Name: Polarización y caracterización de macrófagos derivados de monocitos humanos M1 y M2 en superficies de implantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-06T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a polarizar macrófagos M1 y M2 derivados de monocitos humanos en superficies de titanio usando qRT-PCR, ELISA y microscopía confocal. Este protocolo estandarizado mejora el diseño de biomateriales inmunomoduladores.

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<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación de los efectos inmunomoduladores de las superficies de los implantes en los macrófagos

<ol><li>Othman, Z., Pastor, B. C., van Rijt, S., Habibovic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+interactions+between+biomaterials+and+biological+systems+using+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Understanding interactions between biomaterials and biological systems using proteomics.</a> Biomaterials. 167, 191-204 (2018).</li>
<li>Ikada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Challenges in tissue engineering.</a> J R Soc Interface. 3 (10), 589-601 (2006).</li>
<li>Aamodt, J. M., Grainger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-based+biomaterial+scaffolds+and+the+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-based biomaterial scaffolds and the host response.</a> Biomaterials. 86, 68-82 (2016).</li>
<li>Batool, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+immune-inflammatory+responses+through+surface+modifications+of+biomaterials+to+promote+bone+healing+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Modulation of immune-inflammatory responses through surface modifications of biomaterials to promote bone healing and regeneration.</a> J Tissue Eng. 12, 20417314211041428(2021).</li>
<li>Mantovani, A., Biswas, S. K., Galdiero, M. R., Sica, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization+in+tissue+repair+and+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization in tissue repair and remodelling.</a> J Pathol. 229 (2), 176-185 (2013).</li>
<li>Shrivastava, R., Shukla, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attributes+of+alternatively+activated+%28M2%29+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Attributes of alternatively activated (M2) macrophages.</a> Life Sci. 224, 222-231 (2019).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 5 (12), 953-964 (2005).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li>
<li>Kzhyshkowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+responses+to+implants%3A+prospects+for+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophage responses to implants: prospects for personalized medicine.</a> J Leukoc Biol. 98 (6), 953-962 (2015).</li>
<li>Browne, S., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial-mediated+modification+of+the+local+inflammatory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biomaterial-mediated modification of the local inflammatory environment.</a> Front Bioeng Biotechnol. 3, 67(2015).</li>
<li>Piatnitskaia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+macrophage+responses+to+biomaterials+in+vitro%3A+state-of-the-art+and+the+need+for+the+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Modelling of macrophage responses to biomaterials in vitro: state-of-the-art and the need for the improvement.</a> Front Immunol. 15, 1349461(2024).</li>
<li>Rayahin, J. E., Gemeinhart, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+macrophages+in+response+to+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Activation of macrophages in response to biomaterials.</a> Results Probl Cell Differ. 62, 317-351 (2017).</li>
<li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization.</a> Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).</li>
<li>Gordon, S., Pluddemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+macrophages%3A+heterogeneity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue macrophages: heterogeneity and functions.</a> BMC Biol. 15 (1), 53(2017).</li>
<li>Salma Iqbal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+in+vitro+generated+human+polarized+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of in vitro generated human polarized macrophages.</a> J Clin Cell Immunol. 6, 1-8 (2015).</li>
<li>Hotchkiss, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+surface+characteristics%2C+including+topography+and+wettability%2C+alter+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Titanium surface characteristics, including topography and wettability, alter macrophage activation.</a> Acta Biomater. 31, 425-434 (2016).</li>
<li>Wang, Y., Zhang, Y., Sculean, A., Bosshardt, D. D., Miron, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+behavior+and+interplay+with+gingival+fibroblasts+cultured+on+six+commercially+available+titanium%2C+zirconium%2C+and+titanium-zirconium+dental+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oral+Investig%22%5BJournal%5D)">Macrophage behavior and interplay with gingival fibroblasts cultured on six commercially available titanium, zirconium, and titanium-zirconium dental implants.</a> Clin Oral Investig. 23 (8), 3219-3227 (2019).</li>
