteínas asociadas a la cromatina con cadenas de ADN replicantes in vivo es crucial para esclarecer los mecanismos de ensamblaje de la cromatina y la reparación del ADN acoplados a la replicación del ADN. Este protocolo presenta el método de enriquecimiento y secuenciación de ADN naciente asociado a proteínas (eSPAN), diseñado para cuantificar los niveles relativos de proteínas en cadenas de ADN naciente y rezagada en horquillas de replicación. El procedimiento eSPAN comienza con inmunoprecipitación de cromatina (ChIP, en levadura) o escisión bajo objetivos y etiquetado (CUT&Tag; en células de mamíferos) de una proteína de interés, seguido del enriquecimiento del ADN naciente asociado a proteínas mediante inmunoprecipitación de bromodeoxiuridina (BrdU). Se aplica secuenciación de nueva generación específica de cadena a ADN ssDNA aislado. Esta técnica puede utilizarse para determinar si una proteína está enriquecida en las horquillas de replicación delanteras o rezagadas. El eSPAN proporciona preferencia de hebra a nivel genómico de proteínas asociadas a la cromatina, incluidas las histonas en los forks de replicación.

eSPAN puede utilizarse para adquirir información específica de la cadena sobre una proteína objetivo, como histonas y modificaciones de histonas. En este resultado representativo, se realizaron procesos de recogida de muestras y eSPAN siguiendo el esquema descrito en la Figura 2 utilizando el sistema de levadura de gemación. El tratamiento y la extracción de la muestra siguen la condición de fase S temprana tratada por hidroxiurea según este protocolo. Se emplearon dos cepas de levadura, WT ...

El enriquecimiento y secuenciación del ADN naciente asociado a proteínas (eSPAN) se desarrolló para detectar la abundancia relativa de una proteína asociada a la cromatina en dos cadenas de ADN replicantes, revelando así una visión molecular sobre la replicación de la cromatina y sus procesos acoplados. Este protocolo describe los procedimientos eSPAN en células madre embrionarias (ES) de levaduras y ratones.

Análisis específico de hebras de proteínas en cadenas replicantes de ADN mediante el enriquecimiento y secuenciación del método de ADN naciente asociado a proteínas

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

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Investigación

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Biología

Se describe un método para observar la replicación en tiempo real de las moléculas individuales de ADN mediada por proteínas del sistema de replicación del bacteriófago.

La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

enriquecimiento de ADNg para la secuenciación de NGS es una herramienta fácil y potente para el estudio de mutaciones constitucionales. En este artículo se presenta el procedimiento para analizar de forma sencilla la secuencia completa de 11 genes implicados en la reparación de daños en el ADN.

gDNA Enriquecimiento por una tecnología basada en la transposasa de Análisis NGS de la secuencia entera de BRCA1, BRCA2, y 9 genes involucrados en la reparación del ADN daños

En este protocolo, describimos una novedosa técnica BrdU-ChIP-Slot-Western para examinar proteínas y modificaciones de histonas asociadas con ADN recién sintetizado o naciente.

El examen de las proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero utilizando BrdU-chip-Slot-occidental Técnica

Describimos aquí un sistema que utiliza un bloque de proteínas in vivo reversible y específico del sitio para detener y colapsar las horquillas de replicación en Escherichia coli. El establecimiento del bloque de replicación se evalúa mediante microscopía de fluorescencia y se utiliza electroforesis en gel de agarosa en 2 dimensiones neutro-neutro para visualizar los intermedios de replicación.

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Describimos una técnica para combinar la citometría de flujo y la secuenciación de alto rendimiento para identificar regiones finales replicación del genoma.

G2-seq: Una alto rendimiento basado en la secuencia técnica para identificar replicación tardía de regiones del genoma

Se desarrolló un método no etiquetados, radio-isotópico para la corrección de la polimerasa de la DNA y un ensayo de reparación del ADN mediante espectrometría de masas MALDI-TOF alta resolución y una estrategia de extensión de un solo nucleótido. El ensayo demostró ser muy específico, simple, rápido y fácil de realizar para corregir y reparar los parches menor 9 nucleótidos.

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Análisis específico de hebras de proteínas en cadenas replicantes de ADN mediante el enriquecimiento y secuenciación del método de ADN naciente asociado a proteínas

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