Name: Utilización del ensayo de desplazamiento térmico para sondear la unión del sustrato a la selenoproteína O (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 3 min 9 s
Description: Aprende a utilizar el ensayo de desplazamiento térmico para analizar la unión de nucleótidos y metales a la selenoproteína O. Esta técnica fluorescente de alto rendimiento permite estudiar interacciones proteicas y determinar condiciones estabilizantes para cristalografía.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Ensayos de desplazamiento térmico de alto rendimiento para interacciones proteína-ligando

<ol><li>Dunham, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+genes%3A+Time+to+follow+the+roads+less+traveled%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Human genes: Time to follow the roads less traveled.</a> PLoS Biol. 16 (9), e3000034(2018).</li>
<li>Kustatscher, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+invitation+to+the+understudied+proteins+initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An open invitation to the understudied proteins initiative.</a> Nat Biotechnol. 40 (6), 815-817 (2022).</li>
<li>Jones, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+genomics+consortium%3A+A+knowledge+platform+for+drug+discovery%3A+A+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Rand+Health+Q%22%5BJournal%5D)">The structural genomics consortium: A knowledge platform for drug discovery: A summary.</a> Rand Health Q. 4 (3), 19(2014).</li>
<li>Oberg, N., Zallot, R., Gerlt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efi-est%2C+efi-gnt%2C+and+efi-cgfp%3A+Enzyme+function+initiative+%28efi%29+web+resource+for+genomic+enzymology+tools%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Efi-est, efi-gnt, and efi-cgfp: Enzyme function initiative (efi) web resource for genomic enzymology tools.</a> J Mol Biol. 435 (14), 168018(2023).</li>
<li>Pace, C. N., Mcgrath, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stabilization+of+lysozyme+to+thermal+and+guanidine+hydrochloride+denaturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrate stabilization of lysozyme to thermal and guanidine hydrochloride denaturation.</a> J Biol Chem. 255 (9), 3862-3865 (1980).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).</li>
<li>Huynh, K., Partch, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+stability+and+ligand+interactions+by+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein stability and ligand interactions by thermal shift assay.</a> Curr Protoc Protein Sci. 79, 21-28 (2015).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformationally+responsive+dyes+enable+protein-adaptive+differential+scanning+fluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Conformationally responsive dyes enable protein-adaptive differential scanning fluorimetry.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.01.23.525251 (2023).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+performing+and+optimizing+differential+scanning+fluorimetry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for performing and optimizing differential scanning fluorimetry experiments.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102688(2023).</li>
<li>Gao, K., Oerlemans, R., Groves, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+and+applications+of+differential+scanning+fluorimetry+in+early-stage+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Theory and applications of differential scanning fluorimetry in early-stage drug discovery.</a> Biophys Rev. 12 (1), 85-104 (2020).</li>
<li>Hawe, A., Sutter, M., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+fluorescent+dyes+as+tools+for+protein+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Extrinsic fluorescent dyes as tools for protein characterization.</a> Pharm Res. 25 (7), 1487-1499 (2008).</li>
<li>Lucet, I. S., Murphy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ligand+binding+to+pseudokinases+using+a+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of ligand binding to pseudokinases using a thermal shift assay.</a> Methods Mol Biol. 1636, 91-104 (2017).</li>
<li>Murphy, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+methodology+to+subclassify+pseudokinases+based+on+their+nucleotide-binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A robust methodology to subclassify pseudokinases based on their nucleotide-binding properties.</a> Biochem J. 457 (2), 323-334 (2014).</li>
<li>Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+denaturation+assays+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Thermal denaturation assays in chemical biology.</a> Assay Drug Dev Technol. 10 (2), 128-136 (2012).</li>
<li>Lo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorescence-based+thermal+shift+assays+for+hit+identification+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery.</a> Anal Biochem. 332 (1), 153-159 (2004).</li>
<li>Bai, N., Roder, H., Dickson, A., Karanicolas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+analysis+of+thermofluor+data+can+readily+provide+quantitative+binding+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Isothermal analysis of thermofluor data can readily provide quantitative binding affinities.</a> Sci Rep. 9 (1), 2650(2019).</li>
<li>Vivoli, M., Novak, H. R., Littlechild, J. A., Harmer, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-ligand+interactions+using+differential+scanning+fluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry.</a> J Vis Exp. (91), e51809(2014).</li>
<li>Vedadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+methods+to+identify+ligands+that+promote+protein+stability%2C+protein+crystallization%2C+and+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (43), 15835-15840 (2006).</li>
<li>Taujale, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informatic+challenges+and+advances+in+illuminating+the+druggable+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Informatic challenges and advances in illuminating the druggable proteome.</a> Drug Discov Today. 29 (3), 103894(2024).</li>
<li>Bailey, F. P., Byrne, D. P., Mcskimming, D., Kannan, N., Eyers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+for+broke%3A+Targeting+the+human+cancer+pseudokinome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Going for broke: Targeting the human cancer pseudokinome.</a> Biochem J. 465 (2), 195-211 (2015).</li>