<li>Abaricia, J. O., Shah, A. H., Ruzga, M. N., Olivares-Navarrete, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+characteristics+on+commercial+dental+implants+differentially+activate+macrophages+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oral+Implants+Res%22%5BJournal%5D)">Surface characteristics on commercial dental implants differentially activate macrophages in vitro and in vivo.</a> Clin Oral Implants Res. 32 (4), 487-497 (2021).</li>
<li>Lu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+osseointegration+of+strontium-modified+titanium+implants+by+regulating+angiogenesis+and+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Improved osseointegration of strontium-modified titanium implants by regulating angiogenesis and macrophage polarization.</a> Biomater Sci. 10 (9), 2198-2214 (2022).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obstacles+and+opportunities+for+understanding+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Obstacles and opportunities for understanding macrophage polarization.</a> J Leukoc Biol. 89 (4), 557-563 (2011).</li>
<li>Nascimento, C. R., Fernandes, N. A. R., Maldonado, L. A. G., Junior, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+monocytic+cell+lines+U937+and+THP-1+as+macrophage+models+for+in+vitro+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of monocytic cell lines U937 and THP-1 as macrophage models for in vitro studies.</a> Biochem Biophys Rep. 32, 101383(2022).</li>
<li>Freytes, D. O., Kang, J. W., Marcos-Campos, I., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+modulate+the+viability+and+growth+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Macrophages modulate the viability and growth of human mesenchymal stem cells.</a> J Cell Biochem. 114 (1), 220-229 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+type+modulates+osteogenic+differentiation+of+adipose+tissue+MSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophage type modulates osteogenic differentiation of adipose tissue MSCs.</a> Cell Tissue Res. 369 (2), 273-286 (2017).</li>
<li>Cerqueira, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+inflammatory+responses+to+sol-gel+coatings+with+distinct+biocompatibility+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the inflammatory responses to sol-gel coatings with distinct biocompatibility levels.</a> J Biomed Mater Res A. 109 (9), 1539-1548 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Cheng, X., Jansen, J. A., Yang, F., van den Beucken, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titanium+surfaces+characteristics+modulate+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Titanium surfaces characteristics modulate macrophage polarization.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 95, 143-151 (2019).</li>
<li>Nobs, S. P., Kopf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages%3A+guardians+of+organ+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages: guardians of organ homeostasis.</a> Trends Immunol. 42 (6), 495-507 (2021).</li>
<li>Sreejit, G., Fleetwood, A., Murphy, A., Nagareddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+diversity+of+macrophages+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Immunology%22%5BJournal%5D)">Origins and diversity of macrophages in health and disease.</a> Clin Transl Immunology. 9 (12), e1222(2020).</li>
<li>Parisi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+human+primary+macrophages+to+study+the+polarization+from+monocyte-derived+macrophages+to+pro-or+anti-inflammatory+macrophages+at+biomaterial+interface+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Sci%22%5BJournal%5D)">Preparation of human primary macrophages to study the polarization from monocyte-derived macrophages to pro-or anti-inflammatory macrophages at biomaterial interface in vitro.</a> J Dent Sci. 18 (4), 1630-1637 (2023).</li>
<li>Feuerer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+retrieval+from+3D+biomaterials%3A+A+detailed+comparison+of+common+dissociation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Macrophage retrieval from 3D biomaterials: A detailed comparison of common dissociation methods.</a> J Immunol Regen Med. 11, 100035(2021).</li>
<li>Shapouri-Moghaddam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity%2C+polarization%2C+and+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease.</a> J Cell Physiol. 233 (9), 6425-6440 (2018).</li>
