Name: Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: Aprende a visualizar transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans utilizando el reportero CaFE. Este método permite estudiar la señalización celular en embriogénesis con equipamiento estándar.

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<meta charset="utf8"></head><body>Seguimiento del calcio en las primeras fases de desarrollo de C. elegans

<ol><li>Stein, P., Savy, V., Williams, A. M., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulators+of+calcium+signalling+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulators of calcium signalling at fertilization.</a> Open Biol. 10 (7), 200118(2020).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-07-4</td><td>2 kg; El polvo se disuelve más fácilmente que las escamas</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>MidSci</td><td>BE-A125</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Lámpara de alcohol</td><td>Fisher Scientific</td><td>S13475</td><td>Uso con etanol al 95%</td></tr><tr><td>Cloruro de amonio (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1500030</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td>5 g</td></tr><tr><td>AMSCO Serie 400 Esterilizador de vapor</td><td>pequeño Steris Cuidado de la salud</td><td>N/A</td> Bacto-peptona <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Bacto-triptona</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11470.18</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Dragonfly 200 disco giratorio confocal</td><td>Oxford Instruments Andor</td><td>N/A</td><td>Utilizado con el microscopio Leica</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Cytogenics Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-035-900</td><td>144 portaobjetos por paquete</td></tr><tr><td>Alicates de punta plana, mandíbula lisa</td><td>Home Depot</td><td>305530604</td><td>Asegúrese de que los alicates sean de mandíbula lisa</td></tr><tr><td>Isopropil &beta;- d-1-tiogalactopiranósido&nbsp;( IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td>10 g; sin dioxano</td></tr><tr><td>Cinta de laboratorio</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-10R</td> La <td>cinta de 0,5 pulgadas se utiliza para encintar portaobjetos de microscopio</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC187870100</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio (MgSO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541016</td><td>paquete de 1 oz</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ti2 escaneo láser confocal</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Confocal</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de platino</td><td>TriTech</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific AA1159436</td><td></td><td>500 g</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico heptahidratado (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S471-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Petri estéril plato (35 mm x 10 mm)</td><td>CellTreat</td><td>229638</td><td>960 placas de Petri por caja</td></tr><tr><td>Placa de Petri estéril (60 mm x 15 mm)</td><td>CellTreat</td><td>229665</td><td>500 placas de Petri por caja</td></tr><tr><td>Cepa EAG16 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG16</td><td>Creado por Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Cepa EAG25 spn-4p::jGCaMP7s:: pie-1u; ujIs113 II.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG25</td><td>Creado por Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Strain EAG28 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u; unc-119(ed3) III; ltIs44 V.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG28</td><td>Creado por Kim Guisbert</td></tr><tr><td>Lab Strain JIM113 ujIs113 II [pie-1p::mCherry::H2B::p ie-1 3'UTR + nhr-2p:: his-24::mCherry::let-858 3'UTR + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>JIM113</td><td>Creado por E. Preston - Murray Lab</td></tr><tr><td>Strain OD70 unc-119(ed3) III; ltIs44 V [pie-1p::mCherry::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OD70</td><td>Creado por Audhya/Oegema - Greenstein Lab</td></tr><tr><td>Tritech Worm Pick Handle TriTech</td><td></td><td>TWPH1</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49160</td><td>500 g</td></tr></tbody></table>

visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en c. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Utilizando los protocolos descritos en este manuscrito, se observaron los patrones dinámicos de señalización de calcio en la fertilización y la embriogénesis en C. elegans.
En la Figura 2 se muestra una secuencia típica de fertilización en lombrices que contienen el reportero CaFE. Para facilitar el análisis, se utilizó la cepa EAG28 que combina el reportero CaFE con un transgén13 en el dominio de homología de pleckstrina (PH-mCherry). El marcador PH-mCherry se localiza en la membrana plasmática y permite una visualización más fácil de los límites celulares, particularmente en el brazo de la gónada. La cepa EAG28 se creó cruzando la cepa EAG16 que contiene el reportero CaFE con la cepa reportera OD70 PH-mCherry13. En C. elegans, la ovulación y la fertilización ocurren al mismo tiempo. El tiempo 0 de la fecundación se considera el primer fotograma en el que se detecta una señal de fluorescencia en el ovocito ovulante (Figura 2). Se produce un estallido brillante de fluorescencia en el sitio de fusión de espermatozoides tan pronto como el borde delantero del ovocito ingresa a la espermateca, el órgano de almacenamiento de espermatozoides7. La señal aparece antes de que se complete la ovulación. La onda de calcio es bifásica, con un rápido estallido inicial seguido de una onda de fluorescencia desde el punto de entrada hacia el polo opuesto. Todo el ovocito se vuelve fluorescente en &lt;30 s.
Tenga en cuenta que el reportero de CaFE está en una sola copia y, por lo tanto, la señal no es tan brillante como la de otros transgenes. No se recomienda el lapso de tiempo de pila Z durante la ovulación a menos que haya un confocal de disco giratorio disponible y optimizado. Las imágenes de la pila Z se pueden obtener antes o después de una película para capturar los cambios en 3D en la morfología de las gónadas. Aunque las imágenes aquí se tomaron con un microscopio confocal, los transitorios también se han observado utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio, que es más común y asequible que la confocal. Usando un confocal de escaneo láser, la velocidad de fotogramas es de aproximadamente 1 fps. Usando un disco giratorio confocal, la velocidad de fotogramas es de 10 fps o más rápida. La señal de fondo del reportero de CaFE es suficiente para iluminar los ovocitos en maduración en el brazo de la gónada. Tras la fecundación, se suele observar un aumento de 1,5-2 veces en la intensidad de la señal GFP.
Existen varios métodos alternativos para la cuantificación. Por ejemplo, el software de análisis de imágenes Imaris, creado por Oxford Instruments (la misma empresa matriz que el microscopio confocal de disco giratorio Andor Dragonfly), tiene la capacidad de cuantificar la señal en cada fotograma solo del ovocito en tránsito en lugar de un ROI mayor. Sin embargo, el software de Imaris no es gratuito. Además, Takayama, Fujita y Onami han descrito con excelente detalle una estrategia detallada de análisis de imágenes para medir las ondas de calcio en el ovocito y utiliza ImageJ, que está disponible gratuitamente14. Alternativamente, los quimógrafos para ilustrar la onda de señal fluorescente a través de un solo ovocito requieren una manipulación de imagen más extensa que la descrita aquí, pero se describen en Takayama y Onami3.
Una ventaja distintiva de C. elegans es su capacidad para eliminar la expresión de casi cualquier gen alimentando a los gusanos con bacterias que expresan dsRNA para desencadenar el ARNiendógeno 15,16. Para una expresión óptima de dsRNA, tanto las placas de ARNi como el cultivo de ARNi saturado contienen IPTG. El dsRNA se produce expresando el gen de interés con promotores flanqueantes. Aquí, hemos utilizado la biblioteca de Ahringer, que se dirige a la mayor parte del genoma del gusano mediante el uso de 16.256 cepas bacterianas17. Alternativamente, el laboratorio Vidal creó un ORFeome de ~ 11,000 clones de ARNi utilizando el sistema Gateway y está disponible para su compra a través de Horizon Discovery18.
Para demostrar la utilidad del indicador CaFE en combinación con el ARNi, examinamos la ovulación prematura. Una deleción parcial en ipp-5 induce un evento de doble ovulación en el que tanto el ovocito -1 como el ovocito -2 entran en la espermateca durante la misma ovulación19. IPP-5 es una fosfatasa que actúa sobre IP3 y disminuye eficazmente los niveles del segundo mensajero IP3. Descubrimos que la eliminación de ARNi de ipp-5 provoca un fenotipo de doble ovulación similar al mutante.
