Name: Desarrollo y aplicación de tirosina fosfatasas reguladas por rapamicina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprende a desarrollar un sistema regulado por rapamicina para controlar la actividad de tirosina fosfatasas en células HEK-293T. Este método permite estudiar mecanismos de señalización celular con regulación temporal específica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Regulación temporal de la actividad de la fosfatasa con el sistema regulado por rapamicina

<ol><li>Amin, A. R. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-2+tyrosine+phosphatase+inhibits+p73-dependent+apoptosis+and+expression+of+a+subset+of+p53+target+genes+induced+by+EGCG%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).</li>
<li>Niogret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp-2+is+critical+for+ERK+and+metabolic+engagement+downstream+of+IL-15+receptor+in+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells.</a> Nat Commun. 10, 1-14 (2019).</li>
<li>Wang, Y. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+infection+activates+Src+homology-2+domain-containing+phosphatase+2+to+suppress+IFN-%CE%B3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling.</a> J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+promotes+proliferation+and+oxaliplatin+resistance+of+colon+cancer+cells+through+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK.</a> Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).</li>
<li>Lauriol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+SHP2+dysfunction+underlies+cardiac+hypertrophy+in+Noonan+syndrome+with+multiple+lentigines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines.</a> J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 29, 465-468 (2001).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Shp2+tyrosine+phosphatase+is+implicated+in+leukemogenesis+in+adult+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia.</a> Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).</li>
<li>Mustelin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases.</a> Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).</li>
<li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tyrosine+phosphatases%3A+time+to+end+the+stigma%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+phosphatases%3A+From+molecule+design+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials.</a> Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).</li>
<li>Weiser, D. C., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+protein+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of protein phosphatase inhibitors.</a> Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).</li>
<li>Fauser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+protein+tyrosine+phosphatase+signaling+by+engineered+chemogenetic+control+of+its+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity.</a> J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+kinases%3A+design+and+application+of+RapR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).</li>
<li>Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+proteins+for+allosteric+control+by+light+or+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Engineering proteins for allosteric control by light or ligands.</a> Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+SHP2+phosphatase+promotes+vascular+damage+and+inhibition+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth.</a> EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP2+regulates+the+development+of+intestinal+epithelium+by+modifying+OSTERIX%2B+crypt+stem+cell+self-renewal+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation.</a> FASEB J. 35, e21106(2021).</li>
<li>Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Shp2+tyrosine+phosphatase+controls+energy+balance+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).</li>
<li>Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-edged+roles+of+protein+tyrosine+phosphatase+SHP2+in+cancer+and+its+inhibitors+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials.</a> Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).</li>
<li>Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+regulates+focal+adhesion+kinase+to+promote+EGF-induced+lamellipodia+persistence+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration.</a> Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).</li>
<li>Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-tyrosine+phosphatase+Shp-2+regulates+cell+spreading%2C+migration%2C+and+focal+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion.</a> J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).</li>
<li>Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+characterization+of+recombinant+vectors+by+direct+analysis+of+transformed+Escherichia+coli+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies.</a> Biotechniques. 7, 689-690 (1989).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRay%2C+A-M+%22Kinase+Signaling+Networks%22">Kinase Signaling Networks</a>. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).</li>
<li>Mercan, F., Bennett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+tyrosine+phosphatases+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).</li>
<li>Karginov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+protein+dimerization+and+kinase+activity+in+living+cells+using+photocaged+rapamycin+and+engineered+FKBP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP.</a> J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optochemical+activation+of+kinase+function+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optochemical activation of kinase function in live cells.</a> Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).</li>
</ol>