<li>Sridharan, R., Cameron, A. R., Kelly, D. J., Kearney, C. J., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial+based+modulation+of+macrophage+polarization%3A+a+review+and+suggested+design+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Today%22%5BJournal%5D)">Biomaterial based modulation of macrophage polarization: a review and suggested design principles.</a> Mater Today. 18 (6), 313-325 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Placa de 24 pocillos, sin tratar</td><td>Corning Incorporated (Kennebunk, EE. UU.)&nbsp;</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>Lector de absorbancia Infinite F50&nbsp;</td><td>TECAN Austria GmbH (Gr&ouml; dig, Austria)</td><td>TCAT91000001</td><td></td></tr><tr><td>Accutase en DPBS, 0,5 mM EDTA</td><td>EMD Millipore Corp. (Burlington, EE. UU.)</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje de fluorescencia antidecoloración - Acuoso, Fluoroshield</td><td>abcam (Cambridge, Reino Unido)</td><td>ab104135</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad MJ Research PTC-200 Peltier Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad / MJ Research</td><td>7212</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>VWR International bvba (Lovaina, Bélgica)</td><td>422361V</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5804 R</td><td>Eppendorf SE (Hamburgo, Alemania)</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>DC-SIGN (D7F5C) XP Rabbit mAb</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>13193</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td>Aldrich Co. (St.Louis, MO, EE. UU.)</td><td>D2438-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 Solución de tinción</td><td>Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania)</td><td>130-117-344</td><td></td></tr><tr><td>Etanol &ge; 99,8% para biología molecular</td><td>Carl Roth GmbH + CO. KG (Karlsruhe, Alemania)</td><td>1HPH.1</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-ratón de cabra (H& L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido , Alexa Fluor Plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32723TR</td><td></td></tr><tr><td>anti-conejo de cabra Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H + L), Cyanine3</td><td>Invitrogen</td><td>A10520</td><td></td></tr><tr><td>Prisma</td><td>GraphPad Versión de GraphPad</td><td>&nbsp; 9.4.1</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo CCR7 humano</td><td>R& D Systems</td><td>MAB197</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen recombinante de IFN-gamma humano</td><td>(Rockford, EE. UU.)</td><td>RIFNG100</td><td></td></tr><tr><td>IL-13 humano</td><td>Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania)</td><td>5230901032</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 humano</td><td>Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Alemania)</td><td>130-095-373</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF humano</td><td>Peprotech (Cranbury, EE. UU.)</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems CMS GmbH (Mannheim, Alemania)</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5/</td><td></td></tr> <tr><td>Lipopolisacáridos de Escherichia</td><td>Sigma Aldrich Co. (Missouri, EE. UU.)</td><td>L4391-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Luna Universal qPCR Master Mix&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>NEB #M3003</td><td></td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E3010L</td><td></td></tr><tr><td>Medio de separación de linfocitos 1077</td><td>PromoCell (Heidelberg, Alemania)</td><td>C-44010</td><td></td></tr><tr><td>MCP-4/CCL13 Human ELISA Kit</td><td>Invitrogen</td><td>EHCCL13</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Placa de reacción rápida de 96 pocillos (0,1 ml)</td><td>Applied Biosystems (Waltham, EE. UU.)</td> <td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>Película adhesiva óptica MicroAmp</td><td>Life Technologies Corporation (Carlsbad, EE. UU.)</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Splash Free 96-Well Base</td><td>Applied Biosystems (Waltham, EE. UU.)</td> <td>4312063</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de microlitros CD-3124R</td><td>Phoenix Instrument (Alemania)</td><td>9013111121</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de microscopio, 10 mm</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania</td><td>4HX4.1</td><td></td></tr><tr><td>medio de fijación de monocitos</td><td>PromoCell (Heidelberg, Alemania)</td><td>C-28051</td><td></td></tr><tr><td>Multiply-Pro Gef&auml; &szlig; 0,5 mL, PP</td><td>Sarstedt AG & CO (N&uuml; mbrecht, Alemania)</td><td>7,27,35,100</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop One</td><td>Thermo Scientific (EE. UU.)</td> <td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio&nbsp; 3 System</td><td>Life Technologies GmbH (St. Leon-Rot, Alemania)</td><td>A28567</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74007</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, 1x, con L-glutamina</td><td>Mediatech, Inc. (Manassas, EE. UU.)</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Banco estéril, LaminarAir HB 2472&nbsp;</td><td>Heraeus instruments (Hanau, Alemania)</td><td>51012197</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos para cultivo de tejidos 13 mm (plástico)</td><td>Sarstedt Inc. (Newton, EE. UU.)</td><td>83,18,40,002</td><td></td></tr><tr><td>Discos mecanizados de titanio 12 cm&nbsp;</td><td>Medentis Medical (Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Alemania)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TNF alfa ELISA humano Kit</td><td>Invitrogen</td><td>KHC3011</td><td></td></tr><tr><td>solución de azul de tripán 0,4%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Alemania)</td><td>1680.1</td><td></td></tr></tbody></table>