El análisis del reportero de CaFE durante la doble ovulación inducida por la eliminación del ARNi de ipp-5 reveló aspectos novedosos del OET. En primer lugar, se observó una señal de calcio inmediatamente después de la entrada en la espermateca en el ovocito -1 principal, pero no en el ovocito -2 posterior (Figura 3). Aunque se ovulan 2 ovocitos, el ovocito -1 sigue siendo el único ovocito que muestra signos de maduración adecuada, en particular, la ruptura de la envoltura nuclear (NEBD). Estos datos sugieren que, aunque el ovocito -2 esté en presencia de espermatozoides, no es competente para ser fecundado ya que aún no ha madurado adecuadamente. En segundo lugar, el ovocito -2 exhibe una onda de calcio retardada, generalmente cuando el ovocito sale de la espermateca hacia el útero. Aunque la maduración del ovocito es normalmente un requisito previo para la ovulación, estos datos sugieren que la maduración del ovocito y la competencia para la fertilización aún pueden ocurrir después de la ovulación. La visualización de la onda de calcio retardada durante el derribo de ipp-5 destaca las ventajas del reportero CaFE para interrogar la competencia y el tiempo de fertilización.
Además, hemos descubierto que el reportero de CaFE es detectable en los huevos puestos y revela transitorios de calcio unicelulares durante la embriogénesis temprana en C. elegans. Embriones de adultos sincronizados día 1 EAG28 (CaFE; PH-mCherry) se fotografiaron utilizando los protocolos de las secciones 1-5 con el disco giratorio Andor Dragonfly confocal utilizando la cámara Zyla (Figura 4). Los transitorios de calcio se limitan a células individuales y tardan menos tiempo que la onda de calcio de fertilización en completarse (~ 9 s, n = 11). Sin embargo, la onda de calcio durante la embriogénesis no parece ser bifásica. No se observaron transitorios de calcio antes de la etapa de 8 células. Cabe destacar que el calcio no se localiza en el surco de escote en C. elegans, como se observa en muchos otros organismos, incluidos los humanos y Xenopus 20,21,22. Los transitorios de calcio unicelulares se observaron mucho después de la gastrulación (~200 min después de la fertilización) y en los huevos puestos. Un solo embrión muestra múltiples transitorios de calcio a lo largo del tiempo, pero en diferentes células y, por lo general, una célula a la vez. Tenga en cuenta que la exposición continua a la estimulación láser dañará los embriones. Se recomienda una potencia de LED/láser más baja o una exposición discontinua. Sin embargo, dado que las ondas de calcio son relativamente cortas a ~ 9 s, no recomendamos más de 2 s entre eventos de estimulación LED / láser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig01.jpg"> 
Figura 1: Brazo de la gónada de C. elegans . Imagen de un brazo gonadal de la cepa de gusano EAG25, que muestra el GFP reportero de CaFE (verde) y el marcador de histona 2B-mCherry (rojo), que resalta los núcleos de la línea germinal. El ovocito proximal se denota por el -1 justo antes de la espermateca, donde se almacenan los espermatozoides (flecha). El embrión situado más cerca de la espermateca, pero dentro del útero, es el embrión más reciente. La imagen fue tomada utilizando el confocal de escaneo láser Nikon ECLIPSE Ti2. Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig02.jpg"> 
Figura 2: Visualización de la onda de calcio durante la fecundación. Imágenes de series temporales de fluorescencia que reflejan el calcio intracelular durante la fertilización en la cepa de gusano EAG28. La cepa EAG28 contiene tanto el reportero CaFE (verde) como un dominio de homología pleckstrina-fusión mCherry (amarillo), que resalta las membranas plasmáticas. El tiempo 0 indica el primer fotograma que muestra un claro aumento de la señal fluorescente en el ovocito. El tiempo 24,4 s refleja el primer fotograma que muestra la fluorescencia del ovocito completo. Las imágenes de series de tiempo se tomaron utilizando el disco giratorio Andor Dragonfly confocal con una cámara Zyla. Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig03.jpg"> 
Figura 3: Ondas de calcio durante un evento de doble ovulación inducido por ipp-5 RNAi. Imágenes time-lapse de ondas secuenciales de calcio del ovocito -1 y del ovocito -2 en una cepa EAG16 (CaFE en verde GFP) expuestas al ARNi ipp-5 . El marco -40.0 s incluye etiquetas para el ovocito -1 (-1), el ovocito -2 (-2), la espermateca (*) y el embrión +1 (+1). El tiempo 0 s muestra el aumento inicial de la fluorescencia de la onda de calcio del ovocito -1. El tiempo 4,5 s muestra la onda de calcio extendiéndose hacia el polo opuesto en el ovocito -1. El tiempo 70,5 s muestra fluorescencia de célula completa en el ovocito -1 acompañado por el ovocito -2 en la señal GFP basal; Ambos ovocitos se encuentran en la espermateca. El ovocito -1 fecundado y el ovocito -2 no fecundado entran en el útero a los 158,3 s. A los 219,3 s, el ovocito -2 muestra una onda de calcio fluorescente tardía. Las imágenes fueron tomadas usando el disco giratorio Andor Dragonfly confocal con una cámara Zyla. Barra de escala = 30 μM <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig04.jpg"> 
Figura 4: Transitorios de calcio unicelular en embriogénesis temprana. (A) Los embriones en el útero y (B) ex útero (huevo puesto) mostraron una señal fluorescente en una sola célula durante la embriogénesis. Las imágenes fueron tomadas usando el disco giratorio Andor Dragonfly confocal con una cámara Zyla. Barra de escala = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este artículo se describe una técnica para la visualización de los primeros eventos de la embriogénesis en el...

