Un proyecto exhaustivo para evaluar la eficacia de la eritropoyesis humana in vitro y ex vivo
10 de enero de 2025
El modelado de la eritropoyesis proporciona una valiosa oportunidad para comprender la importancia biológica de los actores en este proceso y para evaluar nuevos enfoques terapéuticos que puedan aliviar los defectos de diferenciación. Aquí, describimos un método simple y confiable para diferenciar de manera eficiente las células madre y progenitoras hematopoyéticas CD34+ ex vivo.
Nuestra investigación se centra en la leucemia, concretamente en los síndromes mielodisplásicos o neoplasias mielodisplásicas. Es una enfermedad de las células madre que se origina a partir de células madre hematopoyéticas. Afecta a varios linajes de células sanguíneas, en particular al linaje eritroide, que es responsable de la producción de células sanguíneas del corazón.
La interrupción de este linaje puede conducir a la anemia, que se observa comúnmente en los pacientes con MDS. La cartera de proyectos que proporcionamos en este artículo permite un método robusto y simplificado para evaluar la eficiencia del eritroblasto humano in vitro tras la modificación genética o el tratamiento farmacológico. Las células madre hematopoyéticas están presentes desde el nacimiento hasta el último momento de nuestras vidas.
Ya no hay tejido proliferativo en nuestro organismo con billones de células producidas cada día. Todavía hay muchas cosas por entender, por lo que seguiremos estudiando estas increíbles células en tejidos amino sanos con un fuerte énfasis en la proteostasis y la biología del ARN. Para empezar, descongele 100.000 células CD34+UCB sumergiendo el vial durante 30 segundos en un baño de agua a 37 grados centígrados.
Agregue un mililitro de medio descongelante gota a gota al vial, luego vuelva a suspender suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Transfiera la suspensión de la celda resuspendida gota a gota a cinco mililitros de medio de descongelación. A continuación, centrifugar la suspensión celular durante ocho minutos a 320 G a temperatura ambiente.
Lave las células con 10 mililitros de clasificación celular activada por fluorescencia o tampón FACS con ADNasa. Después de volver a centrifugar las células, vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de medio de estimulación. Transfiera dos mililitros de suspensión celular a una placa de 24 pocillos e incube la placa durante cuatro a seis horas a 37 grados Celsius.
A continuación, recoja las células en tubos de clasificación celular activados por fluorescencia y rellénelas con un mililitro de medio de células madre. Después de descongelar el virus, agregue el volumen requerido a los medios de estimulación para lograr una multiplicidad de infección de 30. Vuelva a suspender las células peletizadas en medios que contengan virus a una densidad de 100.000 células por cada 100 microlitros de virus y transfiéralas a un pocillo de una placa de 96 pocillos.
Agregue PBS a los pozos vacíos e incube durante la noche a 37 grados centígrados. A continuación, transfiera el volumen completo de la suspensión celular desde el pocillo de la placa de 96 pocillos a tubos FACS con un mililitro de medio de células madre. Lave el pocillo y la punta de la pipeta con medio de células madre para añadir dos mililitros de medio de células madre al tubo FACS.
Después de centrifugar el tubo FACS, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la célula en dos mililitros de medio de expansión. Transfiera la suspensión a un pocillo de una placa de 24 pocillos e incube las células. Para comenzar, transfiera el volumen completo de las células CD34+ transducidas con el reportero EGFP a un tubo FACS separado.
Centrifugar a 320 G durante ocho minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender las células peletizadas en 100 microlitros de tampón FACS. Agregue cinco microlitros de anticuerpo CD34 por tubo e incube los tubos en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante 20 minutos.
A continuación, vuelva a suspender las células en un mililitro de tampón FACS que contenga DAPI y centrifugar durante ocho minutos a 320 G a temperatura ambiente. Después de resuspender las células en 200 microlitros de tampón FACS que contiene DAPI, filtre la suspensión celular a través de un colador de 40 micrómetros antes de clasificar. A continuación, agregue 0,5 microlitros de anticuerpo CD34 a una gota de perlas en 100 microlitros de PBS.
