Name: Cribado de fragmentos covalentes mediante el ensayo cuantitativo de anclaje irreversible (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Aprende el ensayo qIT para descubrimiento de fármacos covalentes mediante detección de fragmentos que se unen selectivamente a proteínas diana. Este método escalable identifica ligandos sin necesidad de espectrometría de masas.

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1. Construcción de bibliotecas de fragmentos
<ol>
	<li>Diseña una biblioteca de fragmentos electrófilos y sintúralos o cómpralos. Las bibliotecas de fragmentos electrofílicos suelen consistir en electrófilos ligeramente reactivos (como acrilamidas, cloroacetamidas y sulfonamidas de vinilo) añadidos a una amplia gama de andamios químicos. Las bibliotecas de fragmentos electrofílicos están ampliamente disponibles a través de proveedores comerciales, y se revisan más detalles sobre su diseño y construcción en otra parte 5,11.</li>
	<li>Disuelva cada compuesto en DMSO a una concentración de 50 mM, luego dispense un compuesto diferente en cada pocillo de las columnas 3 a 22 de una placa de depósito de 384 pocillos, denominada placa de biblioteca de fragmentos.<ol>
		<li>Dispense DMSO en cada pocillo de las columnas 1, 2, 23 y 24 para los controles positivos y negativos. La disposición de las placas puede variar en función del número de compuestos que se examinen (Figura 2). El volumen añadido a la placa de biblioteca dependerá del número de cribas a realizar, considerando que se requiere aproximadamente 1,8 μL de cada pocillo por criba qIT. Prepare esta placa de biblioteca de fragmentos con anticipación y guárdela a 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig02.jpg"> 
Figura 2: Disposición de las placas. Una descripción general del diseño de la placa de 384 pocillos del ensayo qIT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. Configuración del ensayo (Figura 3)
<ol>
	<li>Prepare las siguientes soluciones: solución de proteína recombinante (proteína objetivo en cualquier tampón), tampón de ensayo qIT (150 mM de NaCl, 25 mM de Hepes (pH 8)), tampón de enfriamiento del ensayo qIT (150 mM de NaCl, 25 mM de Hepes (pH 7,5)) y soluciones madre compuestas (fragmento electrofílico (50 mM) en DMSO). NOTA: Se utiliza un pH de 8 en el tampón de reacción para acelerar la reacción entre el residuo de cisteína objetivo y los fragmentos, lo que permite medir la velocidad de reacción incluso para fragmentos extremadamente reactivos suavemente. Se utiliza un pH ligeramente más bajo de 7,5 en el tampón de enfriamiento, ya que el enlace tioéter formado entre la maleimida de CPM y el tiol de cisteína es propenso a la hidrólisis a pH más básicos (por ejemplo, trabajos anteriores encontraron que los conjugados de cisteína-maleimida son mucho más estables a pH 7,3 que a pH 812).</li>
	<li>Retire las soluciones madre de fragmentos de DMSO del almacenamiento y déjelas a temperatura ambiente durante un mínimo de 2 horas para permitir que las existencias compuestas se descongelen.</li>
	<li>Desgasifique el tampón de ensayo qIT burbujeando con gas argón durante aproximadamente 30 min.</li>
	<li>Intercambie completamente la solución de proteína objetivo en tampón de ensayo qIT desgasificado. Fundamentalmente, los agentes reductores como el DTT y el TCEP deben eliminarse completamente a concentraciones &lt; 100 nM, ya que interferirán con la cuantificación del tiol. Este paso se puede realizar a través de una serie repetitiva de intercambios de búfer, como se describe a continuación.<ol>
