Name: Identificación de células infectadas por EcoHIV en ratones transgénicos manipulados con microglía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a identificar células infectadas por EcoHIV en ratones transgénicos Tmem119-EGFP mediante microscopía confocal. Este método revela que las microglia actúan como reservorios virales en el sistema nervioso central.

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<meta charset="utf8"></head><body>Infección por EcoHIV en ratones Tmem119-EGFP para el estudio de las alteraciones microgliales

<ol><li>Vigorito, M., Lashomb, A. L., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+learning+and+memory+in+HIV-1+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Spatial learning and memory in HIV-1 transgenic rats.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 2, 319-328 (2007).</li>
<li>Moran, L. M., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+and+time+again%3A+Temporal+processing+demands+implicate+perceptual+and+gating+deficits+in+the+HIV-1+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Time and time again: Temporal processing demands implicate perceptual and gating deficits in the HIV-1 transgenic rat.</a> J. Neuroimmune Pharmacol. 8 (4), 988-997 (2013).</li>
<li>Repunte-Canonigo,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+consistent+with+neuroAIDS+and+impaired+working+memory+in+HIV-1+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes consistent with neuroAIDS and impaired working memory in HIV-1 transgenic rats.</a> Mol Neurodegener. 9, 26(2014).</li>
<li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (16), 9271-9276 (2001).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+timing%3A+NeuroHIV+progression+in+the+post-cART+era%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Disruption of timing: NeuroHIV progression in the post-cART era.</a> Sci Rep. 9, 827(2019).</li>
<li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+female+rat%3A+Synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic female rat: Synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 9 (5), 642-653 (2014).</li>
<li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J+NeuroVirol%22%5BJournal%5D)">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> J NeuroVirol. 25 (4), 540-550 (2019).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+transgenic+rat+as+a+model+for+HIV-1+infected+individuals+on+HAART%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 transgenic rat as a model for HIV-1 infected individuals on HAART.</a> J Neuroimmunol. 218 (1-2), 94-101 (2010).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+rats+display+alterations+in+immunophenotype+and+cellular+responses+associated+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic rats display alterations in immunophenotype and cellular responses associated with aging.</a> PLoS ONE. 9, e105256(2014).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Illenberger, J. M., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+HIV-1+expression%3A+Role+in+HIV-1+associated+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Microglial HIV-1 expression: Role in HIV-1 associated neurocognitive disorders.</a> Viruses. 13 (5), 924(2021).</li>
<li>Kaiser, T., Feng, G. Tmem119-EGFP and Tmem119-CreERT2 transgenic mice for labeling and manipulating microglia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaiser%2C+T+%22eNeuro%22">eNeuro</a>. 6 (4), (2019).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Satoh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM119+marks+a+subset+of+microglia+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">TMEM119 marks a subset of microglia in the human brain.</a> Neuropathology. 36 (1), 39-49 (2016).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> J Vis Exp. (108), e53697(2016).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+EcoHIV+brain+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rat model of EcoHIV brain infection.</a> J Vis Exp. (167), e62137(2021).</li>
<li>Alfar, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+optimizing+production+and+quality+control+of+infective+EcoHIV+virions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for optimizing production and quality control of infective EcoHIV virions.</a> STAR Protoc. 4 (3), 102368(2023).</li>
<li>Malatesta, P., Hartfuss, E., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+radial+glial+cells+by+fluorescent-activated+cell+sorting+reveals+a+neuronal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Isolation of radial glial cells by fluorescent-activated cell sorting reveals a neuronal lineage.</a> Development. 127 (24), 5253-5263 (2000).</li>
<li>Parpura, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-mediated+astrocyte-neuron+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glutamate-mediated astrocyte-neuron signaling.</a> Nature. 369 (6483), 744-747 (1994).</li>
<li>Wahl, A., Al-Harthi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+of+non-classical+cells+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV infection of non-classical cells in the brain.</a> Retrovirology. 20 (1), 1(2023).</li>
<li>Pandey, H. S., Seth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+turn+foe-astrocytes+contribute+to+neuronal+damage+in+NeuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Friends turn foe-astrocytes contribute to neuronal damage in NeuroAIDS.</a> J. Mol. Neurosci. 69 (2), 286-297 (2019).</li>
<li>Minagar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophage%2Fmicroglia+and+astrocytes+in+the+pathogenesis+of+three+neurologic+disorders%3A+HIV-associated+dementia%2C+Alzheimer%27s+disease%2C+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of macrophage/microglia and astrocytes in the pathogenesis of three neurologic disorders: HIV-associated dementia, Alzheimer's disease, and multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 202 (1-2), 13-23 (2002).</li>
