Aislamiento de condrocitos y condroprogenitores mediante adhesión de fibronectina y ensayo migratorio

En el campo de la ingeniería de tejidos cartilaginosos y la medicina regenerativa, todavía existe la necesidad de mejorar los resultados biológicos y funcionales en términos de mejorar el tratamiento continuo y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas. La investigación preclínica actual apunta hacia el uso potencial de condroprogenitores derivados del cartílago como una opción viable para la curación del cartílago. La investigación actual incluye estrategias para mejorar aún más el potencial condrogénico mientras se mantiene una potencia hipertrófica más baja mediante el uso de factores de crecimiento adicionales y técnicas de recombinación de genes.

Los condroperogenarios se enfrentan a desafíos experimentales, como la falta de consenso sobre la nomenclatura, las diversas técnicas de aislamiento, las dificultades de caracterización, la variabilidad en las condiciones de cultivo y la comprensión limitada de los mecanismos subyacentes. La demostración clínica de que los condroprogenitores producen resultados positivos en comparación con las células de uso común podría reducir significativamente la carga global asociada con las patologías relacionadas con el cartílago. Evolución de la mejora terapéutica utilizando alternativas libres de células, como vesículas extracelulares derivadas de progenitores, y utilizando estrategias recombinantes para la regeneración de cartílago genuino de tipo hialino.

Para comenzar, obtenga articulaciones tibiofemorales o de rodilla de donantes humanos en 1X PBS en condiciones estériles, luego transfiera las articulaciones extraídas a la almohadilla estéril en la capucha. Para estabilizar las articulaciones, sostenga el hueso subcondral con el cartílago hacia arriba. Con una hoja de bisturí número 22, coseche virutas de cartílago de forma rectangular de las áreas que no soportan peso.

Corta el cartílago en secciones de ocho milímetros por 10 milímetros desde la capa superficial hasta la capa más profunda. Después de lavar las rodajas con PBS, colóquelas en una placa de Petri que contenga uno o dos mililitros de medio de Eagle modificado con Dulbecco, o DMEM. A continuación, con una hoja de bisturí número 22, pica las rodajas de cartílago hasta un tamaño inferior a un milímetro cúbico.

Para empezar, obtenga cartílago picado de articulaciones de rodilla humanas extraídas. Colocar el cartílago picado en un matraz T25 vertical que contenga 10 mililitros de DMEM/F-12 sin suero con 0,15% de colagenasa tipo II para digestión enzimática. Deje el matraz intacto en una incubadora de dióxido de carbono durante 12 a 14 horas.

Después de la digestión durante la noche, transfiera el medio que contiene los condrocitos liberados a un tubo de centrífuga estéril nuevo. Use un colador de células para separar las células de los desechos. Agregue un volumen igual de DMEM/F-12 con un 10% de suero bovino fetal, o FBS.

Centrifugar las células filtradas a 1.200 g durante cinco minutos a 37 grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, reconstituya el pellet en un mililitro de medio. Cuente las células viables mediante un ensayo de exclusión de azul de tripano.

A continuación, cargue los condrocitos en un matraz T25 a una concentración de 10.000 células por centímetro cuadrado. Expanda las celdas hasta el número de paso requerido usando DMEM/F-12 que contenga 10%FBS. Refresque el medio cada tres días antes de cosechar las células en la subconfluencia utilizando 0,125% de tripsina que contenga EDTA.

Los condrocitos se adhirieron rápidamente después de la carga y pasaron de una forma de adoquín redondeado a una apariencia fibroblástica a medida que se expandían. Para empezar, obtenga virutas de cartílago de articulaciones tibiofemorales o de rodilla humanas extraídas. Someter las virutas de cartílago a una digestión enzimática secuencial durante la noche, primero con pronasa al 0,2% durante tres horas, seguido de colagenasa tipo II al 0,04% durante 12 horas en un baño de agua agitado mantenido a 37 grados centígrados.

A continuación, cubra el número necesario de pocillos de una placa de seis pocillos con 1,5 mililitros de la solución de fibronectina PBS. Selle la placa herméticamente y refrigere durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, retire la placa de seis pocillos recubierta de fibronectina del refrigerador.

Después de eliminar el exceso de fibronectina, agregue de dos a tres mililitros de medio DMEM/F-12 simple en los pocillos recubiertos. Siembre los condrocitos liberados en los pocillos recubiertos a una densidad de 4.000 células por pocillo y deje la placa sin tocar durante 20 minutos. Después de la incubación, aspire el exceso de medios y las células no adherentes.

Añadir de dos a tres mililitros de DMEM/F-12 con un 10% de suero fetal bovino a los pocillos. Mantenga las células adherentes en condiciones de cultivo estándar durante 10 a 12 días para obtener clones de células progenitoras condrogénicas, o CPC, luego aísle los clones de CPC usando EDTA de tripsina al 0,125% durante 180 segundos, luego reproduzca en una proporción de un clon por cinco centímetros cuadrados. Amplíe las CPC policlonales enriquecidas hasta la confluencia requerida.

Los condrocitos sometidos a un ensayo de adhesión de fibronectina muestran un crecimiento clonal, alcanzando una población que se duplica de cinco para el día 10. Para comenzar, obtenga los explantes de cartílago afeitado de la articulación recolectada en medio DMEM/F-12 suplementado. Coloque la placa con explantes dentro de una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante 48 horas.

Después de dos días, transfiera los explantes a un tubo de centrífuga que contenga 10 mililitros de solución de colagenasa al 0,1% para la digestión enzimática. Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante dos horas. Después de la digestión, enjuague los explantes con 1X PBS y devuélvalos a los mismos pocillos en el plato que contiene medio DMEM/F-12 fresco suplementado.

Mantenga la placa en la incubadora en condiciones de cultivo estándar y controle la migración de condroprogenitores durante los días siguientes. Una vez que los explantes alcancen la subconfluencia, coseche las células de los condroprogenitores mesenquimales, o MCP, utilizando una solución de EDTA de tripsina al 0,125%. Amplíe los MCP utilizando el medio DMEM/F-12 suplementado.

Los condroprogenitores comienzan a migrar desde el borde del explante en el día 10 de cultivo, exhibiendo un patrón de crecimiento en forma de huso con mayor expansión.