		<li>Diluir la solución de proteínas en exceso del tampón de ensayo qIT desgasificado en una unidad de filtro de centrifugación, concentrar mediante centrifugación (4000 x g, 4 °C, 15 min) y repetir. Por lo general, se requieren 4 rondas de diluciones de 1 en 15 para eliminar suficientemente DTT (1 mM) de 1 mL de solución de proteína recombinante, aunque este paso se puede ajustar dependiendo de la concentración del agente reductor en la solución de proteína recombinante original. NOTA: Alternativamente, la diálisis de la solución de proteína diana contra un gran exceso de tampón de ensayo qIT desgasificado puede lograr el mismo resultado.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Diluir la solución de proteína objetivo (producida en el paso 2.1) hasta una concentración de proteína de 15 μM en tampón de ensayo qIT desgasificado. Se requieren aproximadamente 9 mL de solución de proteína objetivo para llenar una placa de 384 pocillos con suficiente volumen muerto.</li>
	<li>Prepare una suspensión al 1,5% (v/v) de TCEP-agarosa en tampón de ensayo qIT desgasificado. Se requieren aproximadamente 9 mL de suspensión de TCEP-agarosa por placa de cribado.</li>
	<li>Dispensar 20 μL de solución de TCEP-agarosa en cada pocillo de dos placas de 384 pocillos.</li>
	<li>Prepare un caldo de glutatión de 15 μM en tampón de ensayo qIT desgasificado. Esto debe prepararse inmediatamente antes de la siembra, ya que el glutatión se oxida rápidamente en solución sin agente reductor.</li>
	<li>Dispense 20 μL de tampón de ensayo qIT en las columnas 1 y 2 de ambas placas de 384 pocillos.</li>
	<li>Dispense 20 μL de 15 μM de proteína o solución de glutatión (de acuerdo con la placa prevista) en las columnas 3-24 de la placa de 384 pocillos. Estos se denominan placa de reacción de proteínas y placa de reacción de glutatión. Dejar reducir a RT durante 1 h.</li>
	<li>Dispense 58,2 μL de tampón de ensayo qIT desgasificado en cada pocillo de una placa de 384 pocillos, luego transfiera 1,8 μL de cada pocillo correspondiente de la placa de biblioteca de fragmentos para crear una placa de dilución de compuestos, donde cada compuesto se diluye a una concentración de 1,5 mM en tampón de ensayo qIT más 3% de DMSO. NOTA: Este paso se facilita con una estación de pipeteo 384, que permite transferir las existencias compuestas para cada pozo en una sola operación.</li>
	<li>Después de 1 h de incubación de proteína y glutatión con TCEP-agarosa, transfiera 20 μL de solución compuesta de cada pocillo de la placa de dilución compuesta a las placas de reacción de proteína y glutatión para comenzar el ensayo. Este paso también se facilita con una estación de pipeteo 384. Los pasos del ensayo se resumen en la Figura 3. NOTA: La concentración de fragmentos se puede variar según sea necesario, y los ensayos qIT se pueden repetir para los golpes a concentraciones más bajas, si se desea, para confirmar que la afinidad de la proteína no es un artefacto de la alta concentración de fragmentos. La concentración de fragmentos relativamente alta se utiliza para elevar el kpro y el kGSH para garantizar que se puedan determinar tasas precisas para compuestos ligeramente reactivos (que pueden mostrar t1/2 (GSH) &gt; 24 h en las condiciones de ensayo). Además, aunque una concentración de fragmentos de 500 μM es alta, se han utilizado concentraciones altas de μM a bajas mM en el cribado de fragmentos, por ejemplo13.</li>
	<li>Inicie un temporizador: el ensayo ha comenzado y los enfriamientos deben realizarse en puntos de tiempo regulares de acuerdo con la sección a continuación.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig03v2.jpg"> 
Figura 3: Resumen del ensayo qIT. Un resumen que ilustra los pasos clave de la configuración del pozo de reacción del ensayo qIT. (creado con BioRender). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig03largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
3. Enfriamiento CPM
NOTA: Los enfriamientos de CPM se realizan para cuantificar la cantidad de tiol no reaccionado que queda en las placas de reacción de proteínas y glutatión. Estos deben realizarse en puntos de tiempo discretos (por ejemplo, se utilizan normalmente los siguientes puntos de tiempo: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 y 1440 min) para permitir que se monitoree la cinética de la reacción.