<li>Borrajo, A., Spuch, C., Penedo, M. A., Olivares, J. M., Agís-Balboa, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+role+of+microglia+in+HIV-1+associated+neurocognitive+disorders+and+the+molecular+pathways+implicated+in+its+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Med%22%5BJournal%5D)">Important role of microglia in HIV-1 associated neurocognitive disorders and the molecular pathways implicated in its pathogenesis.</a> Ann Med. 53 (1), 43-69 (2021).</li>
<li>González-Scarano, F., Martín-García, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathogenesis+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The neuropathogenesis of AIDS.</a> Nat Rev Immunol. 5 (1), 69-81 (2005).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+proliferation+underlies+synaptic+dysfunction+in+the+prefrontal+cortex%3A+Implications+for+the+pathogenesis+of+HIV-1-associated+neurocognitive+and+affective+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Microglia proliferation underlies synaptic dysfunction in the prefrontal cortex: Implications for the pathogenesis of HIV-1-associated neurocognitive and affective alterations.</a> J. Neurovirol. 29 (4), 460-471 (2023).</li>
<li>Kim, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+primary+murine+brain+cell+cultures+to+model+HIV+replication+and+neuropathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of primary murine brain cell cultures to model HIV replication and neuropathogenesis.</a> Viruses. 16 (5), 693(2024).</li>
<li>Réu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lifespan+and+turnover+of+microglia+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The lifespan and turnover of microglia in the human brain.</a> Cell Rep. 20 (4), 779-784 (2017).</li>
<li>Jones, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+glial+cell+modulators+in+the+management+of+substance+use+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Drugs%22%5BJournal%5D)">Potential of glial cell modulators in the management of substance use disorders.</a> CNS Drugs. 34 (7), 697-722 (2020).</li>
<li>Kaalund, S. S., Johansen, A., Fabricius, K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untreated+patients+dying+with+aids+have+loss+of+neocortical+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Untreated patients dying with aids have loss of neocortical neurons and glial cells.</a> Front Neurosci. 13, 1398(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Celdas 293FT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>33 G, Aguja RN de cubo pequeño, (Estilo de punta: 3, Longitud de la aguja: 19,25 mm)</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>Solución antibiótica-antimicótica</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100x</td></tr><tr><td>C57BL/6-Tmem119em2Gfng/J</td><td>La cepa de laboratorio Jackson</td><td>#:031823</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina Corning BioCoat 75cm&sup2; Matraz de cultivo celular de cuello inclinado rectangular con tapa ventilada</td><td>Life Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; DMEM con L-glutamina, 4,5 g/L de glucosa y piruvato de sodio</td><td>Life Technologies</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5 World</td><td>Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #7 World</td><td>Precision Instruments</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Microcentrífuga con tapa a presión Biopur Tubos de bloqueo seguro Life</td><td>Technologies 22600028</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluma Cuchillas de acero al carbono de doble filo</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>121-9</td><td></td></tr><tr><td>Biorreactivos de Fisher&nbsp; Medios de microbiología: Caldo LB, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CD11b recombinante humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-214</td> Jeringa inyectora intraocular <td>de dilución 1:50</td></tr><tr><td>(6.5 y micro; L), aguja removible</td><td>Hamilton</td><td>6609071-01</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; Reactivo de transfección Lipofectamine 3000&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; One Shot TOP10 Electrocomp&nbsp;E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404052</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de Iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de Iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ELISA p24 asociado a lentivirus</td><td>Cell Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador Lenti-X</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Suero Reducido</td><td>Tecnologías de Vida Media 11058021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easiSlicer&nbsp; Rebanadora de tejido vibratoria</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>11000</td><td></td></tr><tr><td>PELCO&nbsp; Pro CA44 Adhesivo para tejidos</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>10033</td><td></td></tr><tr><td>PELCO&nbsp; Pro Specimen Retrievers</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>101-33</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-Iba1 para conejos</td><td>Abcam</td><td>ab178847</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>Racor de compresión RN 1 mm</td><td>Hamilton</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurano</td><td>Merritt Veterinary Supply</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley rata embarazada</td><td>Inotiv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Correderas SuperFrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>To-Pro-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td>Kit de tinción de núcleo</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rojo fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Vannas</td><td>World Precision Instruments</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación de células infectadas por ecohiv en ratones transgénicos manipulados con microglía