<li>Kung, J. E., Jura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+pharmacological+targeting+of+pseudokinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Prospects for pharmacological targeting of pseudokinases.</a> Nat Rev Drug Discov. 18 (7), 501-526 (2019).</li>
<li>Dudkiewicz, M., Szczepinska, T., Grynberg, M., Pawlowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+protein+kinase-like+domain+in+a+selenoprotein%2C+widespread+in+the+tree+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel protein kinase-like domain in a selenoprotein, widespread in the tree of life.</a> PLoS One. 7 (2), e32138(2012).</li>
<li>Han, S. J., Lee, B. C., Yim, S. H., Gladyshev, V. N., Lee, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mammalian+selenoprotein+o%3A+A+redox-active+mitochondrial+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of mammalian selenoprotein o: A redox-active mitochondrial protein.</a> PLoS One. 9 (4), e95518(2014).</li>
<li>Sreelatha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+ampylation+by+an+evolutionarily+conserved+pseudokinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein ampylation by an evolutionarily conserved pseudokinase.</a> Cell. 175 (3), 809-821 (2018).</li>
<li>Frese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alarmone+diadenosine+tetraphosphate+as+a+cosubstrate+for+protein+ampylation%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The alarmone diadenosine tetraphosphate as a cosubstrate for protein ampylation.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 62 (8), e202213279(2023).</li>
<li>Mostert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronucleotide+probes+reveal+a+diverging+specificity+for+ampylation+vs+umpylation+of+human+and+bacterial+nucleotide+transferases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Pronucleotide probes reveal a diverging specificity for ampylation vs umpylation of human and bacterial nucleotide transferases.</a> Biochemistry. 63 (5), 651-659 (2024).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ydiu+domain+modulates+bacterial+stress+signaling+through+Mn2%2B-dependent+umpylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The ydiu domain modulates bacterial stress signaling through Mn2+-dependent umpylation.</a> Cell Rep. 32 (12), 108161(2020).</li>
<li>Mukherjee, M., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+selenoprotein+o+substrates+using+a+biotinylated+atp+analog%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Identification of selenoprotein o substrates using a biotinylated atp analog.</a> Methods Enzymol. 662, 275-296 (2022).</li>
<li>Kroeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edta+aggregates+induce+sypro+orange-based+fluorescence+in+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Edta aggregates induce sypro orange-based fluorescence in thermal shift assay.</a> PLoS One. 12 (5), e0177024(2017).</li>
<li>Kotov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+interrogation+of+protein+thermal+unfolding+data+with+moltenprot%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">In-depth interrogation of protein thermal unfolding data with moltenprot.</a> Protein Sci. 30 (1), 201-217 (2021).</li>
<li>Wu, T., Gale-Day, Z. J., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dsfworld%3A+A+flexible+and+precise+tool+to+analyze+differential+scanning+fluorimetry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Dsfworld: A flexible and precise tool to analyze differential scanning fluorimetry data.</a> Protein Sci. 33 (6), e5022(2024).</li>
<li>Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protein+buffer+cocktails+using+thermofluor%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Optimization of protein buffer cocktails using thermofluor.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 69, Pt 2 209-214 (2013).</li>
<li>Ribeiro, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+pseudoenzyme+classification%2C+evolution%2C+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in pseudoenzyme classification, evolution, and signaling.</a> Sci Signal. 12 (594), eaat9797 (2019).</li>
<li>Goldberg, T., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functions+of+pseudoenzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Emerging functions of pseudoenzymes.</a> Biochem J. 480 (10), 715-728 (2023).</li>
<li>Pon, A., Osinski, A., Sreelatha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+pseudokinases%3A+A+look+at+the+untapped+enzymatic+potential+of+pseudokinases%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Redefining pseudokinases: A look at the untapped enzymatic potential of pseudokinases.</a> IUBMB Life. 75 (4), 370-376 (2023).</li>
<li>Murphy, J. M., Mace, P. D., Eyers, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+and+let+die%3A+Insights+into+pseudoenzyme+mechanisms+from+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Live and let die: Insights into pseudoenzyme mechanisms from structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 47, 95-104 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato sódico sal disódica hidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383-10G</td><td>se utiliza para obtener resultados representativos, pero no es necesario para realizar TSA</td></tr><tr><td>Avanti J-15R con conjunto de portador de microplacas</td><td>Beckman Coulter</td><td>C19416</td><td></td></tr><tr><td>CFX Opus 384 Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Bio-Rad</td><td>12011452</td><td></td></tr><tr><td>Hard-Shell 384-Well PCR Plateas, pared delgada, con faldón, transparente/blanco</td><td>Cloruro de magnesio Bio-Rad</td><td>HSP3805</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>utilizado para resultados representativos, pero no requerido para realizar TSA</td></tr><tr><td>Cloruro de manganeso (II) tetrahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3634-500G</td><td>utilizado para resultados representativos pero no requerido para realizar TSA</td></tr><tr><td>Microseal 'B' Placa de sellado PCR Película, adhesivo, óptico</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Tinción de gel de proteína de naranja</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5692-500UL</td><td></td></tr><tr><td>Uridina 5&prime;-trifosfato sal trisódica hidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U6625-100MG</td><td>utilizado para resultados representativos pero no requerido para realizar TSA</td></tr></tbody></table>