Las proteínas tirosina fosfatasas son una familia crítica de proteínas involucradas en una gran cantidad de eventos de señalización celular. Se ha demostrado que desempeñan un papel clave en la regulación de la proliferación, migración y apoptosis celular 1,2,3. En consecuencia, la desregulación de la proteína tirosina fosfatasas conduce a una variedad de enfermedades y trastornos debilitantes 4,5,6,7. El estudio de la función fisiológica de las tirosina fosfatasas y su papel en el desarrollo de estas patologías se ha visto históricamente obstaculizado por la falta de herramientas necesarias para investigar las complejidades de la señalización de la fosfatasa8.
Tradicionalmente, las fosfatasas se estudian utilizando métodos que no tienen la especificidad deseada y/o no proporcionan un control temporal de su actividad. Estas limitaciones críticas de las herramientas disponibles dificultan la disección de las funciones específicas de las fosfatasas en las vías de señalización. La sobreexpresión de mutantes negativos constitutivamente activos y dominantes o la regulación a la baja de la expresión de la fosfatasa proporcionan especificidad, pero carecen de control temporal y, a menudo, pueden desencadenar mecanismos compensatorios que enmascararán la verdadera función de la enzima.
Los inhibidores farmacológicos permiten la regulación temporal de las fosfatasas. Sin embargo, muchos inhibidores de la fosfatasa son notoriamente inespecíficos debido a la composición bien conservada del sitio activo en las tirosina fosfatasas9. Además, debido a las limitaciones de diseño, los inhibidores dirigidos al sitio catalítico exhiben una permeabilidad deficiente de la membrana celular10. Otra limitación de los inhibidores es que solo permiten examinar los efectos de la inactivación de la fosfatasa11. Por lo tanto, existe la necesidad de herramientas que permitan la activación específica y regulable temporalmente de las fosfatasas. Estas herramientas permitirán a los investigadores identificar los efectos directos de la activación de la fosfatasa, separándolos de múltiples cascadas de señalización paralelas a menudo activadas por estímulos biológicos. Es importante destacar que el estricto control temporal de la actividad permite la identificación de eventos transitorios inducidos por una fosfatasa y separa los efectos de la actividad aguda y prolongada de la fosfatasa. La combinación de la regulación temporal con el análisis mutacional permitirá una disección detallada de las funciones específicas de los dominios individuales de la fosfatasa y la interrogación de su señalización posterior12.
Para hacer frente a la falta de capacidades deseadas en las herramientas existentes, el grupo Karginov ha desarrollado el sistema Rapamicina Regulado (RapR) 13,14,15. El sistema RapR utiliza un dominio de conmutación diseñado, iFKBP, que permite la regulación alostérica de la proteína de interés (POI). La inserción del dominio iFKBP en una posición acoplada alostéricamente al sitio catalítico del POI lo hace susceptible a la regulación por rapamicina. En ausencia de rapamicina, iFKBP interrumpe el sitio catalítico debido a la dinámica estructural intrínsecamente alta de iFKBP y, por lo tanto, inactiva el POI. La adición de rapamicina induce la interacción de iFKBP con la proteína FRB coexpresada (Figura 1). Esto provoca la estabilización del dominio del interruptor, lo que en consecuencia restaura la estructura y la función del dominio catalítico del POI. Como tal, la herramienta permite la activación específica y regulable temporalmente del POI.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig01.jpg"> Figura 1: Esquema del sistema regulado por rapamicina RapR-Shp2. RapR permite la activación alostérica de la proteína de interés con la adición de rapamicina. Esta figura fue modificada de Fauser et al.12. Abreviaturas: iFKBP = FKBP12 insertable; FRB = dominio de unión a FKBP-rapamicina; R = rapamicina; Shp2 = Proteína tirosina fosfatasa que contiene el dominio Src homología-2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La herramienta RapR se puede aplicar a diferentes familias de proteínas. Se puede utilizar para regular las proteínas quinasas, así como las fosfatasas12,14. Este protocolo se centrará en la aplicación de la herramienta RapR para el control de la fosfatasa Shp2. Shp2 es una proteína tirosina fosfatasa de expresión ubicua que está involucrada en procesos de señalización como la proliferación, migración, inmunomodulación y diferenciación 1,16,17,18. La desregulación de Shp2 se ha asociado con una serie de cánceres sólidos, leucemia mieloide y trastornos del desarrollo 5,7. Sin embargo, Shp2 ha sido víctima de las mismas deficiencias de la herramienta descritas anteriormente. Para combatir estas limitaciones, se desarrolló y caracterizó RapR-Shp2, un constructo Shp2 específica y temporalmente regulable12.
