Cuantificación de la respiración mitocondrial en células enteras de levadura

La respiración mitocondrial es un principal generador de energía celular en la mayoría de las circunstancias, y un indicador importante del metabolismo y la aptitud celular. Así, las funciones mitocondriales delinean el estado celular bioenergético. Este protocolo describe una técnica para cuantificar la respiración mitocondrial en células G vivas como parámetro bioenergético.

La técnica descrita en este protocolo nos ayuda a definir el mecanismo bioenergético de algunos polifenoles, como el resveratrol y el coircitano. También sirve como herramienta para medir el metabolismo de las pentosas, también de los PTSPT y explica los cambios bioenergéticos detrás del árbol de la cabina y los efectos del trabajo en el suelo. Nos interesa descifrar cómo las células adquieren algunos fenotipos, como los efectos del árbol de cabina y el trabajo en el suelo, con cambios significativos en la bioenergética celular.

La respiración mitocondrial es una herramienta esencial para dilucidar los mecanismos moleculares detrás de este fenómeno metabólico. Para comenzar, inocule un tubo de ensayo de vidrio de 10 mililitros que contiene tres mililitros de medio YPD con 250 microlitros de células de levadura preservadas en glicerol. Incubar el tubo de ensayo durante la noche a 30 grados centígrados con agitación constante a 200 revoluciones por minuto.

Luego, usando un asa estéril, raye una placa de barrena YPD con las células de levadura cultivadas en el tubo de ensayo de vidrio de 10 mililitros. Incubar la placa de Petri a 30 grados centígrados hasta que aparezcan colonias aisladas. Para preparar un pre-inóculo, inocular tres mililitros de medio YPD al 2%de glucosa con dos o tres colonias de levadura aisladas e incubar.

A continuación, obtenga 100 mililitros de medio sintético estéril completo en un matraz Erlenmeyer de 500 mililitros. Inocular el medio con el cultivo de levadura pre-inóculo durante la noche a una densidad óptica inicial de 0,1 a 600 nanómetros. Agregue el desafío químico como 100 micromolares de resveratrol para probar la respiración mitocondrial.

A continuación, vierta las células de fase logarítmica media en un tubo cónico vacío de 15 mililitros prepesado y centrifugue las células a 4.000 g durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, lave el pellet tres veces con 25 mililitros de agua desionizada. Pesar el tubo cónico que contiene el pellet lavado para obtener el peso húmedo restando el peso del tubo vacío.

A continuación, vuelva a suspender el pellet lavado en dos mililitros de agua desionizada. Para empezar, obtenga las células de levadura tratadas con medicamentos adecuados, como el resveratrol. Coloque cinco mililitros de tampón MES-TEA de 10 milimolares y 50 miligramos de células húmedas en la cámara de injerto polar.

Coloque suavemente el electrodo de oxígeno tipo Clark, asegurándose de que no se formen burbujas. Encienda el monitor YSI 5300A y el ordenador de adquisición de datos. Seleccione el dial de configuración del canal uno para transmitir y ajuste el canal uno al 100% con el dial de calibración del canal uno.

Comience a registrar los datos y comience a medir el tiempo con un cronómetro. Usando una jeringa de cromatografía, agregue el sustrato oxidable hasta una concentración final de 10 milimolares y mantenga la cámara cerrada con agitación constante. A continuación, empleando una jeringa de cromatografía, añadir oligomicina para obtener una concentración final de 0,01 milimolar en la cámara del oxímetro y registrar el porcentaje de consumo de aire.

Del mismo modo, agregue CCCP a una concentración final de 0,015 milimolar en la cámara del oxímetro para determinar la capacidad respiratoria máxima. A continuación, agregue inhibidores de la cadena de transporte de electrones, triflurositona dental y aceitera, o TTFA, a un milimolar, seguido de antimicina A a un miligramo por mililitro. Lave la cámara tres veces cada una con etanol al 70%, seguido de agua desionizada, antes de pasar a la siguiente fuente de carbono.

Para comenzar, realice un ensayo de consumo de oxígeno con células de levadura, utilizando varias fuentes y controles de carbono. Cree un nuevo archivo de proyecto en el software estadístico y elija XY en la sección crear. A continuación, seleccione Intro o importe datos a una nueva tabla en la sección Tabla de datos.

En la sección de opciones, seleccione los números en la subsección X y en la subsección Y. Haga clic en introducir tres valores replicados en subcolumnas una al lado de la otra. Introduzca los datos de tiempo en las columnas X e introduzca los datos de porcentaje de aire en las columnas Y.

Para realizar un análisis de regresión lineal, haga clic en analizar en la barra de menús y, en análisis, seleccione Regresión lineal simple en análisis XY y, a continuación, haga clic en Aceptar. Obtenga el valor de la pendiente de la sección de resultados en las tablas de datos. Copie los valores de pendiente calculados en una hoja de datos.

Reste el valor de pendiente obtenido de los inhibidores respiratorios mezcle la mezcla de los del sustrato oxidable, oligomicina y CCCP para descartar otras fuentes de consumo de oxígeno. Ahora, multiplique los valores de pendiente por 237 micromolares de oxígeno, que representa la solubilidad del oxígeno en esa condición, y tampón. Convierta los valores a micromolares de oxígeno por minuto, ajustándolos según el tiempo trazado.

Divide los resultados entre 50, representando los miligramos de células utilizadas en el experimento. Por último, el consumo de oxígeno se expresa como micromolar de oxígeno por miligramo de células por minuto. Las células cultivadas con glucosa al 0,5% mostraron un consumo de oxígeno significativamente mayor en la respiración basal, la respiración ligada al ATP y la capacidad respiratoria máxima, en comparación con las cultivadas con glucosa al 5%.

La quercetina redujo significativamente la respiración mitocondrial en células cultivadas con 0,5% de glucosa, afectando la respiración basal, ligada al ATP y máxima. Por otro lado, la quercetina no afectó significativamente la respiración mitocondrial en las células, cultivadas en glucosa al 5%.