Name: Cuantificación de la respiración mitocondrial en células enteras de levadura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: Aprende a cuantificar la respiración mitocondrial en células de levadura vivas como indicador bioenergético clave. Este método permite estudiar los efectos de polifenoles como el resveratrol sobre el metabolismo celular.

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<meta charset="utf8"></head><body>Medición de la respiración mitocondrial de la levadura manteniendo el contexto celular

<ol><li>Jang, D. H., Seeger, S. C., Grady, M. E., Shofer, F. S., Eckmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+respiration+within+cells+with+increased+open+pore+cytoskeletal+meshes%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and respiration within cells with increased open pore cytoskeletal meshes.</a> Biol Open. 6 (12), 1831-1839 (2017).</li>
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<li>Matus-Ortega, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+complexes+containing+the+internal+alternative+NADH+dehydrogenase+%28Ndi1%29+in+mitochondria+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">New complexes containing the internal alternative NADH dehydrogenase (Ndi1) in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 32 (10), 629-641 (2015).</li>
<li>Avéret, N., Jobin, M. L., Devin, A., Rigoulet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+pumping+complex+I+increases+growth+yield+in+Candida+utilis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys%22%5BJournal%5D)">Proton pumping complex I increases growth yield in Candida utilis.</a> Biochim Biophys. 1847 (10), 1320-1326 (2015).</li>
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<li>Turina, P., Samoray, D., Gräber, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B%2FATP+ratio+of+proton+transport-coupled+ATP+synthesis+and+hydrolysis+catalysed+by+CF0F1-liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">H+/ATP ratio of proton transport-coupled ATP synthesis and hydrolysis catalysed by CF0F1-liposomes.</a> EMBO J. 22 (3), 418-426 (2003).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells%2C+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Prot%22%5BJournal%5D)">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nat Prot. 7 (6), 1068-1085 (2012).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function%2C+structure%2C+and+intracellular+organization+in+situ+in+cardiomyocytes+and+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal muscles.</a> Int J Mol Sci. 23 (4), 2252(2022).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+the+analysis%2C+standardization+and+interpretation+of+oxygen+consumption+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements.</a> Nat Metab. 4 (8), 978-994 (2022).</li>
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<li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> J Biol Chem. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li>
<li>Rosenfeld, E., Beauvoit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+non-respiratory+pathways+in+the+utilization+of+molecular+oxygen+by+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen by Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).</li>
<li>Granados-Arvizu, J. A., Canizal-García, M., Madrigal-Pérez, L. A., González-Hernández, J. C., Regalado-González, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+alternative+respiration+system+of+Scheffersomyces+stipitis+and+effect+on+glucose+or+xylose+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of alternative respiration system of Scheffersomyces stipitis and effect on glucose or xylose fermentation.</a> FEMS Yeast Res. 21 (2), foab005(2021).</li>
<li>Carrillo-Garmendia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snf1p%2FHxk2p%2FMig1p+pathway+regulates+hexose+transporters+transcript+levels%2C+affecting+the+exponential+growth+and+mitochondrial+respiration+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">Snf1p/Hxk2p/Mig1p pathway regulates hexose transporters transcript levels, affecting the exponential growth and mitochondrial respiration of Saccharomyces cerevisiae.</a> Fungal Genet Biol. 161, 103701(2022).</li>