<ol>
	<li>Prepare soluciones madre de CPM (500 μM) en DMSO, dispense en alícuotas de 111,2 μL en tubos de microcentrífuga y guárdelas a -20 °C. Estas existencias de CPM se pueden preparar con anticipación y se requerirá 1 alícuota por punto de tiempo de enfriamiento.</li>
	<li>Prepare la solución de enfriamiento de CPM (1,4 μM) descongelando una solución madre de CPM congelada (500 μM) y añadiéndola a 40 ml de tampón de enfriamiento para ensayos qIT.</li>
	<li>Dispensar 27 μL de solución de enfriamiento de CPM en cada pocillo de dos placas de 384 pocillos: se requieren dos para enfriar las placas de reacción de proteínas y glutatión. Estas se denominan placas de enfriamiento CPM, prepárelas un máximo de 30 minutos antes de usarlas.</li>
	<li>Centrifugar la placa de reacción de proteínas a 200 x g durante 3 minutos para asegurarse de que se pegue el TCEP-agarosa.</li>
	<li>En puntos de tiempo predeterminados, transfiera 3 μL de muestra de cada pocillo de la placa de reacción de proteínas a una placa de enfriamiento CPM precargada. Este paso también se simplifica utilizando una estación de pipeteo 384.</li>
	<li>Mezcle la placa de enfriamiento CPM aspirando y dispensando 3 x 25 μL. Es importante extraer la muestra de la parte superior del pocillo para evitar aspirar el TCEP-agarosa en el fondo, lo que interferirá con el enfriamiento de CPM.</li>
	<li>Repita los pasos 3.4-3.6 con la placa de reacción de glutatión.</li>
	<li>Incubar las placas de enfriamiento CPM (preparadas en 3.4-3.6) a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Mida la intensidad de fluorescencia de la placa de enfriamiento CPM (excitación a 384 nm y emisión a 470 nm).</li>
</ol>
4. Análisis de datos y selección de aciertos
<ol>
	<li>Para cada enfriamiento, calcule Z' como una medida de la calidad del ensayo. Cualquier enfriamiento de CPM con Z' &lt; 0.5 debe ser ignorado. Z' = 1 - ((3σcontrol positivo + 3σcontrol negativo) / (μcontrol positivo -μ control negativo)) Donde σ = intensidad de fluorescencia, desviación estándar y μ = intensidad de fluorescencia, media</li>
	<li>Calcule los valores medios de fluorescencia para los pocillos de control negativo y positivo (columnas 1 y 2, y 23 y 24, respectivamente).</li>
	<li>Normalice bien cada reacción a los valores medios de fluorescencia de los controles positivos y negativos: % modificado = 100 x (fluorescencia de pozo compuesto - fluorescencia de control negativo) / (fluorescencia de control positivo - fluorescencia de control negativo)</li>
	<li>Grafique por separado el porcentaje modificado en función del tiempo para cada compuesto que reacciona con el glutatión y con la proteína objetivo.</li>
	<li>Ajuste los datos normalizados de % modificados en función del tiempo a un modelo de decaimiento exponencial monofásico tanto para la reacción con proteína como con glutatión utilizando la ecuación: % Modificado = ae - kt + c Donde a = el rango de % de valores modificados, k = velocidad de reacción, t = tiempo, c = % de valor modificado en tiempo infinito. El ajuste de curvas y la determinación de parámetros se pueden realizar utilizando software comercial (como Graphpad).</li>
	<li>Utilice la velocidad a la que los fragmentos reaccionan con la proteína (kpro) y el glutatión (kGSH) para calcular el valor del factor de mejora de la tasa (REF) para cada fragmento: REF = kpro / kGSH</li>
	<li>Utilice los valores REF para seleccionar fragmentos de visita. Esto se puede realizar estableciendo un umbral REF (por ejemplo, REF &gt; 3), una tasa de aciertos arbitraria (por ejemplo, 2% superior) o seleccionando fragmentos con desviaciones estándar REF 3 mayores que la media geométrica.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Anclaje cuantitativo-irreversible: cribado eficiente de ligandos electrofílicos