utilización del ensayo de desplazamiento térmico para sondear la unión del sustrato a la selenoproteína o

Utilizing Thermal Shift Assay to Probe Substrate Binding to Selenoprotein O

El SelO eucariota consta de una secuencia de diana mitocondrial N-terminal, un dominio similar a la quinasa y una selenocisteína altamente conservada en el extremo C de la proteína23. Esta enzima residente en las mitocondrias codifica un dominio pseudoquinasa que se conserva de las bacterias a los seres humanos23. El análisis estructural del homólogo SelO de Pseudomonas syringae reveló alteraciones de aminoácidos en el sitio activo que facilitan la unión de ATP en orientación invertida en comparación con las quinasas canónicas25. En consecuencia, SelO cataliza la ampilación, en lugar de la fosforilación, de múltiples proteínas involucradas en la señalización antioxidante para proteger a las células del daño oxidativo y la muerte celular25. Además de la AMPilación, se ha demostrado que algunas AMPilasas procariotas y eucariotas catalizan la UMPilación27,28.
Utilizamos E. coli SelO recombinante purificada en TSA para examinar la unión de los nucleótidos de ATP y UTP a SelO en presencia de cationes divalentes. Al igual que las quinasas canónicas, SelO alberga el motivo DFG en el que el aspartato se une al ion metálico para coordinar el nucleótido en el sitio activo. En primer lugar, optimizamos la concentración de proteína y colorante para mediciones de fluorescencia robustas en TSA, determinando que 5 μM a 10 μM de E. coli SelO era óptimo con 5x SYPRO Orange (Figura 2). Además, demostramos que la no proteína, así como los controles sin colorante, tenían una señal de fluorescencia baja que no respondía al aumento de temperatura. Detectamos aumentos de aproximadamente +4 °C y +12 °C en la estabilidad térmica de E. coli SelO en presencia de ATP-Mg2+ y ATP-Mn2+, respectivamente (Figura 3). Sin embargo, no observamos un cambio en la estabilidad térmica tras la incubación con UTP, lo que indica que E. coli SelO puede no exhibir una unión detectable a UTP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig01.jpg"> Figura 1: Configuración del termociclador. Un ejemplo del programa de termociclador utilizado para aumentar la temperatura de la muestra en +0,5 °C/min mientras se mide la fluorescencia SYPRO Orange utilizando el canal FRET. La recomendación también incluye una incubación a temperatura ambiente al inicio y al final del protocolo. Abreviatura: FRET = Transferencia de energía de resonancia de Förster. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig02.jpg"> Figura 2: Optimización de las concentraciones de proteínas y colorantes. (A) Resultados representativos de la optimización de la concentración de colorante SYPRO Orange utilizando 5 μM de Escherichia coli SelO. (B) Resultados representativos de la optimización de la concentración de E. coli SelO utilizando 5x el colorante SYPRO Orange. La curva de desnaturalización térmica representa las unidades de fluorescencia relativas (eje y) con respecto a la temperatura (eje x). Los resultados representan la media ± SD de los pozos triplicados (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67139/67139fig03.jpg"> Figura 3: Curvas de