<li>Maslanka, R., Zadrag-Tecza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+potential+of+yeast+cells+depends+on+overall+action+of+interconnected+changes+in+central+carbon+metabolism%2C+cellular+biosynthetic+capacity%2C+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Reproductive potential of yeast cells depends on overall action of interconnected changes in central carbon metabolism, cellular biosynthetic capacity, and proteostasis.</a> Int J Mol Sci. 21 (19), 7313(2020).</li>
<li>Olivares-Marin, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+carbon+and+nitrogen+sources+depend+on+RIM15+and+determine+fermentative+or+respiratory+growth+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 102 (10), 4535-4548 (2018).</li>
<li>Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiration+is+required+to+provide+amino+acids+during+fermentative+proliferation+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast.</a> EMBO Rep. 21 (11), e50845(2020).</li>
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<li>Madrigal-Perez, L. A., Nava, G. M., Gonzalez-Hernandez, J. C., Ramos-Gomez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+increases+glycolytic+flux+in+Saccharomyces+cerevisiae+via+a+SNF1-dependet+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerr+Biomemb%22%5BJournal%5D)">Resveratrol increases glycolytic flux in Saccharomyces cerevisiae via a SNF1-dependet mechanism.</a> J Bioenerr Biomemb. 47 (4), 331-336 (2015).</li>
<li>Gueguen, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+directly+binds+to+mitochondrial+complex+I+and+increases+oxidative+stress+in+brain+mitochondria+of+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Resveratrol directly binds to mitochondrial complex I and increases oxidative stress in brain mitochondria of aged mice.</a> PloS One. 10 (12), e0144290(2015).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>2-tenoiltrifluoroacetona (TTFA)</td><td>Merck</td><td>T27006</td><td>Inhibidor del complejo II</td></tr><tr><td>3-clorofenilhidrazona, cianuro de carbonilo (CCCP)</td><td>Merck</td><td>C2759</td><td>Desacoplador de la respiración mitocondrial&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol Absolut</td><td>Merck 107017</td><td></td><td>Para disolver quercetina&nbsp;</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Merck</td><td>A1296</td><td>YPD preparación de agar</td></tr><tr><td>Sulfato de amonio granular (NH4)2SO4</td><td>J.T. Baker</td><td>0792-05</td><td>SC preparación de caldo</td></tr><tr><td>Antimicina A (AA)</td><td>Merck</td><td>A8674</td><td>Inhibidor complejo III</td></tr><tr><td>aYSI5300A</td><td>----</td><td>----</td><td>Monitor&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Hermle</td><td>Z 206 A</td><td>Para centrifugación</td></tr><tr><td>de células de oxígeno</td><td>----</td><td>----</td><td>Electrodo tipo Clark&nbsp;</td></tr><tr><td>Computadora</td><td>----</td><td>----</td><td>Para la adquisición de datos&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfato dipotásico K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-05</td><td>SC preparación de caldo</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Merck</td><td>G7021</td><td>YPD preparación de caldo</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>G5516</td><td>Suplementación con sustrato y medio&nbsp;</td></tr><tr><td>Lactato</td><td>Merck</td><td>L1250</td><td>Suplementación con sustrato medio&nbsp;</td></tr><tr><td>Oligomicina de Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Merck</td><td>O4876</td><td>Inhibición de la ATP sintasa mitocondrial</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Thermo Fisher</td><td>SHKE6000</td><td>Incubación de inóculo tubos de vidrio y matraz</td></tr>;<tr><td>Peptona de caseína, digesto enzimático</td><td>Merck</td><td>82303</td><td>YPD preparación de caldo</td></tr><tr><td>Quercetina&nbsp;</td><td>Merck</td><td>337951</td><td>Para disminuir la respiración mitocondrial</td></tr><tr><td>Uracil&nbsp;</td><td>Preparación de caldo</td> <td>Merck</td><td>U0750</td> SC</tr><tr><td>Extracto de levadura Preparación</td> de caldo <td>Merck</td><td>Y1625</td><td>YPD</td></tr><tr><td>Base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos ni sulfato de amonio</td><td>Preparación de caldo</td><td>Merck</td><td>Y1251</td> SC</tr><tr><td>Levadura sintética Suplementos de medio de abandono sin uracilo</td><td>Preparación de caldo</td> <td>Merck</td><td>Y1501</td> SC</tr></tbody></table>

