Caracterización de la transferencia de electrones extracelular mediada en bacterias lácticas con un sistema bioelectroquímico de tres electrodos y dos cámaras

En nuestro laboratorio, investigamos la transferencia extracelular de electrones, o EET, en bacterias como lactiplantibacillus plantarum, que es una bacteria fermentativa crítica en las industrias alimentarias. En EET, la célula transfiere electrones a un cetro electrónico extracelular, como un electrodo en un sistema químico bioeléctrico. Queremos comprender y diseñar EET para aplicaciones en biodetección, biocatálisis y fermentación de alimentos.

Descubrimos que el túnel alpino puede comprar corriente a través de EET en presencia de quinona como el DHNA. Este proceso regenera NAD plus, acelera la pérdida general de las vías de fermentación primarias y estimula el crecimiento celular. Además, encontramos que diversos derivados de la quinona, además del DHNA, también pueden mediar la EET en L. plantarum.

La investigación de la EET mediada requiere configuraciones bioquímicas especializadas. En concreto, utilizamos un sistema bioelectroquímico de tres electrodos y dos cámaras para evitar la comunicación cruzada entre las reacciones anódicas y catódicas. También utilizamos un electrodo de trabajo de campo de carbono que tiene una gran superficie para mejorar la transferencia de electrones de los mediadores de electrones.

Nuestro trabajo explorando las vías de EET en L. plantarum y cómo esas vías interactúan con el metabolismo fermentativo podría tener aplicaciones útiles en las industrias alimentarias. Sabemos que EET y L plantarum alteran el flujo metabólico a través de la fermentación, y eso podría manipularse para aplicaciones útiles y alterar los sabores de los alimentos y producir productos químicos valiosos en la electrofermentación. En el futuro, continuaremos aumentando nuestro conocimiento fundamental de EET y buscaremos nuevas aplicaciones de EET en organismos como L. plantarum.

Planeamos diseñar proteínas en la vía EET, lo que nos permitirá controlar aún más EET para aplicaciones en electrofermentación y biodetección. Para empezar, lije los alambres de titanio de un milímetro de diámetro para trabajar en los contraelectrodos, con papel de lija de óxido de aluminio hasta que estén uniformemente brillantes. Con unos alicates, doble un extremo de cada alambre de electrodo de trabajo en un pequeño gancho.

Deslice un tubo de fieltro de carbono de 16 centímetros cuadrados en cada alambre del electrodo de trabajo, tejiendo el alambre dentro y fuera del fieltro de carbono una vez y tirando del cartucho hacia abajo hasta que quede asegurado en el gancho. Asegure los electrodos de encuentro de trabajo en las tapas GL 45 perforando el tabique de goma con el alambre y tirando de él unos centímetros. Para construir reactores emparejados, ensamble la junta tórica y coloque una membrana de intercambio catiónico precortada, previamente empapada en agua en la junta tórica ensamblada.

Coloque la junta tórica con la membrana entre las grandes aberturas inferiores de dos botellas de reactor emparejadas. Asegure el par de reactores, las botellas y un anillo con la membrana con una abrazadera de nudillo. Coloque una barra agitadora magnética en cada cámara anódica antes de cerrar todas las pequeñas aberturas en la parte superior de cada botella con tapas GL14, equipadas con tabiques de goma.

Llene cada botella del reactor con 110 mililitros de agua desionizada. Inserte las tapas equipadas con un electrodo de trabajo redondo de fieltro de carbono y presione suavemente la parte superior del redondo de fieltro para mantenerlo asegurado en el gancho. Cierre los frascos con el tapón GL45 adecuado y ajustado con electrodo.

Reactores llenos de agua en autoclave y tapas de electrodos GL14. En condiciones estériles, raspe el cultivo de lactoplant abasilisk plantarum de la parte superior de una reserva de glicerol e inocule en tres mililitros de rugosa aguda de demanda comercial, o medio MRS. Incubar el cultivo durante la noche a 37 grados centígrados, sin agitar.

Para empezar, en un gabinete de bioseguridad estéril, deseche el agua esterilizada en autoclave de los reactores del sistema bioelectroquímico. Llene las cámaras catódicas con 110 mililitros de medio M9 esterilizado en autoclave y las cámaras anódicas con 110 mililitros de MCDM recién preparado. Reemplace una tapa GL14 de la cámara anódica por una tapa GL14 de autoclave con un anillo de techo de silicona.

Rocíe los electrodos de referencia preparados con etanol al 70% antes de colocarlos a través de la tapa del electrodo en cada cámara anódica. Apriete todas las tapas y abrazaderas para evitar fugas. Para conectar los reactores al sistema de bomba de agua, primero, coloque cada reactor en la plataforma de barra agitadora adecuada.