polarización y caracterización de macrófagos derivados de monocitos humanos m1 y m2 en superficies de implantes 

Polarization and Characterization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Macrophages on Implant Surfaces

Los resultados de este estudio demuestran el éxito de la diferenciación y polarización de los MDM en superficies de titanio, seguido de la caracterización de los macrófagos polarizados M1 o M2. En el primer paso, caracterizamos los MDM polarizados utilizando CLSM. Según nuestros estudios preliminares, CD209 y CCR7 se utilizaron como marcadores específicos para diferenciar los MDM polarizados M1 de los M2. Como se muestra en la Figura 2A, B, los MDM se polarizaron con éxito en macrófagos M1 y M2. En la superficie del titanio, CCR7 se expresó con más fuerza en los macrófagos polarizados M1 que CD209, expresado específicamente en los macrófagos polarizados M2. Además, la cuantificación de la intensidad relativa de fluorescencia facilitó la asignación de marcadores a los subtipos M1 o M2 (Figura 2C).
La Figura 3 muestra un análisis representativo de qRT-PCR de MDM en superficies de titanio y cubreobjetos. Los resultados mostraron que los MDM en ambas superficies se polarizaron con éxito, como lo demuestra la alta expresión de los marcadores de polarización M1 (CCR7 y TNF-ɑ) y M2 (CD209 y CCL13). Esto se confirmó aún más a nivel de proteínas al observar altos niveles de citocinas inflamatorias de TNF-α (Figura 4A) y quimiocinas IL-13 (Figura 4B) en células polarizadas M1 y M2, respectivamente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67180/67180fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática del protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67180/67180fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67180/67180fig02v2.jpg"> Figura 2: Caracterización de MDMs polarizados utilizando CLSM. El enriquecimiento de macrófagos polarizados M1 y M2 se confirmó mediante tinción de anticuerpos específicos y análisis CLSM utilizando anticuerpos CCR7 y CD209 en el día 2 de la possiembra. De acuerdo con la tinción de fluorescencia y el análisis CLSM, (A) con un aumento de 25x y (B) con un aumento de 63x, las células M1 expresaron un CCR7 más alto (en verde) que M0 o M2. Las células M2 exhiben un patrón de expresión significativo de CD209 (en verde). (C) El análisis cuantitativo de la intensidad relativa de fluorescencia de CCR7 y CD209. Los núcleos se tiñeron con DRAQ5 (en púrpura). Los resultados son representativos de 5 experimentos similares realizados de forma independiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67180/67180fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67180/67180fig03.jpg"> Figura 3: Caracterización de MDMs polarizados mediante perfiles de expresión génica. Se utilizó la polimerasa cuantitativa con transcriptasa inversa para estudiar los niveles de ARNm de diferentes genes asociados con la polarización de M1 (CCR7 y TNF-ɑ) y M2 (CD209 y CCL13). Se utilizó GAPDH como gen de limpieza. Los datos se presentan como media ± SEM (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67180/67180fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67180/67180fig04.jpg"> Figura 4: Producción de citocinas por macrófagos M0, M1 y M2 cultivados en cubreobjetos de titanio y plástico. (A) El nivel de citocinas TNF-ɑ y (B) los niveles de CCL13 en los sobrenadantes de cultivo celular se midieron utilizando ELISA. La secreción de citocinas se normalizó a la secreción total de proteínas medida por el ensayo BCA. Los gráficos de barras representan la media ± SEM (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67180/67180fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tampón/Solución</td>
			<td>Contenido</td>
		</tr><tr><td>Tampón de tinción/bloqueo</td>
			<td>PBS + 1% BSA + 0.1% Tween 20</td>
		</tr><tr><td>Tampón de lavado</td>
			<td>PBS + 0.1% Preadolescente 20</td>
		</tr><tr><td>Tampón de fijación</td>
			<td>3% de paraformaldehído (PFA) en PBS</td>
		</tr><tr><td>Búfer de almacenamiento</td>
			<td>1% de penicilina y estreptomicina en PBS</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Lista de búferes.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nombre del cebador</td>
			<td>Secuencias de cebadores hacia adelante</td>
			<td>Secuencias de cebadores inversas</td>
		</tr><tr><td>GAPDH</td>
			<td>5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'</td>
			<td>5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'</td>
		</tr><tr><td>CCR7</td>
			<td>5'- TGGTGATCGGCTCTCTCTTC-3'</td>
			<td>5'- CACCTTGATGGCCTTGTTGC-3'</td>
		</tr><tr><td>CD209</td>
			<td>5'- GGAGCAGAACTTCCTACAGC-3'</td>
			<td>5'- CAACGTTGTTGGGCTCTCCT-3'</td>
		</tr><tr><td>CCL13</td>
			<td>5'-ATCTCCTTGCAGAGGCTGAA-3'</td>
			<td>5'-ACTTCTCCTTTGGGTCAGCA-3'</td>
		</tr><tr><td>TNF-ɑ</td>
			<td>5'- GCTGCACTTTGGAGTGATCG-3'</td>
			<td>5'- TCACTCGGGGTTCGAGAAGA-3'</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2. Secuencias de cebadores utilizados en qRT-PCR.

Polarización y caracterización de macrófagos derivados de monocitos humanos M1 y M2 en superficies de implantes 

Foreign body reaction (FBR), an immune-mediated complex healing process, plays a crucial role in integrating implants into the body. Macrophages, as the ...

polarization-characterization-m1-m2-human-monocyte-derived

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

En este video, demostramos un procedimiento para inducir la diferenciación y polarización de monocitos derivados de sangre periférica en macrófagos M1 o M2. La incubación con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, lipopolisacárido e interferón-gamma produce macrófagos M1 proinflamatorios, mientras que la incubación con factor estimulante de colonias de macrófagos e interleucina-4 induce la producción de macrófagos M2 antiinflamatorios.