Antes del desarrollo de RapR-Shp2, se sabía que Shp2 estaba involucrado en la migración celular 19,20,21. Sin embargo, se desconocía su papel específico en la señalización involucrada en este proceso. También se desconocía en qué escala de tiempo Shp2 regula la migración de las células y qué cambios morfodinámicos específicos induce en diferentes momentos de su activación. Además, no estaba claro si la activación aguda y prolongada de Shp2 causará efectos diferentes. Usando RapR-Shp2, se encontró que la activación aguda de Shp2 induce la diseminación celular transitoria, un aumento en las protuberancias, polarización celular y migración. También se identificaron vías específicas aguas abajo de Shp2 que regulan distintos cambios morfodinámicos12. Este protocolo proporciona detalles para el diseño y la caracterización de RapR-Shp2, que se pueden utilizar para guiar el desarrollo y la aplicación de otras fosfatasas de RapR.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Cubreobjetos de vidrio 25 mm Redondos</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0715</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Tampón</td><td></td><td></td> Laemmli <td>para 500 mL: 5,18 g Tris-HCL, 131,5 mL glicerol, 52,5 mL 20% SDS, 0,5 g azul de bromofenol, pH final 6,8</td></tr><tr><td>4-20% Mini-PROTEAN TGX Gel Prefabricado</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Tampón Phusion Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>A431 Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Agarsose</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor Cell Chamber</td><td>invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>Heat Inactivated Triple 0.1 &micro; m</td></tr><tr><td>Brig 35,30 con</td> filtro estéril %<td>Acros</td><td>329581000</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420</td><td></td></tr><tr><td>CellGeo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Publicado en 10.1083/jcb.201306067</td></tr><tr><td>CellMask Rojo Intenso Colorante de membrana plasmática</td><td>invitrogen</td><td>C10046</td><td></td></tr><tr><td>Criba de colonia MasterMix</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a competente células</td><td>NEB</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-515</td><td></td></tr><tr><td>DNA Ladder</td><td>GoldBio</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>DpnI Enzima</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-Ditiothreitol, Reactivos de Cleland</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 Reactivo de transfección</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Kit de extracción en gel Thermo</td><td>Scientific</td><td>K0692</td><td>GeneJET Kit de extracción de gel</td></tr><tr><td>Gel Green Tinción de ácido nucleico GoldBio</td><td></td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de carga de gel púrpura 6x</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL</td></tr><tr><td>Células HEK 293T ATCC</td><td></td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Células HeLa</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software de procesamiento N</td><td>/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de <td>Imidazol 25 mM Imidazol pH 7.2, 2.5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>Corning</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> <td>de lisis20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1% NP40</td></tr><tr>Se utilizó la actualización de<td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>R 2022b para ejecutar las funciones de CellGeo</td></tr><tr><td>Software de automatización y análisis de imágenes de microscopía Metamorph</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep Kit</td><td>Gene Choice</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Geles prefabricados 12 pocillos</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>Grado de Biología Molecular Agua</td><td>Corning</td><td>46-000-CV</td><td></td></tr><tr><td>Espejo policroico multibanda</td><td>Tecnología Chroma</td><td>89903BS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Olympus UPlanSAPO 40x objetivo</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PBS sin Ca y Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0.2 mL 8 tiras y tapones, tiras rígidas Tapas de cúpula unidas individualmente</td></tr><tr><td>Phusion Plus ADN polimerasa</td><td>Thermo Scientific</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Imprimaciones IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein-G Sepharose</td><td>Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de PVDF</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Immun-Blot PVDF/Sándwiches de papel de filtro</td></tr><tr><td>Rapamicina</td><td>Fisher AAJ62473MF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina, 2,21 mM EDTA, 1x [-] sodio</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetato-EDTA (TAE) 50x</td><td>Fischer</td><td>BP1332-1</td><td>para electroforesis</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de lavado <td>20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1% NP40</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td><Anticuerpos fuertes></Fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFR</td><td>Señalización celular</td><td>2232</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ERK 1/2</td><td>Señalización</td> celular de anticuerpo <td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-bandera</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Anticuerpo</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-GFP</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCherry</td><td>Anticuerpo invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Anti-paxilina Anticuerpo</td><td>Thermo Fischer</td><td>BDB612405</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFR Y992 Anticuerpo</td><td>Señalización Celular</td><td>2235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-Erk 1/2 T202/Y204 Anticuerpo</td><td>Señalización Celular</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-paxilina Y31 Anticuerpo</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05-1143</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-PLC&gamma; Y783</td><td>Señalización de células</td> de anticuerpos <td>14008</td><td></td></tr><tr><td>anti-PLC y gamma; </td><td>Señalización Celular de Anticuerpo</td><td>5690</td><td></td></tr></tbody></table>

