Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans

La producción de embriones viables es un proceso complejo. Nuestro objetivo general es definir las señales celulares que coordinan la transición de un ovocito a un embrión. El reportero CaFE es una nueva herramienta desarrollada para visualizar las señales de calcio que se producen tras la fertilización y durante la embriogénesis temprana.

Utilizando el reportero CaFE, hemos descubierto una onda de calcio retardada en ovocitos que ovulan prematuramente. También hemos descubierto la presencia de transitorios de calcio unicelulares durante la embriogénesis temprana. Ambos hallazgos ilustran la utilidad de un indicador de calcio codificado genéticamente durante el desarrollo temprano.

Las técnicas anteriores para visualizar los ovocitos de calcio se basaban en la inyección de tinte en la gónada. Esta técnica es laboriosa y requiere un equipo especializado de microinyección. El indicador CaFE permite una fácil visualización de la onda de calcio en ovocitos y embriones con equipos ampliamente disponibles.

El CaFE Reporter facilita la investigación sobre el momento y la regulación de la señalización del calcio en ovocitos y embriones. Este reportero se puede combinar fácilmente con mutantes, marcadores y reducciones de ARNi existentes para descubrir el comportamiento del calcio en relación con otros eventos emblemáticos durante la embriogénesis temprana, como la maduración mótica. Para comenzar, sostenga el mango de gusano y afloje el collar plateado hacia su cabeza para que las cuatro secciones se separen.

Coloca un alambre de platino de 1,5 pulgadas en el centro de las cuatro secciones. Sostenga el cable en el centro mientras aprieta el collar para unir las cuatro secciones. Con un par de alicates de punta plana, dé forma con cuidado al alambre y sujete repetidamente el extremo del alambre para crear un pie de aproximadamente dos a tres milímetros.

Usa este pie para recoger los gusanos. Prepare una solución de agarosa al 3% en agua y caliéntela en un microondas hasta que la agarosa se disuelva por completo. Coloque un portaobjetos de microscopio en blanco entre otros dos portaobjetos de microscopio que tengan una sola capa de cinta de laboratorio a lo largo del eje largo.

Con una pipeta de un mililitro, deje caer la solución calentada de agarosa al 3% en el centro del portaobjetos en blanco. Coloque rápidamente un nuevo portaobjetos de microscopio sobre la gota de agarosa, perpendicular al portaobjetos en blanco, con la gota descansando sobre los portaobjetos adyacentes con cinta adhesiva, luego separe suavemente los portaobjetos, manteniendo la almohadilla intacta. Con una pipeta de 20 microlitros, agregue una pequeña gota de levamisol de un milimolar en tampón M9 al centro de la almohadilla de agarosa para paralizar los gusanos.

Recoge al menos cinco lombrices sincronizadas y toca suavemente la gota de levamisol con el pie del mango del súmbano. Cubra con cuidado la almohadilla de agarosa con un cubreobjetos. Verifique la ubicación de los gusanos, ya que el cubreobjetos puede causar la dispersión de los gusanos.

Etiquete el portaobjetos del microscopio con los detalles apropiados, como el nombre de la cepa de gusano. Localice los gusanos usando un objetivo de baja potencia en el microscopio usando iluminación de campo claro. Utilice un mínimo de un objetivo de aire de 20x o un objetivo de inmersión de 40x para visualizar claramente la onda de calcio en los ovocitos.

Para una visualización óptima de los reporteros fluorescentes, ajuste la ganancia o el tiempo de exposición para los canales GFP y RFP. Examine cada ovocito menos uno en los brazos de las gónadas del gusano para determinar si un evento de fertilización es inminente. Después de la ruptura de la envoltura nuclear, el citoesqueleto del ovocito menos uno más proximal se reorganizará, adoptará una apariencia redondeada y se separará del ovocito menos dos.

Cuando la ovulación ocurra de manera inminente, comience a grabar el video en un entorno de campo amplio de inmediato. El ovocito proximal se denota por el menos uno directamente antes de la espermateca, donde se almacenan los espermatozoides. El embrión más reciente se encuentra más cerca de la espermateca, pero dentro del útero.

La onda de calcio mostró un patrón bifásico, comenzando con un estallido rápido seguido de una onda de fluorescencia que se movía desde el punto de entrada hacia el polo opuesto. Se observó una señal de calcio inmediatamente después de la entrada en la espermateca en el ovocito delantero menos uno, pero no en el ovocito inferior menos dos. Los embriones dentro y fuera del útero mostraron una señal de fluorescencia en una sola célula durante la embriogénesis.