cuantificación de la respiración mitocondrial en células enteras de levadura

Mitochondrial Respiration Quantification in Yeast Whole Cells

Esta técnica de respiración mitocondrial se puede utilizar para otras especies de levaduras distintas a S. cerevisiae, como Scheffersomyces stipitis15 y K. marxianus16. Sin embargo, para fines representativos, solo presentamos resultados de S. cerevisiae. Es bien sabido que S. cerevisiae presenta un metabolismo respiratorio predominante en bajas concentraciones de glucosa (por debajo de 0,8 mM)17,18. Así, para corroborar el fenotipo respiratorio de S. cerevisiae, se cultivó en dos concentraciones de glucosa para estimular (0,5% de glucosa) y limitar (5% de glucosa) la respiración mitocondrial18,19. Como se esperaba, los resultados obtenidos en la respiración basal (sustrato oxidable), la respiración ligada a ATP (oligomicina) y la capacidad respiratoria máxima (CCCP) validan el metabolismo energético característico de S. cerevisiae (Figura 2). Observamos valores más altos de consumo de oxígeno (respiración basal, respiración ligada a ATP y capacidad respiratoria máxima) en las células cultivadas con 0,5% de glucosa en comparación con los valores obtenidos en las células cultivadas con 5% de glucosa (Figura 2).
Además, los ensayos utilizaron tres sustratos: glucosa, glicerol y L-lactato. El objetivo de emplear diversos sustratos es evaluar diferentes partes de la cadena respiratoria mitocondrial. En estas condiciones, la respiración mitocondrial no mostró cambios significativos dependientes del sustrato, ya que no se añadió ningún tratamiento para alterar la cadena respiratoria (Figura 2).
Utilizamos quercetina para evaluar la capacidad de la técnica, un compuesto que influye negativamente en la respiración mitocondrial20. Los datos obtenidos mostraron que la quercetina disminuyó significativamente la respiración mitocondrial en células cultivadas en medios suplementados con glucosa al 0,5% (Figura 3). Por otro lado, las células cultivadas en medios suplementados con glucosa al 5% no presentaron una influencia negativa significativa de la quercetina (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig01.jpg"> 
Figura 1: Curva representativa de consumo de oxígeno. Curva de consumo de oxígeno obtenida en células de S. cerevisiae cultivadas en medio SC (0,5% de glucosa). Los colores representan las diferentes pendientes obtenidas en el sustrato, los desacopladores y la suplementación con inhibidores. Verde: El sustrato utilizó glucosa y respiración basal correspondiente a la pendiente. Azul: oligomicina, inhibidor de la ATP sintasa, pendiente empleada para la determinación de la respiración ligada al ATP. Amarillo: CCCP, desacoplador, pendiente utilizada para evaluar la respiración máxima. Gris y rojo: complejo inhibidor II y III, respectivamente; Pendiente empleada para determinar el consumo de oxígeno no dependiente de las mitocondrias. Abreviaturas: CCCP = cianuro de carbonilo de 3-clorofenilhidrazona; TTFA = 2-tenoiltrifluoroacetona; AA = antimicina A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig02.jpg"> 
Figura 2: Ensayos de consumo de oxígeno en células de S. cerevisiae cultivadas al 0,5% y al 5% de glucosa. La respiración mitocondrial se evalúa a través del consumo de oxígeno medido en la respiración basal, la capacidad respiratoria máxima y la respiración ligada a ATP en células de S. cerevisiae cultivadas en SC suplementadas con 0,5% y 5% de glucosa. Se utilizaron tres sustratos para evaluar su influencia específica en la cadena de transporte de electrones: glucosa (NADH deshidrogenasas), glicerol (pool de ubiquinona) y L-lactato (citocromo c). (A) Respiración basal al 5% y 0,5% de glucosa con glucosa, glicerol y L-lactato como sustratos; (B) respiración máxima al 5% y 0,5% de glucosa con glucosa, glicerol y L-lactato como sustratos; (C) Respiración ligada a ATP al 5% y 0,5% de glucosa con glucosa, glicerol y L-lactato como sustrato. Los resultados se presentan como media ± S.D. de tres experimentos independientes, cada uno de los cuales tiene dos repeticiones técnicas. ANOVA de un factor seguido de la prueba de Tukey (p ≤ 0,05; diferentes letras: diferencia significativa, mismas letras: sin diferencia significativa) para el análisis estadístico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig03_.jpg"> 
Figura 3: Quercetina limitó la respiración mitocondrial en baja concentración de glucosa en células de S. cerevisiae cultivadas. La medición del consumo de oxígeno se realizó a la respiración basal, la capacidad respiratoria máxima y la respiración ligada a ATP en células de S. cerevisiae cultivadas en medio SC (0,5% de glucosa) con quercetina suplementada (100 μM). Se utilizó etanol para disolver la solución de quercetina. Los resultados se presentan como media ± S.D. de tres experimentos independientes, cada uno de los cuales tiene dos repeticiones técnicas. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba t de student pareada (*, ** p ≤ 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig03_large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67186/67186fig04_.jpg"> 
Figura 4: La quercetina no afecta la respiración mitocondrial en alta concentración de glucosa en S. cerevisiae. El consumo de oxígeno se midió a la respiración basal, la capacidad respiratoria máxima y la respiración ligada al ATP en células de S. cerevisiae cultivadas en medio SC (5% de glucosa) con quercetina suplementada (100 μM). El etanol se utiliza para disolver la solución de quercetina. Los resultados muestran la media ± S.D. de tres experimentos independientes, cada uno con dos repeticiones técnicas. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student pareada (p ≤ 0,05; ns: no significativa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67186/67186fig04_large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Cuantificación de la respiración mitocondrial en células enteras de levadura