<ol><li>Boike, L., Henning, N. J., Nomura, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+covalent+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in covalent drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 21, 881-898 (2022).</li>
<li>Gehringer, M., Laufer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+and+re-emerging+warheads+for+targeted+covalent+inhibitors%3A+Application+in+medicinal+chemistry+and+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Emerging and re-emerging warheads for targeted covalent inhibitors: Application in medicinal chemistry and chemical biology.</a> J Med Chem. 62, 5673-5724 (2019).</li>
<li>Strelow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+the+kinetics+of+covalent+and+irreversible+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">A perspective on the kinetics of covalent and irreversible inhibition.</a> SLAS Discov. 22 (1), 3-20 (2016).</li>
<li>Burger, J. A., Buggy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruton+tyrosine+kinase+inhibitor+Ibrutinib+%28PCI-32765%29%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Bruton tyrosine kinase inhibitor Ibrutinib (PCI-32765).</a> Leukemia Lymphoma. 54 (11), 2385-2391 (2013).</li>
<li>Hocking, B., Armstrong, A., Mann, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+fragment+libraries+in+drug+discovery+-+Design%2C+synthesis+and+screening+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Covalent fragment libraries in drug discovery - Design, synthesis and screening methods.</a> Prog Med Chem. 62, 105-146 (2023).</li>
<li>Lucas, S. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+hits+and+where+to+find+them%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">Covalent hits and where to find them.</a> SLAS Discov. 29 (3), 100142(2024).</li>
<li>Craven, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+kinetic+analysis+for+target-directed+covalent+ligand+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">High-throughput kinetic analysis for target-directed covalent ligand discovery.</a> Angewandte Chemie. 130, 5355-5359 (2018).</li>
<li>Kathman, S. G., Xu, Z., Statsyuk, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fragment-based+method+to+discover+irreversible+covalent+inhibitors+of+cysteine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">A Fragment-based method to discover irreversible covalent inhibitors of cysteine proteases.</a> J Med Chem. 57 (11), 4969-4974 (2014).</li>
<li>Hallenbeck, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry+method+for+screening+disulfide+tethering+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">A liquid chromatography/mass spectrometry method for screening disulfide tethering fragments.</a> SLAS Discov. 23 (2), 183-192 (2019).</li>
<li>Craven, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparamter+kinetic+analysis+for+covalent+fragment+optimization+by+using+quantitative+irreversible+tethering+%28qIT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparamter kinetic analysis for covalent fragment optimization by using quantitative irreversible tethering (qIT).</a> Chem Bio Chem. 21, 3417-3422 (2020).</li>
<li>Keeley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+fragment+libraries+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Covalent fragment libraries in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 25 (6), 983-996 (2020).</li>
<li>Gober, I. N., Sharan, R., Villain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+stability+of+thiol-maleimide+bioconjugates+via+the+formation+of+a+thiazine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Improving the stability of thiol-maleimide bioconjugates via the formation of a thiazine structure.</a> J Pept Sci. 29 (10), e3495(2023).</li>
<li>Olp, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent-fragment+screening+of+BRD4+identifies+a+ligandable+site+orthogonal+to+the+acetyl-lysine+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Covalent-fragment screening of BRD4 identifies a ligandable site orthogonal to the acetyl-lysine binding sites.</a> ACS Chem Biol. 15 (4), 1036-1049 (2020).</li>
<li>Qin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide+fragment+inhibitors+that+induce+unprecedented+conformational+distorions+in+Entereovirus+71+3C+and+SARS-CoV-2+main+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmaceutica+Sinica+B%22%5BJournal%5D)">Acrylamide fragment inhibitors that induce unprecedented conformational distorions in Entereovirus 71 3C and SARS-CoV-2 main protease.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 12 (10), 3924-3999 (2022).</li>
<li>Jamshidiha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+first+structurally+validated+covalent+ligands+of+the+small+GTPase+RAP27A%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of the first structurally validated covalent ligands of the small GTPase RAP27A.</a> RSC Med Chem. 13 (2), 150-155 (2022).</li>
<li>Flanagan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+computational+methods+for+the+characterization+of+covalent+reactive+groups+for+the+prospective+design+of+irreversible+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical and computational methods for the characterization of covalent reactive groups for the prospective design of irreversible inhibitors.</a> J Med Chem. 57, 10072-10079 (2014).</li>
</ol>