Luego conecte los grifos de la camisa de agua de cada reactor al siguiente con tubos de goma, conectando los reactores finales a los tubos de entrada y salida de la bomba de agua. Llene la bomba con agua y agregue de cuatro a seis gotas de acondicionador de agua. Encienda el sistema de bomba y ajuste la temperatura a 30 grados centígrados.

Encienda la bomba y observe el flujo de agua a través de todas las camisas de agua del reactor, confirmando que no hay fugas. Encienda las plataformas de agitación y configúrelas en agitación continua a 220 RPM. Para conectar los reactores a las líneas de gas ahorrador de nitrógeno, primero, conecte un filtro de aire a una aguja de calibre 22 e inserte la aguja a través del tabique superior de una cámara anódica del reactor en el medio.

Inserte una aguja de calibre 18 en el tabique superior de la cámara anódica de un reactor, luego conecte la línea de gas de una fuente de nitrógeno al filtro de aire y abra la válvula para permitir que el gas burbujee suavemente a través del reactor. Para conectar los biorreactores a los cables de potenciostato, conecte el contador de trabajo y los cables de pinza de cocodrilo del electrodo de referencia del potenciostato a sus electrodos correspondientes. Después de ingresar todos los parámetros, presione el triángulo de inicio verde para comenzar la ejecución.

Observe las trazas de voltaje de circuito abierto durante unos minutos para asegurarse de que todos los reactores lean positivamente. y muy cerca con una señal constante. En condiciones estériles, subcultive el cultivo de L. plantarum previamente cultivado de uno a 200 en 50 mililitros de MMRS.

Haga crecer las células durante la noche a 37 grados centígrados, sin agitar. Para comenzar, retire de la incubadora el cultivo de L plantarum cultivado en MMRS. Transfiera el cultivo a un tubo cónico de 50 mililitros en condiciones estériles y coloque el tubo en hielo.

Centrifugar el cultivo a 4.000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet en 50 mililitros de PBS. Después del segundo lavado, vuelva a suspender las células en PBS frío a una densidad óptica de 600 nanómetros de 11.

Cargue dos mililitros de células resuspendidas en una jeringa de tres mililitros, provista de una aguja. En la estación del reactor, destape una jeringa de celda e inserte la aguja en la parte superior de la cámara anódica del reactor. Una vez que todas las jeringas estén en su lugar, presione los émbolos para inyectar las células.

Registre el tiempo de inyección a partir de la traza de cronoamperometría. Deje que la corriente se estabilice en la traza durante dos a cuatro horas. En el sistema bioelectroquímico, etiquete los reactores experimentales como más DHNA y los reactores de control con solventes como menos DHNA.

Destapa una jeringa cargada con 110 microlitros de 20 miligramos por mililitro de DHNA e insértala en la parte superior de la cámara anódica, designada como más DHNA. Inserte una jeringa cargada con 110 microlitros de DMSO en la cámara anódica, designada como menos DHNA. Con una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de calibre 21, extraiga dos mililitros de medio de cada cámara anódica a través del tabique de tapa pequeña no utilizado.

Transfiera las muestras a una placa de 24 pocillos de profundidad para medir el pH durante el punto de tiempo de cero horas. Presione los émbolos de las jeringas de DHNA y DMSO para inyectarlas en los reactores. Registre el tiempo de inyección a partir de la traza de cronoamperometría.

Deseche todas las jeringas y agujas. Después de 24 horas, retire dos mililitros de medio de cada cámara anódica como se describió anteriormente y transfiéralo a una placa de 24 pocillos de profundidad para mediciones de pH de 24 horas. Ejecute la voltamperometría cíclica durante el punto de tiempo de 24 horas.

Mida y registre el pH de las muestras de 24 horas de cada reactor. La densidad de corriente debida a la transferencia extracelular de electrones alcanzó un pico de aproximadamente 132 microamperios por centímetro cuadrado, ocho horas después de la inyección de DHNA. Por el contrario, la inyección de DMSO dio como resultado una densidad de corriente insignificante.

Los datos de voltamperometría cíclica mostraron un aumento distinto de la corriente oxidativa a 50 milivoltios en presencia de L. plantarum con DHNA, en comparación con L. plantarum con DMSO y un aumento del 256% en la densidad de corriente a 300 milivoltios, en comparación con el traza abiótica de DHNA. La transferencia extracelular de electrones resultó en una caída notable en el pH a un promedio de 3.33 durante 24 horas en las muestras con L plantarum y DHNA, mientras que las muestras con L plantarum y DMSO tuvieron un pH promedio de 6.50.