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Este video presenta los conceptos detrás de las imágenes de calcio e incluye un protocolo de ejemplo para la obtención de imágenes de lapso de tiempo de gusanos contenidos en pocillos de agarosa moldeados.

Imágenes de calcio: un método para visualizar la actividad neuronal en C. elegans vivos

Este video muestra una técnica para obtener imágenes de calcio en neuronas individuales de Caenorhabditis elegans utilizando proteínas reporteras fluorescentes codificadas genéticamente. Describe los pasos involucrados en la obtención de imágenes del movimiento de los gusanos y la medición de las proporciones de fluorescencia reportera de las neuronas para correlacionar los niveles de calcio intracelular con la actividad neuronal y los cambios de comportamiento durante la puesta de huevos.

Imágenes de calcio en neuronas individuales que regulan el comportamiento de puesta de huevos en Caenorhabditis elegans

Source: Bancroft, E. A., et al. Cuantificación Espontánea Ca2+ Flujos y sus efectos posteriores en las neuronas primarias del mesencéfalo de ratón. J. Vis. Exp. (2020) &lt;p style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'&gt;Este video demuestra la visualización en tiempo real de la afluencia de calcio en las neuronas ventrales del mesencéfalo derivadas de embriones de ratón. Utilizando un vector viral para expresar un indicador de calcio, las neuronas se visualizan bajo un...

Visualización de la afluencia de calcio en las neuronas ventrales del mesencéfalo derivadas de embriones de ratón

Fuente: Doser, R., et al. Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Este video demuestra imágenes in vivo del flujo de calcio subcelular en las neuronas del cordón nervioso ventral de cepas transgénicas de Caenorhabditis elegans. Se emplean dos indicadores de calcio distintos: un indicador citoplasmático en una cepa y un indicador mitocondrial en otra. Las neuronas se observan bajo un microscopio de fluorescencia para monitorear los cambios en tiempo real...

Imágenes de la dinámica subcelular del calcio en neuronas de Caenorhabditis elegans

Con su pequeño cuerpo transparente y bien documentado neuroanatomía y una serie de técnicas genéticas susceptibles y...

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

Este protocolo describe el uso de genéticamente codificados Ca2 + periodistas a registramos cambios en la actividad neuronal en comportarse gusanos Caenorhabditis elegans .

Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

Este método proporciona una manera de acoplar optogenéticas y sensores de calcio codificados genéticamente para crear imágenes de los niveles basales de calcio citosólico y cambios en los transitorios de calcio evocados en los músculos de la pared corporal del organismo modelo C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging en C. elegans Body Wall Muscles

Los métodos actuales describen un enfoque no ratiométrico para imágenes de calcio subcompartimentales de alta resolución in vivo en Caenorhabditis elegans utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente fácilmente disponibles.

Imágenes subcelulares del manejo neuronal del calcio in vivo

En los embriones de Xenopus, las células del techo del blastocelo son pluripotentes y pueden programarse para generar varios tejidos. Aquí, describimos los protocolos para usar explantes de techo de blastocoel de anfibios como un sistema de ensayo para investigar las características clave in vivo e in vitro del desarrollo neuronal temprano.

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Aprende a visualizar transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans utilizando el reportero CaFE. Este método permite estudiar la señalización celular en embriogénesis con equipamiento estándar.

Visualización in vivo de transitorios de calcio durante la fertilización y el desarrollo temprano en C. elegans

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