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to ...

mitochondrial-respiration-quantification-in-yeast-whole-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Se describe el uso de dos, biosensores ratiometric codificados genéticamente, que se basan en la GFP, para vigilar los niveles de ATP estado redox mitocondrial y en la resolución subcelular en células de levadura vivas.

Biosensores radiométricos que miden el estado redox mitocondrial y ATP en las células vivas de levadura

Se describen los métodos de biopsia de músculo vasto lateral, la preparación de las mitocondrias purificada, y perfilado respirométrico. El uso de volumen muscular pequeña hace que esta técnica adecuada para aplicaciones de investigación clínica.

Evaluación de Preparación y respirometría de mitocondrias aisladas de tejido músculo esquelético Obtenidos percutánea Biopsia con aguja

Los métodos presentados proporcionan instrucciones paso a paso para la realización de una colección de ensayos respirométricos basados en microplacas utilizando mitocondrias aisladas de cantidades mínimas de músculo esquelético de ratón. Estos ensayos son capaces de medir los cambios/adaptaciones mecanicistas en el consumo de oxígeno mitocondrial en un modelo animal comúnmente utilizado.

Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias

De alta resolución de respirometría se utiliza para determinar el consumo de oxígeno mitocondrial. Se trata de una técnica sencilla para determinar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial '(I-IV) la frecuencia respiratoria, la capacidad del sistema de transporte de electrones mitocondrial máxima, y ​​la integridad de la membrana mitocondrial externa.

-Alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas

El genoma mitocondrial de levadura de Baker codifica ocho polipéptidos. El objetivo del protocolo actual es etiquetarlos todos ellos y posteriormente visualizarlos como bandas separadas.

Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

En este trabajo, describimos un protocolo modificado para probar el flujo del sustrato respiratorio mitocondrial utilizando perfringolisina O recombinante en combinación con respirometría basada en microplacas. Con este protocolo, mostramos cómo la metformina afecta la respiración mitocondrial de dos líneas celulares tumorales diferentes.

Medición del flujo de sustrato mitocondrial en células perfrendolisaminas o-permeabilizadas recombinantes

La evaluación de la fosforilación oxidativa utilizando respirómetros de alta resolución se ha convertido en una parte integral del análisis funcional de las mitocondrias y el metabolismo energético celular. Aquí, presentamos protocolos para el análisis del metabolismo energético celular utilizando respirómetros de alta resolución basados en cámaras y microplacas y discutimos los beneficios clave de cada dispositivo.

Respirometría de alta resolución para evaluar la bioenergética en células y tejidos utilizando respirómetros basados en cámaras y placas

Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.

Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos

Aquí, describimos un método integral para medir la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras de músculo esquelético permeabilizadas frescas a partir de músculo humano o de ratón. Este método permite la cuantificación en tiempo real de la respiración mitocondrial y la evaluación de la preferencia de combustible y la flexibilidad metabólica, al tiempo que preserva las redes mitocondriales existentes y la integridad de la membrana.

Medición de la respiración mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón mediante respirometría de alta resolución

Este artículo describe un método para evaluar las interacciones y ensamblajes de proteínas integrales de membrana in vitro con varios factores asociados en un entorno proximal de lípidos.

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal In Vitro

Aprende a cuantificar la respiración mitocondrial en células de levadura vivas como indicador bioenergético clave. Este método permite estudiar los efectos de polifenoles como el resveratrol sobre el metabolismo celular.

Cuantificación de la respiración mitocondrial en células enteras de levadura

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