desnaturalización térmica y análisis de Δ Tm de SelO en presencia de nucleótidos y cationes divalentes. (A) Datos brutos de las curvas de desnaturalización térmica de las muestras (5 μM de Escherichia coli SelO en presencia de 200 μM de ATP o UTP y 2 mM de cationes divalentes, 5x SYPRO Orange) exportados de la máquina RT-PCR y trazados. SelO ATP-Mg representa muestras con SelO, ATP y MgCl2, SelO ATP-Mn representa muestras con SelO, ATP y MnCl2, SelO UTP-Mg representa muestras con SelO, UTP y MgCl2, SelO UTP-Mn representa muestras con SelO, UTP y MnCl2. Tenga en cuenta que los controles sin colorante y sin proteínas exhiben una fluorescencia baja. Los resultados representan la media ± SD de los pozos triplicados (n = 3). (B) Curvas de desnaturalización térmica trazadas a la intensidad más alta y que se ajustan a la ecuación sigmoidal de Boltzmann. Aunque la desnaturalización térmica de SelO no se vio afectada por UTP, observamos un marcado cambio en la desnaturalización térmica en presencia de ATP (curvas moradas). Los resultados representan la media ± SD de los pozos triplicados (n = 3). (C) Histograma que representa los valores de Tm derivados del ajuste sigmoidal de Boltzmann de los datos representados en la Figura 3B. Los resultados representan la media ± SD de los pozos triplicados (n = 3). SelO 39,2 °C ± 0,085, SelO ATP-Mg 43,3 °C ± 0,133, SelO ATP-Mn 50,9 °C ± 0,085, SelO UTP-Mg 39,1 °C ± 0,056, SelO UTP-Mn 39,9 °C ± 0,087. (D) Histograma que representa el cambio en la temperatura de fusión ΔTm (Tm aditivo- Tm tampón). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla suplementaria S1: Ejemplo de datos para TSA de SelO en presencia de metales y nucleótidos. Hoja de cálculo de datos brutos exportados desde la máquina RT-PCR y datos procesados para eliminar valores después de la intensidad máxima de RFU como se describe en los pasos del protocolo 5.1 y 5.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67139/67139_Suppl%20TableS1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Utilización del ensayo de desplazamiento térmico para sondear la unión del sustrato a la selenoproteína O

Defining the biological importance of proteins with unknown functions poses a significant obstacle in understanding cellular processes. Although ...

utilizing-thermal-shift-assay-to-probe-substrate-binding-to

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

La fluorimetría diferencial de barrido es un método ampliamente utilizado para el cribado de bibliotecas de moléculas pequeñas en busca de interacciones con proteínas. Aquí, presentamos un método sencillo para ampliar estos análisis para proporcionar una estimación de la constante de disociación entre una molécula pequeña y su proteína asociada.

Determinación de las interacciones proteína-ligando Uso diferencial de barrido Fluorimetría

Este manuscrito describe cómo la pantalla para termoestabilizante mutaciones, purificar el transportador de serotonina humano, generar anticuerpos de alta afinidad, y cristalizar el complejo transportador de serotonina-anticuerpo unido a la antidepresivo fármaco S citalopram. Este protocolo puede ser adaptado para el estudio de otros transportadores desafiantes de membrana, receptores y canales.