Incubar la mezcla en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Luego agregue un mililitro de PBS a la mezcla. Centrifugar durante ocho minutos a 320 G a temperatura ambiente.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de PBS. A continuación, agregue células leucémicas GFP negativas y GFP positivas a un tubo FACS. Lave las células en un mililitro de tampón FACS.
Después de centrifugar las células, vuelva a suspender 100.000 células GFP negativas y 100.000 células GFP positivas, cada una en 500 microlitros de tampón FACS. Filtre la suspensión de celdas a través de un colador de 40 micrómetros antes de clasificar. A continuación, recoja las células clasificadas en un medio de células madre.
Centrifugar las células durante ocho minutos a 320 G a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a suspender las células en tres mililitros de medio de diferenciación eritroide. Ahora dispense un mililitro de las células resuspendidas en tres pocillos de una placa de 24 pocillos.
Llene todos los pozos exteriores con PBS. Para actualizar el medio, asegúrese de que las celdas se hayan asentado en la parte inferior de la placa. Incline suavemente la placa y retire 500 microlitros de medio.
A continuación, añada 500 microlitros de medios de diferenciación eritroide de citocinas 2X para refrescar la placa. En el sexto día, transfiera las celdas a una placa de 12 pocillos y agregue un mililitro de medio a cada pocillo para alcanzar un volumen final de dos mililitros. Recoja 200 microlitros de células de cada pocillo de la placa de 12 pocillos.
Reemplace el volumen eliminado con 250 microlitros de medios de diferenciación eritroide 2X. Agregue un mililitro de tampón FACS a cada tubo de recolección. Después de centrifugar los tubos, vuelva a suspender las células peletizadas en 100 microlitros de tampón FACS.
Agregue un microlitro de anticuerpos CD71, CD34 y CD235a a los tubos. A continuación, vuelva a suspender las células en un mililitro de tampón FACS que contenga DAPI. Centrifugar los tubos durante ocho minutos a 320 G a temperatura ambiente.
Resuspender las células en 200 microlitros de tampón FACS con DAPI. Establezca DAPI frente a dispersión lateral o SSC para excluir las celdas muertas. Establezca la altura de SSC frente al área de SSC para excluir agregados y seleccionar celdas individuales.
Establezca el área de dispersión hacia adelante frente a SSCA para eliminar los escombros en función del tamaño. Establezca CD235a frente a CD71. Establezca CD34 frente a SSCA.
Ejecute las células positivas para GFP y las células teñidas con DAPI. Compare las lecturas y aplique la compensación a la configuración del citómetro. Las células CD34 positivas de la sangre del cordón umbilical mostraron un aumento en las células apoptóticas positivas para la anexina V del 14,4% en el cuarto día al 34,2% en el día 17.
El gráfico de barras muestra un aumento significativo en el porcentaje de células positivas para la anexina V en el día 17, alcanzando aproximadamente el 40%
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Descripción general
Este estudio investiga la diferenciación de células madre y progenitoras hematopoyéticas CD34+ ex vivo, abordando los procesos críticos implicados en la eritropoyesis y sus implicaciones para el tratamiento de trastornos relacionados como los síndromes mielodisplásicos. Al proporcionar un método simplificado para evaluar la eficiencia de los eritroblastos, la investigación busca mejorar la comprensión de las alteraciones que conducen a la anemia en estos pacientes.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Erupocitosis
- Síndromes mielodisplásicos
- Biología de las células madre hematopoyéticas
Antecedentes
- Los síndromes mielodisplásicos son enfermedades de las células madre que afectan las líneas celulares sanguíneas.
- La alteración de la línea eritroide puede provocar anemia.
- Comprender las células madre hematopoyéticas es fundamental, ya que persisten durante toda la vida humana.
