Cribado de fragmentos covalentes mediante el ensayo cuantitativo de anclaje irreversible

Trabajamos entre los departamentos de química y ciencias de la vida, desarrollando nuevos ligandos covalentes reactivos para una serie de dianas farmacológicas contra el cáncer. Se espera que estas moléculas se utilicen en el futuro, ya sea como terapias o posiblemente como sondas químicas. Por lo tanto, existen varias tecnologías para el cribado de ligandos covalentes.

A grandes rasgos, pueden dividirse en técnicas proteómicas, en las que los compuestos se incuban con células cultivadas y espectrometría de masas, utilizada para determinar qué proteínas etiquetan las moléculas, y métodos basados en dianas, en los que se incuban bibliotecas de electrófilos con proteínas individuales. Un desafío experimental importante se relaciona con la reactividad de los ligandos covalentes. Las moléculas demasiado reactivas a menudo aparecerán como resultados durante los ensayos de detección, pero no son adecuadas, ya que marcarán de forma no selectiva muchas proteínas diferentes en la célula.

Por lo tanto, es crucial tener en cuenta el compuesto de actividad en cada paso del descubrimiento de fármacos covalentes. Por lo tanto, los grupos de Mann y Armstrong en Imperial han desarrollado un nuevo método para examinar electrófilos contra una proteína objetivo, llamado anclaje cuantitativo irreversible o ensayo qIT. Nuestro protocolo proporciona un nuevo método muy necesario para examinar electrófilos contra una proteína objetivo, que es escalable, no requiere espectrometría de masas y controla la reactividad intrínseca de los compuestos.

Para empezar, prepare todas las soluciones madre necesarias y déjelas a temperatura ambiente durante dos horas antes del experimento. Desgasificación cuantitativa, anclaje irreversible o tampón de ensayo qIT con gas argón durante aproximadamente 30 minutos. Para un intercambio de tampón eficaz, diluya la solución de proteína en exceso del tampón de ensayo qIT desgasificado en una unidad de filtro de centrifugación y centrifuga a 4.000 g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius para concentrar la proteína.

A continuación, diluya la solución de proteína objetivo hasta una concentración de 15 micromolares en tampón de ensayo qIT desgasificado para preparar nueve mililitros de la solución. Dispense la solución de TCEP-agraosa, el tampón qIT y el caldo de glutatión en los pocillos apropiados de las placas de 384 pocillos. Transfiera 1,8 microlitros de cada pocillo correspondiente de la placa de la biblioteca de fragmentos para crear una placa de dilución de compuestos que diluya cada compuesto a 1,5 milimolar en tampón de ensayo qIT, más 3% de DMSO.

Utilice una estación de pipeteo 384 para transferir 20 microlitros de solución compuesta de cada pocillo de la placa de dilución compuesta a ambas placas de reacción. Para empezar, configure el ensayo cuantitativo de anclaje irreversible o qIT con la proteína y el glutatión deseados. Dispense 500 micromolares de CPM en alícuotas de 111,2 microlitros en tubos de microcentrífuga y guárdelos a 20 grados centígrados.

Después de descongelar el stock de CPM, agréguelo a 40 mililitros de tampón de enfriamiento de ensayo qIT para preparar una solución de 1,4 micromolares Dispense 27 microlitros de solución de enfriamiento de CPM en cada pocillo de dos placas frescas de 384 pocillos. Centrifugar la placa de reacción proteica a 200 g durante tres minutos para granular TCEP-agarosa. En puntos de tiempo predeterminados, utilice una estación de pipeteo 384 para transferir tres microlitros de muestra de cada pocillo de la placa de reacción de proteínas a la placa de enfriamiento CPM.

Retire la muestra de la parte superior del pocillo, evitando aspirar TCEP-agarosa en la parte inferior. Incubar las placas de enfriamiento CPM a temperatura ambiente durante una hora y medir la intensidad de fluorescencia con una excitación a 384 nanómetros y una emisión a 470 nanómetros. Para empezar, realice el anclaje cuantitativo-irreversible o el ensayo qIT con la proteína deseada y enfríe las muestras en placa CPM.

Para cada enfriamiento, calcule Z prime como una medida de la calidad del ensayo. A continuación, calcule los valores medios de fluorescencia para los pocillos de control negativo de las columnas uno y dos y los pocillos de control positivo de las columnas 23 y 24. Normalice bien cada reacción a los valores medios de fluorescencia de los controles positivos y negativos, y trace por separado el porcentaje modificado en comparación con el tiempo para cada compuesto que reacciona con el glutatión y con la proteína objetivo.

Con GraphPad, ajuste los datos de porcentaje normalizado modificado en comparación con el tiempo a un modelo de decaimiento exponencial de una fase para ambas reacciones utilizando la ecuación, AE a la potencia de KT C. Utilice la velocidad a la que los fragmentos reaccionan con la proteína y el glutatión para calcular el factor de mejora de la tasa o el valor REF para cada fragmento. Por último, para seleccionar fragmentos de visita, establezca un umbral de REF, una tasa de visitas arbitraria o seleccione fragmentos con REF tres desviaciones estándar mayores que la media geométrica. El compuesto uno reaccionó con el residuo de cisteína en la proteína objetivo a una tasa seis veces mayor que con el glutatión, cumpliendo el criterio Hit de REF superior a tres.

El compuesto dos no mostró una velocidad de reacción acelerada con el residuo de cisteína objetivo en comparación con el glutatión, lo que indica una falta de interacciones productivas no covalentes y, por lo tanto, no se seleccionó como un éxito.