Técnica optimizada y simplificada para la producción y el cultivo de láminas de hígado cortadas con precisión

Los protocolos para producir y cultivar cortes de hígado cortados con precisión, o PCLS, pueden variar drásticamente. El principal inconveniente de los PCLS es su corta vida media, pero aquí demostramos que la producción y el cultivo de PCLS se pueden lograr en condiciones de laboratorio estándar con acceso a Vibratomo al tiempo que garantizamos una vida media de al menos cuatro días. PCLS, un modelo atractivo que llena los vacíos entre los modelos in vitro e in vivo, pero a menudo se descuidan debido a su vida media relativamente corta. Sin embargo, contienen todos los tipos de células y una arquitectura preservada, esencial para la suma metabólica, y por lo tanto se asemejan a un mini modelo de todo el órgano, lo que permite el estudio y tratamiento de tejidos vivos mientras replican sus fenotipos complejos. Los cortes continuos son un proceso muy simple pero técnicamente desafiante. Para facilitar esto, nuestro protocolo se centra en pasos clave, como la orientación del corte y la inclusión del tejido, pero también en la relevancia de un mini volumen de modelo para el cultivo y un sistema dinámico para aumentar su vida media.

[Narrador] Antes de la cosecha, prepare un litro de tampón Krebs-Henseleit, una bandeja de vibratomo desinfectada y enfriada, cuchillas de vibratomo esterilizadas en autoclave y agarosa de bajo punto de fusión al 4%. El día de la cosecha, mantenga la agarosa derretida en un baño de agua a 37 grados centígrados hasta su uso. A continuación, prepare las placas de cultivo agregando 2,6, 1,5 y 0,7 mililitros de medios completos por pocillo en placas de seis, 12 y 24 pocillos respectivamente. Inserte insertos porosos de ocho micrómetros en cada pocillo. Coloque las placas en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono y un 21% de oxígeno. Esterilice todos los instrumentos necesarios para la cosecha utilizando métodos de esterilización apropiados. Rocíe el abdomen del ratón sacrificado con etanol al 70% para desinfectar el área. Con fórceps y tijeras estériles, corte la piel y el peritoneo desde la mitad del abdomen para abrir la cavidad abdominal. Disecciona suavemente el hígado de los órganos o vasos circundantes mientras evitas dañar los lóbulos. Luego, guarde todo el hígado inmediatamente en un tampón Krebs helado. Con pinzas romas y un cuchillo o tijeras afilados y estériles, separe cada lóbulo individualmente para evitar dañar los lóbulos durante la separación. Con un cuchillo afilado y estéril, recorte todos los bordes del lóbulo elegido para crear bordes rectos y manejables para incrustar. A continuación, vierta la agarosa de bajo punto de fusión al 4% en una placa de Petri de tres centímetros colocada sobre hielo húmedo para que se enfríe uniformemente y evite que el lóbulo se hunda. Deje que la agarosa se enfríe durante otros 30 segundos y coloque el lóbulo recortado en el centro de la agarosa, permitiendo que se asiente en el medio del bloque. Luego, corte los bordes exteriores del bloque de agarosa y desaloje el bloque de agarosa del plato. Asegúrese de que la parte superior y la cara pegada a la plataforma del vibratomo sean paralelas al borde superior del lóbulo. Comience configurando el vibrátomo para cortar a un grosor de 250 micrómetros con una velocidad de cinco y una frecuencia de siete hercios. Después de esterilizar el Vibratomo y colocar la bandeja sobre el Vibratome, rodéelo con hielo para mantener el ambiente frío. Coloque las cuchillas en un ángulo hacia abajo de 10 grados desde el plano horizontal. Luego, llene el tanque de Vibratome con un tampón Krebs helado. Aplique una fina capa de pegamento de cianoacrilato sobre la plataforma para prepararla para montar el bloque de agarosa. Luego, seque el borde del bloque de agarosa que se pegará a la plataforma con tejido absorbente estéril. Ahora, coloque el bloque de agarosa en la plataforma extraíble del Vibratome. Coloque el lóbulo del hígado en posición vertical para permitir cortes transversales, lo que reduce la presión sobre el lóbulo y facilita un corte más suave. Espere un minuto a que el pegamento se asiente y sumerja la plataforma en el tanque de vibratome, asegurándose de que el bloque de agarosa esté completamente cubierto con tampón Krebs. Para programar el vibrátomo para cortar, establezca las posiciones de inicio y parada. Luego, comience a cortar las rodajas hasta llegar al lóbulo del hígado. Use una espátula para recoger las rodajas de hígado, ya que esto evita daños, a diferencia de las pinzas o cepillos. Recoja las rodajas en un tampón Krebs helado hasta que estén listas para el cultivo. Con una espátula, transfiera las rodajas de hígado a los pocillos preparados que contienen medios e insertos. Luego, coloque las placas en un agitador orbital ajustado a 130 rpm e incube en una incubadora de cultivo celular convencional a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y 21% de oxígeno.