Los ligandos covalentes dirigidos reactivos a la cisteína (moléculas que ejercen un efecto biológico al reaccionar con un residuo de cisteína seleccionado sobre una proteína específica) se han vuelto cada vez más populares como herramientas químicas y terapéuticas en las últimas décadas1. Por lo general, consisten en un electrófilo ligeramente reactivo (como una acrilamida, cloroacetamida o vinil sulfona) agregado a un ligando con una alta afinidad por una proteína objetivo2. Idealmente, la interacción ligando-proteína se produce a través de un mecanismo de dos pasos que involucra la unión inicial del ligando no covalente, seguida de la formación irreversible de enlaces covalentes entre la cisteína objetivo y el electrófilo3.
Varios ligandos covalentes dirigidos tempranos, incluido el inhibidor de la tirosina quinasa de Bruton, Ibrutinib, se desarrollaron proporcionando un ligando reversible previamente identificado con un mango electrofílico4. Sin embargo, este enfoque no siempre es exitoso, y otros intentos han encontrado que la instalación de electrófilos requiere una optimización significativa5. En cambio, los enfoques electrófilos primero, particularmente el uso de fragmentos electrofílicos, se han vuelto más populares en los últimos años. Por lo general, estos implican incubar una biblioteca de electrófilos con una proteína y luego seleccionar compuestos con una tasa mejorada de reacción hacia una cisteína, que se supone que es inducida por interacciones productivas no covalentes entre el ligando y el bolsillo de unión6. En particular, estos métodos se aplicaron con éxito durante el desarrollo del inhibidor de KRAS (G12C) Sotorasib1.
El cribado electrófilo plantea varios desafíos únicos en comparación con el cribado tradicional de ligandos no covalentes, principalmente debido a la alta variabilidad en la reactividad dentro y entre las clases de ojivas7. La mayoría de los electrófilos reactivos a la cisteína, con el tiempo, reaccionarán con todos los residuos de cisteína expuestos al solvente, independientemente de cualquier interacción selectiva para la proteína objetivo. Por lo tanto, la ocupación del ligando aumentará con el tiempo para casi todos los electrófilos, y sin controlar la reactividad, la selección de impactos a menudo estará sesgada hacia fragmentos más reactivos que se acoplan a un objetivomás rápidamente.
Además, los métodos de cribado electrófilos suelen utilizar la espectrometría de masas para detectar la formación de aductos proteína-ligando, cuyo rendimiento es limitado9. Se requiere un muestreo regular de la reacción durante un período de tiempo prolongado (horas a días) para caracterizar adecuadamente la cinética de reacción de una biblioteca de compuestos con electrofilicidad variada10. Por lo tanto, una pantalla de 300 fragmentos muestreados en 10 puntos de tiempo requerirá la realización de 3000 espectros de masas, superando el rendimiento de la mayoría de los sistemas de espectrometría de masas de proteínas. Por lo tanto, son deseables métodos de mayor rendimiento para monitorear la formación de aductos proteína-ligando.
El enfoque descrito aquí, el ensayo de anclaje cuantitativo irreversible (qIT), es un método de cribado electrófilo que controla la reactividad intrínseca y utiliza una lectura de fluorescencia simple7. La proteína, o glutatión (un tripéptido no estructurado que contiene tiol utilizado como control de la reactividad intrínseca) se incuba con una biblioteca de fragmentos electrofílicos, y se toman muestras regulares para su enfriamiento en una solución de CPM (7-dietilamino-3-(4'-maleimidilfenil)-4-metilcumarina, un agente fluorogénico de cuantificación de tiol). La formación de aductos entre la cisteína y el fragmento electrofílico reduce la cantidad de tiol disponible para la reacción con CPM, reduciendo la fluorescencia resultante en el enfriamiento. Por lo tanto, la fluorescencia CPM actúa como un proxy del tiol no reaccionado, lo que permite determinar la cinética de la reacción del tiol con cada fragmento electrofílico. Los fragmentos electrofílicos con una reactividad proteica significativamente mejorada sobre el glutatión se seleccionan como aciertos y se priorizan para un mayor desarrollo (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema de qIT. Una visión general esquemática del ensayo qIT. (creado con BioRender). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La selección de aciertos mediante valores REF controla la reactividad intrínseca y garantiza que los fragmentos solo se seleccionen como aciertos si forman interacciones productivas no covalentes con una proteína diana. La simple lectura de fluorescencia también significa que el ensayo qIT es altamente escalable y no requiere métodos de monitoreo de reacción basados en espectrometría de masas.
Aquí, se describe un procedimiento completo para el ensayo qIT, con resultados de ejemplo incluidos para ilustrar el rendimiento del ensayo y la selección de aciertos.

