Cuantificación de glucosa de Bergmeyer para muestras microbiológicas

La investigación evalúa la concentración de glucosa en muestras microbianas utilizando técnicas de cuantificación a partir de filtros bacterianos y de levadura. El objetivo es mejorar la precisión de la masa de glucosa en gramos en estudios microbiológicos. Los desafíos incluyen cuantificar con precisión la baja concentración de glucosa en muestras microbianas complejas y distinguir entre las fuentes microbianas y ambientales de glucosa en cultivos mixtos.

La investigación ha demostrado una clara correlación entre cepas microbianas específicas y sus tasas de consumo de glucosa, revelando cómo los factores ambientales influyen en las vías metabólicas. Nuestro protocolo mejora la detección de glucosa al mejorar la especificidad y la sensibilidad, al tiempo que reduce el tiempo de procesamiento. El uso de ácido sulfúrico de forma controlada minimiza las interferencias.

Las investigaciones futuras se centrarán en la optimización de los métodos de detección de glucosa para aplicaciones de microbiología industrial y en la investigación del papel de un gen específico en el metabolismo de la glucosa en diversas condiciones ambientales. Para empezar, pesa 1,28 gramos de fosfato de dihidrógeno de potasio y 0,1304 gramos de fosfato de dipotasio en un vaso de precipitados de vidrio. Agregue 70 mililitros de agua desionizada y ajuste el pH a 5.5 usando ácido clorhídrico 1 molar o hidróxido de potasio.

Luego transfiera la solución a un matraz aforado de 100 mililitros y ajuste el volumen a 100 mililitros con agua desionizada. Guarde la solución preparada en un recipiente ámbar a 4-8 grados centígrados durante un máximo de tres meses. A continuación, pese 0,01 gramos de diclorhidrato de o-dianisidina en un tubo de centrífuga de 2 mililitros.

Con una pipeta de 1.000 microlitros, añada 1 mililitro de agua desionizada para disolver el compuesto y mezcle la solución lentamente. Envuelva el tubo de la centrífuga en papel de aluminio para protegerlo de la luz y guárdelo a 20 grados centígrados. A continuación, añada una solución de diclorhidrato de o-dianisidina a 10 mililitros de tampón de fosfato tomados en un matraz aforado de 100 mililitros y ajuste el volumen final a 100 mililitros con el tampón de fosfato.

Después de transferir la solución a un matraz de ámbar, guárdela a 4-8 grados centígrados durante 3-4 meses. Ahora coloque un matraz aforado de 100 mililitros con 30 mililitros de agua desionizada en un baño de hielo. Después de 10 minutos, vierta lentamente 51 mililitros de ácido sulfúrico al 98% por las paredes del matraz mientras lo agita suavemente.

Posteriormente, ajuste el volumen final a 100 mililitros con agua desionizada y transfiera la solución a un matraz de vidrio ámbar para su almacenamiento. Para la preparación de enzimas, pesa 0,01 gramos de glucosa oxidasa en un microtubo estéril de 2 mililitros. Agregue 1 mililitro de tampón de acetato de sodio de 50 milimolares a pH 5 al microtubo y mezcle suavemente.

Luego, en un nuevo microtubo de 2 mililitros, pese 0,0031 gramos de enzima peroxidasa y disuélvalo en 1 mililitro de tampón de fosfato ajustado a pH 5,5. Cubra ambos microtubos que contienen enzimas con papel de aluminio y guárdelos a 20 grados centígrados. A continuación, prepare una solución estándar de D-glucosa de 1 gramo por litro con agua desionizada.

Para comenzar, prepare el patrón de glucosa y todas las demás soluciones necesarias para el ensayo. Agregue el volumen adecuado de glucosa a los tubos nuevos de 2 mililitros. Ajuste un baño térmico seco a 37 grados centígrados y deje que se estabilice.

Añadir los volúmenes adecuados de tampón a cada microtubo, seguido de 3,3 microlitros de glucosa oxidasa y 1,2 microlitros de peroxidasa. Incuba los tubos a 37 grados centígrados y pon el temporizador en 20 minutos. Inmediatamente después de la incubación, agregue 750 microlitros de ácido sulfúrico al 50% a cada microtubo y colóquelos en un baño de hielo durante 2 minutos para que se enfríen.

Transfiera la mezcla enfriada de 1.500 microlitros a una cubeta de plástico y mida la absorbancia a 529 nanómetros. A continuación, limpie el área de trabajo con una solución de alcohol al 70% y encienda un quemador para asegurar la asepsia. Obtener bacterias o levaduras en un medio de cultivo líquido.

Transfiera 100 microlitros del cultivo a microtubos de 1,5 mililitros utilizando puntas estériles. Centrifugar las muestras a 7.500 g durante 7 minutos a 4 grados centígrados. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante, que contiene glucosa en solución.

Mezclar 0,5 microlitros del sobrenadante con todos los componentes necesarios para preparar la mezcla de reacción. Incubar los microtubos durante 20 minutos a 37 grados centígrados, e inmediatamente añadir 750 microlitros de ácido sulfúrico al 50%. Deje que la mezcla se enfríe en un baño de hielo durante 2 minutos.

Finalmente, mida la absorbancia a 529 nanómetros. El análisis espectrofotométrico indicó un pico máximo de absorbancia de 529 nanómetros. El análisis del consumo de glucosa por Debaryomyces hansenii demostró resultados consistentes entre los métodos de glucosa oxidasa y DNS hasta que surgieron diferencias significativas a las 6, 8 y 12 horas.

La aplicación del método del ácido sulfúrico de la glucosa oxidasa facilitó el análisis de altas concentraciones de glucosa de hasta 100 gramos por litro, con resultados fiables tras la dilución.