Diferenciación y polarización de células derivadas de monocitos en células similares a macrófagos

El artículo describe una adaptación fácil...

Investigación de la polarización de macrófagos utilizando la médula ósea macrófagos derivados

Macrófagos derivados de monocitos son células importantes del sistema inmune innato. A continuación, describimos un fácil de...

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización

Se presenta un protocolo simple y eficiente para la generación de macrófagos humanos. Buffy abrigos son procesados ​​por doble centrifugación en gradiente de densidad y monocitos aislados se diferencian a continuación, a los macrófagos en bolsas de cultivo de células de teflón. Esto maximiza el rendimiento de los macrófagos y facilita la recolección de células para los experimentos posteriores.

Aislamiento de monocitos humanos por doble centrifugación en gradiente y su diferenciación a macrófagos en Bolsos Cultivo Celular recubiertos de teflón

La reprogramación metabólica es una característica y un requisito previo para la polarización de los macrófagos M1 y M2. Este manuscrito describe un ensayo para la medición de los parámetros fundamentales de la glucólisis y la función mitocondrial en macrófagos derivados de la médula ósea de ratón. Esta herramienta se puede aplicar para investigar cómo factores particulares afectan el metabolismo y el fenotipo del macrófago.

Caracterización metabólica de polarizado M1 y macrófagos derivados de Médula ósea M2 Uso del análisis extracelular Flux en tiempo real

Este protocolo proporciona un método para estudiar la infección por Mycobacterium tuberculosis en macrófagos polarizados M1 o M2 humanos basados en la diferenciación de monocitos de sangre periférica a células similares al macrófago que están infectadas con la cepa virulenta H37Rv etiquetada por GFP, y analizada con citometría de flujo utilizando un panel de 10 colores que incluye la expresión de marcadores M1/M2 seleccionados.

Polarización de células y análisis de células y análisis derivados de monocitos humanos M1 y M2 con citometría de flujo sobre la infección por mycobacterium tuberculosis

Los macrófagos asociados a tumores (TAM) similares a M2 se asocian con progresión tumoral y mal pronóstico en el cáncer. Este protocolo sirve como una guía detallada para diferenciar y polarizar de manera reproducible las células similares a los monocitos THP-1 en macrófagos similares a M2 en un plazo de 14 días. Este modelo es la base para investigar los efectos antiinflamatorios de la TAM dentro del microambiente tumoral.

Diferenciación y polarización de macrófagos en un fenotipo similar a M2 utilizando una línea celular de leucemia THP-1 similar a monocitos humanos

Los monocitos y macrófagos son células inmunitarias muy plásticas y reprogramables cruciales para la salud y la enfermedad. Perciben y responden a una amplia gama de estímulos mediante la adopción de programas de diferenciación y fenotipos específicos. Hemos estandarizado un modelo in vitro para estudiar la polarización y reprogramación de los macrófagos, proporcionando una herramienta valiosa para la investigación.

Modelo de reprogramación de macrófagos derivados de monocitos humanos para ensayos in vitro

Hemos desarrollado mejoras y actualizado métodos para el ensayo monocito-monocapa (MMA) existente, en el que se utilizan macrófagos para ayudar a predecir mejor la relevancia clínica de los aloanticuerpos de glóbulos rojos en medicina transfusional e inmunología. Este ensayo se denomina ensayo de monocitos-macrófagos (M-MA).

Predicción de la importancia de los anticuerpos contra los glóbulos rojos mediante el ensayo de monocitos y macrófagos

Las células dendríticas (DCs) secretan IL-1β en respuesta al reconocimiento TLR8 de purina sintética, R848, seguido por la activación inflamasoma NLRP3 con nigericina, por lo tanto, la IL-1β se puede utilizar para medir la actividad inflamasoma NLRP3. Tinción intracelular de citoquinas, inmunotransferencia, ELISA y se utilizan para medir con precisión NLRP3 inflamasoma el cebado y la activación a través de la expresión de IL-1β.

Activación y Medición de NLRP3 inflamasoma Actividad Usando IL-1β en las células dendríticas derivadas de monocitos humanos

Aprende a polarizar macrófagos M1 y M2 derivados de monocitos humanos en superficies de titanio usando qRT-PCR, ELISA y microscopía confocal. Este protocolo estandarizado mejora el diseño de biomateriales inmunomoduladores.

Polarización y caracterización de macrófagos derivados de monocitos humanos M1 y M2 en superficies de implantes

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