<table><tbody><tr><td>Gas argón</td><td>BOC</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384 pocillos, brida baja, placas de ensayo de fondo plano</td><td>Corning</td><td>3575</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>Invitrogen</td><td>D346</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-agarosa inmovilizado</td><td>Pierce</td><td>77712</td><td></td></tr><tr><td>Micro lector de placas</td><td>CLARIOstar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sellos de placa de PCR</td><td>BioRad</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>L-glutatión reducido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Hepes de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES6007H-A7</td><td></td></tr></tbody></table>

cribado de fragmentos covalentes mediante el ensayo cuantitativo de anclaje irreversible

Covalent Fragment Screening Using the Quantitative Irreversible Tethering Assay

El ensayo qIT se utiliza aquí para identificar fragmentos covalentes para una proteína de cisteína única sin nombre. Se añadió MgCl2 (10 mM) a los tampones de reacción, ya que se sabe que la proteína objetivo se une a los iones Mg2+ . El cribado se realizó por triplicado y se determinó la velocidad a la que cada fragmento reaccionó tanto con la proteína diana (kpro) como con el glutatión (kGSH). Los valores de Z' fueron superiores a 0,5 para todas las placas de enfriamiento y promediaron 0,75 para los enfriamientos con proteínas y 0,79 para los enfriamientos con glutatión, lo que indica un excelente rendimiento del ensayo. A continuación, se calcularon los valores de REF para cada fragmento y se seleccionaron las visitas en las que REF &gt; 3.
Los resultados representativos (Figura 4) proporcionan un ejemplo de selección de aciertos utilizando el ensayo qIT. El compuesto 1 reaccionó a una velocidad 6,0 veces mayor con el residuo de cisteína en la proteína objetivo que con el glutatión y, utilizando un criterio de REF &gt; 3, se seleccionó como un éxito (Figura 4B). Esta aceleración de la velocidad indica la presencia de un efecto de plantilla, por el cual las interacciones no covalentes colocan a 1 en la orientación correcta para que la cisteína en la proteína objetivo reaccione con la ojiva de cloroacetamida. Por el contrario, 2 es un ejemplo de un fragmento no golpeado, ya que la reacción entre 2 y el residuo de cisteína objetivo no se acelera en relación con la reacción entre 2 y glutatión. La falta de aceleración de la velocidad indica que no hay interacciones no covalentes productivas, posicionando a 2 en la orientación correcta para reaccionar con el residuo de cisteína objetivo.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig04v2.jpg"> 
Figura 4: Resultados representativos. Los resultados muestran el monitoreo de la reacción de proteínas y glutatión mediante qIT para (A) una alta reactividad intrínseca, un posible fragmento de golpe falso positivo y (B) un fragmento de golpe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig04largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Cribado de fragmentos covalentes mediante el ensayo cuantitativo de anclaje irreversible

Compounds that form covalent bonds with specific target proteins offer a variety of advantages&#160;as chemical probes and therapeutic agents. Most ...

covalent-fragment-screening-using-quantitative-irreversible-tethering

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

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Este protocolo describe la inmovilización covalente de las proteínas con un agente de acoplamiento de silano heterobifunctional a superficies de óxido de silicio diseñado para la espectroscopia de fuerza de fuerza atómica microscopio basado sola molécula que es ejemplificada por el interacción de RrgA (adhesina de pilus-1 punta de S. pneumoniae) con fibronectina.