desarrollo y aplicación de tirosina fosfatasas reguladas por rapamicina

Development and Application of Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatases

La Figura 4 muestra los resultados que se pueden esperar del ensayo de actividad de fosfatasa basado en paxilina. En este experimento, se comparó la actividad de la fosfatasa Shp2 negativa constitutivamente activa y dominante con la de RapR-Shp2 activa e inactiva utilizando fosfopaxilina como lectura. Los constructos Shp2 fueron inmunoprecipitados y sometidos al ensayo de actividad descrito en el protocolo. Las lecturas de fosfo-paxilina para Shp2 constitutivamente activo y RapR-Shp2 activo fueron similares, lo que indica que el RapR-Shp2 activo no se había visto afectado negativamente por la introducción del dominio RapR y conservó toda su actividad una vez activado. El Shp2 negativo dominante y el RapR-Shp2 inactivo también fueron similares, lo que indica que la construcción RapR-Shp2 no tiene actividad cuando está inactivo. Esto indica el diseño exitoso de una RapR-fosfatasa. El fosfosustrato utilizado para este ensayo puede diferir en función de la fosfatasa de interés.
En la Figura 5, similar a la Figura 4, se compara RapR-Shp2 constitutivamente activo, negativo dominante y activo e inactivo. Este experimento se llevó a cabo sin inmunoprecipitación de los constructos. En cambio, fue diseñado para caracterizar los efectos de señalización posteriores de la construcción RapR-Shp2 dentro de las células. Aquí, las construcciones Shp2 se expresaron en HEK293T celdas. Se demostró que el efector posterior ERK1/2 aumenta la fosforilación en respuesta a la activación de RapR-Shp2, al igual que en la muestra constitutivamente activa. El RapR-Shp2 inactivo no indujo este cambio. Esto indica que la señalización descendente de Shp2 se conserva con la incorporación del dominio RapR. De manera similar, los fosfosustratos conocidos EGFR y PLCγ se desfosforilaron en respuesta a la activación de RapR-Shp2 en células A431.
Finalmente, en la Figura 6 se presentan los resultados de la activación de RapR-Shp2 en la morfodinámica de las células HeLa. Una vez que se activó RapR-Shp2, las células mostraron un aumento en la actividad protrusiva, así como en el área celular. Esto indica que la activación de RapR-Shp2 es suficiente para inducir cambios morfodinámicos en las células HeLa y puede permitir a los investigadores sondear vías de señalización posteriores específicas responsables de este efecto.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig04.jpg"> Figura 4: Resultados del ensayo de actividad basado en paxilina: Los modelos constitutivamente activos, dominantes negativos y RapR-Shp2 se inmunoprecipitaron y se sometieron al ensayo de actividad utilizando el protocolo descrito. Los niveles de pY31 paxilina tanto en CA como en RapR-Shp2 fueron similares, lo que indica que el constructo RapR-Shp2 tuvo una actividad similar en comparación con CA Shp2 una vez activado. La muestra de RapR-Shp2 no activada no tenía actividad, similar a la muestra DN, lo que indica que no tenía "fugas". Esta figura fue modificada de Fauser et al.12. Abreviaturas: RapR = regulado por rapamicina; Shp2 = proteína tirosina fosfatasa que contiene el dominio Src homología-2; DN = dominante negativo; CA = constitutivamente activo; FRB = dominio de unión a FKBP-rapamicina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig05.jpg"> Figura 5: Resultados del ensayo de lisado de células completas: Se expresaron células constitutivamente activas, dominantes negativas y RapR-Shp2 en HEK293T células y se completó el protocolo de lisado de células completas. Cuando estaba inactivo, RapR-Shp2 no activó ERK1/2 por fosforilación, de forma similar a la muestra de DN Shp2. Esto indica que RapR-Shp2 no tiene actividad cuando está inactivo. Una vez activado, el nivel de fosforilación de ERK1/2 fue similar al de la muestra de CA Shp2, lo que indica una activación exitosa y una señalización posterior de Shp2. De manera similar, las células A431 que expresan RapR-Shp2 mostraron disminuciones en la fosforilación de EGFR y PLCγ, ambos sustratos conocidos de Shp2. Esta figura fue modificada de Fauser et al.12. Abreviaturas: RapR = regulado por rapamicina; Shp2 = proteína tirosina fosfatasa que contiene el dominio Src homología-2; DN = dominante negativo; CA = constitutivamente activo; ERK = quinasa regulada por señales extracelulares; GAPDH = gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa; EGFR = receptor del factor de crecimiento epidérmico; PLCγ = fosfolipasa C gamma; FRB = dominio de unión a FKBP-rapamicina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig06.jpg"> Figura 6: Análisis de datos de área celular y actividad protrusiva basado en imágenes en vivo: las células HeLa se transfectaron con RapR-Shp2 y se sometieron al protocolo de imágenes en vivo descrito. Los datos se analizaron según lo descrito en el protocolo de análisis de datos. Una vez activadas (indicadas por la línea gris vertical), las células HeLa mostraron aumentos tanto en la actividad protrusiva celular como en el área celular. En las muestras negativas que solo expresaban FRB, esta actividad no estaba presente. Esto indica que la activación de RapR-Shp2 induce cambios morfodinámicos rápidos dentro de las células HeLa y fomenta la diseminación y protrusión celular. Esta figura fue modificada de Fauser et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Desarrollo y aplicación de tirosina fosfatasas reguladas por rapamicina

Tyrosine phosphatases are an important family of enzymes that regulate critical physiological functions. They are often dysregulated in human diseases, ...

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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