Identification of EcoHIV-Infected Cells in Microglia-Manipulated Transgenic Mice

Un fragmento de mScarlet (1858 pb) que contenía sitios enzimáticos de "Cla1" en el extremo 3' y "Not1" en el extremo 5' se insertó en el vector lentiviral pNL4-3-EcoHIV (Figura 1). Para validar la expresión de EcoHIV-mScarlet, las células cerebrales primarias aisladas de la corteza de los embriones E18 de rata se trataron con EcoHIV-mScarlet (60 μL, 1,26 × 106 TU/mL) durante 6 días in vitro. Los datos de la Figura 2 mostraron que las señales fluorescentes rojas de mScarlet se localizaban principalmente en los tipos de células gliales en función de la diferente morfología celular. Además, el marcaje de CD11b/c e Iba1 (marcadores celulares de microglía) mostró que las señales de mScarlet estaban colocalizadas con las células CD11b/c + y/o Iba1 +. Los datos indicaron que la microglía era el principal tipo de célula de distribución in vitro de EcoHIV-mScarlet. No hubo infección neuronal significativa en las células cultivadas (Figura suplementaria 1). 
A continuación, se probó la infección de EcoHIV-mScarlet en células gliales mixtas primarias de ratón adulto. Para ello, primero se aislaron y purificaron células gliales mixtas de ratones adultos (2 meses) e infectados con EcoHIV-mScarlet (8 μL, 1,26 × 106 TU/mL) durante 2 días. Las imágenes de la Figura 3 mostraron que EcoHIV-mScarlet infectó con éxito la glía de ratón adulto.
Para abordar aún más el patrón de distribución de EcoHIV-mScarlet en el cerebro del ratón, específicamente para identificar el tipo de célula infectada, EcoHIV-mScarlet se inyectó retroorbital en una línea de ratones knock-in Tmem119-EGFP en la que las microglías se marcaron específicamente con señales EGFP sin ningún otro tipo de conflictos de macrófagos5. Los resultados de la Figura 4 (también en la Figura 2 suplementaria) muestran que se observaron señales de fluorescencia de rojo escarlata en células EGFP positivas, lo que sugiere que la microglía es el principal tipo de célula de expresión de EcoHIV en cerebros de ratones.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig01.jpg"> 
Figura 1: El mapa vectorial de EcoHIV-NL-4-3-mScarlet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig02.jpg"> 
Figura 2: La infección por EcoHIV-mScarlet en células cerebrales primarias de rata. (A,E) Imágenes representativas de la tinción de CD11b/c en células cerebrales primarias. Las células cerebrales se aislaron de embriones de rata E18 y se infectaron con el virus EcoHIV-mScarlet durante 6 días. (B,F) Imágenes representativas de señales fluorescentes mScarlet de células cerebrales in vitro . (C,G) Imágenes representativas de la tinción de Iba1 en las células cerebrales primarias. (D,H) Imágenes combinadas de triple etiquetado de CD11b/c, mScarlet e Iba1. Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig03.jpg"> 
Figura 3: Infección por EcoHIV-mScarlet en células gliales mixtas primarias de ratón. (A,B) Imágenes confocales representativas de la distribución de mScarlet in vitro. Las células gliales mixtas primarias se aislaron de ratones C57BL6 adultos (de 2 meses de edad) y se cultivaron durante 2 semanas antes de la infección viral. El EcoHIV-mScarlet se añadió al medio de cultivo durante dos días y capturó las imágenes bajo el objetivo del 60× del microscopio Confocal. Barra de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig04.jpg"> 
Figura 4: Distribución de EcoHIV-mScarlet en la línea de ratones knock-in Tmem119-EGFP . (A,B) Imágenes combinadas de señales mScarlet/EGFP/ToPro3 en secciones cerebrales. El marco amarillo indica el área objetivo de (B). Barra de escala: 300 μm. (C) Imagen representativa de la distribución de mScarlet en la capa plexiforme externa de la región olfativa de la línea de ratón knock-in Tmem119-EGFP . (D) Imagen representativa de la distribución de EGFP. Las señales fluorescentes se localizaron en células de microglía de la línea de ratones knock-in Tmem119-EGFP . (E) Imagen representativa de la tinción del núcleo TO-PRO-3. Barras de escala: 300 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Tinción de MAP2 y MOG de células cerebrales primarias de rata infectadas con el virus EcoHIV-mScarlet. Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Imágenes confocales de la infección por EcoHIV-mScarlet en la línea de ratones knock-in Tmem119-EGFP . Barras de escala: 75 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 1: EcoHIV-mSecuencia de ADN plasmídico escarlata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20data%20-%20EcoHIV-mScarlet%20plasmid%20DNA%20sequence.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Identificación de células infectadas por EcoHIV en ratones transgénicos manipulados con microglía