Termoestabilización, Expresión, purificación y cristalización del transportador de serotonina humano enlazado a<em&gt; S</em&gt; citalopram

Se describe aquí un protocolo optimizado de ensayos fluorescentes cambio de movilidad electroforética (FEMSA) utilizando purificados Sox-2 proteínas, junto con sondas fluorescentes infrarrojos marcado tinte de ADN como un estudio de caso para hacer frente a una importante cuestión biológica.

Un protocolo optimizado para el ensayo de cambio de movilidad electroforética utilizando oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo

Los ensayos de competición de péptidos se usan ampliamente en una variedad de experimentos moleculares e inmunológicos. Este documento describe un método detallado para un ensayo de quinasa que compite con oligopéptido in vitro y los procedimientos de validación asociados, que pueden ser útiles para encontrar sitios de fosforilación específicos.

Ensayo de Competencia Oligopeptídica para la Determinación del Sitio de Fosforilación

Se presenta un protocolo optimizado para realizar una amplia caracterización bioquímica y estructural de una proteína de unión a sustrato de carbohidratos de Streptococcus pneumoniae .

Caracterización bioquímica y estructural de la SP0092 de proteína de unión a sustrato de transporte de hidratos de carbono

Aquí se presentan protocolos para ensayos bioquímicos in vitro utilizando etiquetas de biotina que pueden ser ampliamente aplicables para el estudio de interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos.

Ensayos bioquímicos in Vitro utilizando etiquetas de biotina para estudiar las interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos

La capacidad de evaluar la participación objetivo de los inhibidores candidatos en las células intactas es crucial para el descubrimiento de fármacos. Este protocolo describe un ensayo de cambio térmico celular de formato de 384 pozos que detecta de forma fiable el compromiso de destino celular de inhibidores dirigidos a SHP2 de tipo salvaje o sus variantes oncogénicas.

Evaluación del compromiso de objetivos celulares por inhibidores de la fosfatasa SHP2 (PTPN11)

Este protocolo presenta una técnica para sondear las interacciones proteína-proteína utilizando perlas de donantes ligadas al glutatión con co-chaperonas con motivos TPR fusionadas con GST y perlas aceptoras junto con un péptido derivado de Hsp90. Hemos utilizado esta técnica para detectar moléculas pequeñas para interrumpir las interacciones Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificado inhibidores potentes y selectivos de la interacción Hsp90-FKBP51.

Estudios de interacciones chaperona-cochaperona utilizando un ensayo homogéneo basado en cuentas

El experimento utilizado aquí muestra un método de acoplamiento molecular combinado con un ensayo de desplazamiento térmico celular para predecir y validar la interacción entre moléculas pequeñas y proteínas objetivo.

Predicción y validación de dianas proteicas de compuestos de moléculas pequeñas

Aquí, se presenta un protocolo para analizar las enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos, utilizando ejemplos de enzimas ligasa, nucleasa y polimerasa. El ensayo utiliza oligonucleótidos marcados con fluorescencia y sin marcar que pueden combinarse para formar dúplex que imitan el ARN y/o los daños en el ADN o los intermediarios de la vía, lo que permite la caracterización del comportamiento de las enzimas.

Uso de oligonucleótidos sintéticos modificados para analizar enzimas metabolizadoras de ácidos nucleicos

Aquí, presentamos un protocolo para el uso de sustratos de levadura mostrados en la superficie para ensayos de modificación enzimática. La plataforma se demostró utilizando el análisis de la actividad de desfosforilación de la tirosina fosfatasa SHP-2 frente a uno de sus sustratos como ensayo representativo de modificación enzimática.

Modificación enzimática y evaluación por citometría de flujo de proteínas mostradas en la superficie de la levadura

Aprende a utilizar el ensayo de desplazamiento térmico para analizar la unión de nucleótidos y metales a la selenoproteína O. Esta técnica fluorescente de alto rendimiento permite estudiar interacciones proteicas y determinar condiciones estabilizantes para cristalografía.

Utilización del ensayo de desplazamiento térmico para sondear la unión del sustrato a la selenoproteína O

Explorar más videos