Name: Técnica optimizada y simplificada para la producción y el cultivo de láminas de hígado cortadas con precisión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Aprende a producir y cultivar láminas de hígado cortadas con precisión (PCLS) de ratón usando un vibratome. Este protocolo optimizado mantiene la viabilidad tisular durante al menos cuatro días para estudios metabólicos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo estandarizado para el cultivo de láminas de hígado en entornos básicos de laboratorio

<table><tbody><tr><td>Placa de Petri de 3 cm</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Cualquiera Adecuado para cultivo celular</td></tr><tr><td>Placa de cultivo de 6, 12, 24 pocillos</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Cualquiera Adecuado para cultivo celular</td></tr><tr><td>Cianoacrilato superpegamento</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Gibco</td><td>A24940</td><td></td></tr><tr><td>Eosina</td><td>Merck</td><td>HT110316</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Cualquiera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ThermoFisher</td><td>26400044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Merck</td><td>51275</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>insertos 8um, para placas de 12 pocillos</td><td>Strastedt</td><td>83.3931.800</td><td></td></tr><tr><td>insertos 8um, para placas de 24 pocillos</td><td>Strastedt</td><td>83.3932.800</td><td></td></tr><tr><td>insertos 8um, para placas de 6 pocillos</td><td>Strastedt</td><td>83.3930.800</td><td></td></tr><tr><td>KREBS</td><td>Merck</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr>Campana <td></td><td></td><td>de flujo laminar</td><td>Hepa filtración</td></tr><tr><td>de aire Agarosa de bajo punto de fusión</td><td>Reactivo de</td><td></td> tetrazolio ThermoFisher 16520050 <td></td></tr><tr><td>MTS&nbsp;</td>Lector de placas multipocillo <td>Abcam</td><td>ab197010</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>comprimido de PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí</td><td>Cualquier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pinza quirúrgica</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>con una punta cuadrada plana&nbsp;</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>William' s E medio con GlutaMAX (WME)</td><td>ThermoFisher</td><td>W4125</td><td></td></tr></tbody></table>

técnica optimizada y simplificada para la producción y el cultivo de láminas de hígado cortadas con precisión

Optimized and Simplified Technique for the Production and Culture of Precision-Cut Liver Slices

En la cosecha, la perfusión del animal se omite deliberadamente para garantizar un procesamiento rápido del órgano y evitar daños en el órgano. El hígado se extrae rápidamente después de la incisión y se coloca inmediatamente en un tampón protector de órganos helado, por ejemplo, tampón Krebs24,29. Aunque se ha descrito previamente el corte de tejido hepático fresco sin inclusión1, la inclusión del hígado en agarosa30 de bajo punto de fusión (Figura 1) combinada con un tampón protector de órganos permitirá condiciones de corte óptimas en el vibratomo, reduciendo el daño tisular y aumentando la reproducibilidad en el grosor de la sección. El grosor del tejido es crítico, ya que las secciones delgadas permiten que más capas celulares accedan a los nutrientes y al oxígeno31 y reducen la muerte celular. Sin embargo, las secciones que son demasiado delgadas se vuelven difíciles de cortar de manera homogénea. Por el contrario, las rodajas de más de 400 μm de grosor mostrarán una menor tasa de penetración de nutrientes. Las secciones se incubaron en una interfaz líquido-aire utilizando un inserto (Figura 1) y se incubaron con 5% de CO2 y 21% deO2 a 37 °C en un agitador. Las secciones deben incubarse en un medio de cultivo dentro de las 3 h siguientes a la cosecha, después de lo cual la muerte celular ocurre rápidamente32.
Para determinar la viabilidad de PCLS, se evaluó la viabilidad celular mediante el ensayo de 4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS), que requiere deshidrogenasas dependientes de NAD(P)H, es decir, células metabólicamente activas, para reducir el MTS. Los valores de MTS se han normalizado al peso de corte respectivo. Para optimizar la viabilidad de PCLS, un volumen mínimo de medio de cultivo fue esencial para mantener la viabilidad después de 24 h de incubación. Un volumen de 0,7 mL en placas de 24 pocillos mostró una reducción significativa de la viabilidad mediante el ensayo TMS (p = 0,02) en comparación con 1,5 mL en placas de 12 pocillos y 2,6 mL en placas de 6 pocillos (Figura 2A). Estos volúmenes se eligieron para permitir que las secciones estuvieran ligeramente cubiertas, pero podrían necesitar ajustes según el tipo de plaquitas y placas utilizadas. Al igual que otros33, se utilizan placas de 12 pocillos como el mejor compromiso para una supervivencia óptima dentro de un volumen más pequeño de medio de cultivo.
La agitación es esencial y aumenta la viabilidad de PCLS en un 50% a las 24 h después de la incubación en comparación con un cultivo estático (Figura 2B). La agitación crea una interfaz aire-líquido crítica, optimizada con el uso de transpozos, lo que permite el acceso a nutrientes y oxígeno a ambas caras de la sección. La absorción de oxígeno y nutrientes también se incrementa por el flujo constante creado por el movimiento de agitación, que también pasa a través de la membrana transwell.
El ensayo MTS se evaluó desde 1 h de incubación hasta el día 6 de incubación. La viabilidad celular se mantuvo constante desde el día 0 hasta el día 4 después de la incubación antes de observar una disminución significativa (p = 0,05) en el día 6 (Figura 2C). La morfología de PCLS evaluada por tinción con hematoxilina y eosina (H&amp;E) no mostró cambios en los conductos biliares ni en la arquitectura hasta 5 días después de la incubación (Figura 3A-D). En comparación con el día 0 (Figura 3A), el PCLS no mostró diferencias histológicas en el día 1 (Figura 3B) y el día 2 (Figura 3C) después de la incubación, con hipercromasia nuclear, infiltrado inflamatorio leve, vacuolización a favor de un proceso de muerte celular moderado en el día 5 después de la incubación (Figura 3D). En conjunto, este protocolo de cultivo de PCLS permite la viabilidad durante al menos 4 días, lo que es coherente con los estudios que utilizan cortes en condiciones similares31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema que resume el protocolo para generar PCLS. Esta cifra ha sido modificada de34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig02.jpg"> 
Figura 2: El protocolo optimizado de cultivo de PCLS muestra una viabilidad satisfactoria durante 5 días. (A) Efecto del tamaño del pocillo sobre la proliferación celular (n=3). (B) Efecto del temblor sobre la proliferación celular (n = 6 por condición). (C) Ensayo de proliferación celular MTS a partir de secciones hepáticas de d0 a d6 días de incubación (n = 5 por punto de tiempo). Unidad arbitraria de diámetro exterior, normalizada para cortar el peso fresco. El gráfico muestra la media ± SD. Prueba t de Student de 2 colas no apareada, ns=no significativa, *p&lt;0.05, **p&lt;0.01. Esta cifra ha sido modificada de34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig03.jpg"> 
Figura 3: Resultados histológicos. (A-D) Imágenes representativas de la histología del PCLS hepático después de la tinción con H&amp;E. Barra de escala = 100 μM. Esta cifra ha sido modificada de34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Técnica optimizada y simplificada para la producción y el cultivo de láminas de hígado cortadas con precisión

This protocol presents a simple system for the creation and culture of Precision-cut Liver Slices (PCLS). PCLS contains all cells in an intact environment ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

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