Combined antiretroviral therapy (cART) has dramatically improved the quality of life for people living with HIV (PLWH). However, over 4 million PLWH are ...

identification-ecohiv-infected-cells-microglia-manipulated-transgenic

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

La microglía se macrófagos residentes que proporcionan la primera línea de defensa y de vigilancia inmune del sistema nervioso central. Los microARN son moléculas reguladoras que juegan un papel importante en muchos procesos fisiológicos, incluida la activación y diferenciación de los macrófagos. En este artículo se describe el método para la medición de los microRNAs en la microglía.

La detección de microARNs en la microglía por PCR en tiempo real en el SNC normal y durante la neuroinflamación

Nosotros describimos métodos para el aislamiento / cultura eficiente y rápida de la microglia viable desde la corteza cerebral neonatal y adulto de la médula espinal. La disección y placas de microglia cortical se puede lograr dentro de los 90 minutos, con la cosecha microglial posterior que tiene lugar ~ 10 días después de la disección inicial.

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Una clave para el éxito de la investigación de la biología microglial es la preservación de immunofunction microglial ex vivo durante el aislamiento del tejido del SNC. Aislar microglia mediante agitación rotatoria resultados en cultivos de células de alta pureza y inmunofuncional según la evaluación de imágenes fluorescentes, inmunocitoquímica y ELISA después de la activación microglia con el lipopolisacárido estímulos proinflamatorias (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam).

Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

La activación de la microglia y microgliosis son respuestas clave a la neurodegeneración crónica. A continuación, presentamos los métodos para in vivo, visualización a largo plazo de la retina células microgliales CX3CR1-GFP + por oftalmoscopía confocal y de umbral y los análisis morfométricos para identificar y cuantificar su activación. Hacemos un seguimiento de los cambios microgliales durante las primeras etapas del glaucoma relacionada con la edad.

En Vivo Dinámica de Retina Microglial Activación Durante Neurodegeneración: Confocal oftalmoscópico Imaging y Morfometría celular en el ratón Glaucoma

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

El protocolo presentado aquí permite el trasplante de microglía humana derivada de células madre pluripotentes inducidas (iPSMG) en el cerebro a través de una ruta transnasal en ratones inmunocompetentes. Se muestra el método para la preparación y trasplante transnasal de células y la administración de mezcla de citoquinas para el mantenimiento de iPSMG.

Trasplante de microglía derivada de células madre pluripotentes inducidas por humanos en ratones cerebros inmunocompetentes a través de una ruta transnasal no invasiva

En este trabajo se describe un protocolo para la cuantificación de modificaciones globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral aislada. El trabajo también contiene el protocolo de aislamiento de microglía que se utilizó para la recolección de datos.

Cuantificación de las modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada

Describimos un protocolo para aislar células microgliales del hipotálamo del ratón (o pequeñas estructuras cerebrales equivalentes) utilizando la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS), en un tiempo relativamente corto. La microglía hipotalámica clasificada por MACS se puede utilizar para análisis ex vivo y se puede sembrar para realizar ensayos in vitro .

Aislamiento de microglía hipotalámica a partir de cerebro de ratón adulto recién perfundido mediante clasificación de células activadas magnéticamente  

Este artículo demuestra un método para visualizar y cuantificar la motilidad y el contacto de la microglía con puntos postsinápticos en la retina mediante microscopía confocal de disco giratorio.

Imágenes en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía e interacciones con sinapsis en retina murina enferma

Este protocolo combina la citometría de flujo y la secuenciación de ARN unicelular para aislar y caracterizar los estados de las células microgliales en el cerebelo de los cerebros de ratones postnatales tempranos. Utiliza la disociación enzimática, la centrifugación de Percoll y la inmunotinción para revelar la heterogeneidad de la microglía y mejorar la comprensión de sus funciones en el desarrollo y la enfermedad del cerebelo.

Citometría de flujo y análisis unicelular para caracterizar la activación de la microglía en el desarrollo temprano del cerebro de ratón posnatal

Aprenda a identificar células infectadas por EcoHIV en ratones transgénicos Tmem119-EGFP mediante microscopía confocal. Este método revela que las microglia actúan como reservorios virales en el sistema nervioso central.

Identificación de células infectadas por EcoHIV en ratones transgénicos manipulados con microglía

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