Métodos Utilizados
- Descongelación y resuspensión de células de CB CD34+
- Transducción celular con modificaciones genéticas
- Ordenación de células activada por fluorescencia (FACS)
Resultados Principales
- Las células CD34+ mostraron tasas de apoptosis aumentadas con el tiempo.
- Se demostró una diferenciación eficiente en eritroblastos.
- Los métodos específicos desarrollados permiten la evaluación tras la modificación genética o el tratamiento con fármacos.
Conclusiones
- El estudio demuestra un método sólido para la diferenciación de células hematopoyéticas que podría conducir a tratamientos más efectivos para la anemia causada por síndromes mielodisplásicos.
- Este trabajo subraya la importancia de comprender la diferenciación celular en la biología de las células madre.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación eficiente de la eritropoyesis humana es fundamental para reducir los riesgos en la descubrimiento temprano de fármacos en hematología y para comprender los mecanismos subyacentes a la anemia y a los síndromes mielodisplásicos. Esta metodología permite una evaluación cuantitativa y robusta de la diferenciación eritroide y la función génica en sistemas humanos tanto sanos como relacionados con enfermedades. El enfoque proporciona confianza predictiva en la validación de dianas terapéuticas y orienta las decisiones estratégicas sobre terapias que modulan la eritropoyesis.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar la función génica y el impacto de las vías sobre el compromiso con la línea eritroide.
- Apoya la reducción del riesgo biológico al cuantificar los efectos de perturbaciones genéticas o mediante compuestos sobre la eritropoyesis.
- Facilita la validación funcional de dianas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas primarias.
- Proporciona información mecanicista sobre alteraciones relevantes para enfermedades, como las observadas en los síndromes mielodisplásicos.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Establece sistemas validados in vitro y ex vivo para la selección de compuestos que afectan la diferenciación eritroide.
- Permite lecturas cuantitativas y reproducibles mediante citometría de flujo e identificación celular basada en marcadores.
- Facilita la estandarización de ensayos para garantizar comparabilidad entre estudios y equipos.
- Prepara plataformas escalables para evaluar estrategias de modulación génica y rescate farmacológico.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea hallazgos in vitro con modelos derivados de pacientes ex vivo para lograr una continuidad traslacional.
- Permite avanzar candidatos ajustados al riesgo con efectos demostrados sobre la eritropoyesis.
- Apoya el desarrollo de biomarcadores mediante el seguimiento de marcadores de diferenciación y apoptosis a lo largo del tiempo.
- Proporciona una desaceleración mecanicista del riesgo para la selección preclínica de candidatos en carteras de hematología.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método integra desde el descubrimiento inicial hasta la identificación de compuestos prometedores y la validación preclínica en líneas de investigación centradas en hematología.
- Biología del Descubrimiento: Cuantifica los efectos de genes y compuestos en la especificación y maduración de la línea eritroide.
- Tamizaje: Ofrece ensayos estandarizados y reproducibles basados en citometría de flujo para tamizaje de compuestos y genético.
- Analítica: Proporciona resultados cuantitativos como tasas de apoptosis y expresión de marcadores para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro y ex vivo con modelos de enfermedad relevantes para pacientes.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo modular y reutilizable, adaptable a diversos objetivos genéticos y bibliotecas de compuestos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas y el entendimiento mecanicista de la eritropoyesis.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad entre los equipos de I+D.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción y reduce el riesgo biológico en fases avanzadas de los programas de hematología.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de dianas y compuestos con efectos eritroides validados.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células madre hematopoyéticas y análisis mediante citometría de flujo.
- Necesita acceso a instrumentación FACS y paneles de anticuerpos validados para marcadores eritroides.
- Exige estandarización entre equipos de trabajo en estrategias de selección de eventos (gating) e interpretación de datos.
- Adaptable tanto a muestras de donantes sanos como de pacientes, lo que amplía su aplicabilidad.
- Depende de una fuente celular confiable y de un control de calidad riguroso para obtener resultados reproducibles.