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

Se describe un método altamente paralelo para medir el escote específico del sitio del ADN a nivel de molécula única. Este protocolo muestra la técnica mediante la restricción endonucleasa NdeI. El método se puede modificar fácilmente para estudiar cualquier proceso que resulte en una escisión de ADN específica del sitio.

Ensayo cinético de molécula única de alto rendimiento paralelo para la escoja de ADN específica del sitio

Utilizando ADN marcado con puntos cuánticos y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total, podemos investigar el mecanismo de reacción de las endonucleasas de restricción mientras usamos proteínas no marcadas. Esta técnica de una sola molécula permite la observación masiva y multiplexada de las interacciones individuales proteína-ADN, y los datos se pueden agrupar para generar distribuciones de tiempo de permanencia bien pobladas.

Análisis de tiempo de permanencia de una sola molécula de la escisión de ADN mediada por endonucleasas de restricción

El cribado de fragmentos cristalográficos en el Helmholtz-Zentrum Berlin se realiza utilizando un flujo de trabajo con bibliotecas de compuestos dedicadas, herramientas de manejo de cristales, instalaciones de recopilación de datos rápidas y análisis de datos en gran parte automatizado. El protocolo presentado tiene la intención de maximizar la salida de tales experimentos para proporcionar puntos de partida prometedores para el diseño de ligandos basados en la estructura aguas abajo.

Flujo de trabajo y herramientas para la detección de fragmentos cristalográficos en el Helmholtz-Zentrum Berlin

El cribado basado en fragmentos mediante RMN es un método robusto para identificar rápidamente aglutinantes de moléculas pequeñas a biomacromoléculas (ADN, ARN o proteínas). Se presentan protocolos que describen la preparación de muestras basada en la automatización, los experimentos de RMN y las condiciones de adquisición, y los flujos de trabajo de análisis. La técnica permite la explotación óptima de núcleos activos de RMN de 1H y 19F para su detección.

Cribado de fragmentos basado en RMN en una muestra mínima pero en modo de automatización máxima

Este artículo describe el proceso completo de XChem para el cribado de fragmentos basados en cristales, desde la solicitud de acceso y todos los pasos posteriores hasta la difusión de los datos.

Lograr un cribado eficiente de fragmentos en las instalaciones de XChem en Diamond Light Source

El monitoreo de los cambios en la temperatura de fusión de una proteína objetivo(es decir,el ensayo de cambio térmico, TSA) es un método eficiente para examinar bibliotecas de fragmentos de unos pocos cientos de compuestos. Presentamos un protocolo TSA que implementa la fluorimetría de escaneo nano-diferencial asistida por robótica (nano-DSF) para monitorear la fluorescencia intrínseca de triptófano y la retrodisparión de luz para la detección de fragmentos.

Fluorimetría de barrido nanodes diferencial para el cribado en el descubrimiento de plomo basado en fragmentos

Aquí, describimos un método para la coexpresión bacteriana de proteínas marcadas diferencialmente utilizando un conjunto de vectores compatibles, seguido de las técnicas convencionales de pulldown para estudiar complejos de proteínas que no pueden ensamblarse in vitro.

Ensayo pulldown junto con coexpresión en células bacterianas como una herramienta eficiente en el tiempo para probar interacciones desafiantes proteína-proteína

En este trabajo se describen protocolos para la caracterización biofísica de la formación de complejos ternarios inducidos por quimeras dirigidas a proteólisis (PROTACS) que involucran a las ubiquitinas ligasa Von Hippel-Lindau E3 ligasa (VHL) y Cereblon (CRBN).  Los métodos biofísicos que se ilustran en este documento incluyen la resonancia de plasmones de superficie (SPR), la interferometría de biocapas (BLI) y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC).

Desarrollo y Aplicación de Ensayos Biofísicos para la Evaluación de la Formación de Complejos Ternarios Inducida por Quimeras Dirigidas a la Proteólisis (PROTACS)

Aprende el ensayo qIT para descubrimiento de fármacos covalentes mediante detección de fragmentos que se unen selectivamente a proteínas diana. Este método escalable identifica ligandos sin necesidad de espectrometría de masas.

Cribado de fragmentos covalentes mediante el ensayo cuantitativo de anclaje irreversible

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