Name: Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprende a visualizar el desenrollado del ADN en tiempo real mediante helicasa CMG de Drosophila melanogaster usando microscopía TIRF. Este protocolo revela la dinámica de la replicación del genoma a nivel de molécula única.

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<meta charset="utf8"></head><body>Desenrollamiento del ADN mediado por CMG observado por el crecimiento del tracto ssDNA-RPA

<ol><li>Bell, S. P., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Duplication+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome Duplication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+MCM2-7+helicase+activation+by+GINS+and+Cdc45%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structural basis for MCM2-7 helicase activation by GINS and Cdc45.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (4), 471-477 (2011).</li>
<li>Jones, M. L., Baris, Y., Taylor, M. R. G., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+human+replisome+shows+the+organisation+and+interactions+of+a+DNA+replication+machine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of a human replisome shows the organisation and interactions of a DNA replication machine.</a> EMBO J. 40 (23), e108819(2021).</li>
<li>Moyer, S. E., Lewis, P. W., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Cdc45%2FMcm2-7%2FGINS+%28CMG%29+complex%2C+a+candidate+for+the+eukaryotic+DNA+replication+fork+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex, a candidate for the eukaryotic DNA replication fork helicase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (27), 10236-10241 (2006).</li>
<li>Douglas, M. E., Ali, F. A., Costa, A., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+CMG+helicase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic CMG helicase activation.</a> Nature. 555 (7695), 265-268 (2018).</li>
<li>Ilves, I., Petojevic, T., Pesavento, J. J., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+MCM2-7+helicase+by+association+with+Cdc45+and+GINS+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of the MCM2-7 helicase by association with Cdc45 and GINS proteins.</a> Mol Cell. 37 (2), 247-258 (2010).</li>
<li>Dewar, J. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+replication+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA replication termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 507-516 (2017).</li>
<li>Burnham, D. R., Kose, H. B., Hoyle, R. B., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+DNA+unwinding+by+the+eukaryotic+replicative+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanism of DNA unwinding by the eukaryotic replicative helicase.</a> Nat Commun. 10 (1), 2159(2019).</li>
<li>Kose, H. B., Larsen, N. B., Duxin, J. P., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+eukaryotic+replicative+helicase+at+lagging-strand+protein+barriers+support+the+steric+exclusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the eukaryotic replicative helicase at lagging-strand protein barriers support the steric exclusion model.</a> Cell Rep. 26 (8), 2113-2125.e6 (2019).</li>
<li>Kose, H. B., Xie, S., Cameron, G., Strycharska, M. S., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+DNA+engagement+and+RPA+oppositely+regulate+the+DNA-unwinding+rate+of+CMG+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Duplex DNA engagement and RPA oppositely regulate the DNA-unwinding rate of CMG helicase.</a> Nat Commun. 11 (1), 3713(2020).</li>
<li>Tanner, N. A., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+DNA+replication+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Visualizing DNA replication at the single-molecule level.</a> Methods Enzymol. 475, 259-278 (2010).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
<li>Baris, Y., Taylor, M. R. G., Aria, V., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+efficient+DNA+replication+with+purified+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fast and efficient DNA replication with purified human proteins.</a> Nature. 606, 204-210 (2022).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77 (1), 17-25.e5 (2020).</li>
<li>Li, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+the+mini-chromosome+maintenance+proteins+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of the mini-chromosome maintenance proteins in DNA replication.</a> Genes. 10 (5), 331(2019).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+replication+origin+melting+nucleated+by+CMG+helicase+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of replication origin melting nucleated by CMG helicase assembly.</a> Nature. 606 (7916), 1007-1014 (2022).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CMG+helicase+bypasses+DNA-protein+cross-links+to+facilitate+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CMG helicase bypasses DNA-protein cross-links to facilitate their repair.</a> Cell. 176 (1-2), 167-181.e21 (2019).</li>
<li>Taylor, M. R. G., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+response+of+a+eukaryotic+replisome+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The initial response of a eukaryotic replisome to DNA damage.</a> Mol Cell. 70 (6), 1067-1080.e12 (2018).</li>
<li>Amunugama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reversal+during+DNA+interstrand+crosslink+repair+requires+CMG+unloading%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Replication fork reversal during DNA interstrand crosslink repair requires CMG unloading.</a> Cell Rep. 23 (12), 3419-3428 (2018).</li>
<li>Wu, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAIP+is+a+master+regulator+of+DNA+interstrand+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRAIP is a master regulator of DNA interstrand crosslink repair.</a> Nature. 567 (7747), 267-272 (2019).</li>
<li>Vrtis, K. B., Dewar, J. M., Chistol, G., Wu, R. A., Graham, T. G. W., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+DNA+breaks+cause+replisome+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-strand DNA breaks cause replisome disassembly.</a> Mol Cell. 81 (6), 1309-1318.e6 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución acrilamida / Bis 40%&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>Agarose UltraPure&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>Usado para preparar Tris Buffer (pH 8)</td></tr><tr><td>&Auml; KTA Pure&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>-</td><td>Usado con el colector de fracciones F9-C; Sistema de purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Gel de afinidad ANTI-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>APS 10%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>ATP (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>ATP-g-s (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11162306001</td><td></td></tr><tr><td>Cobertura de biotina-PEG</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Preparado tal y como se describe: https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.03.033</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-digoxigenina biotinilado &nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik</td><td>N/A</td><td>Masilla adhesiva</td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B/3800/53</td><td></td></tr><tr><td>BSA; 33 mg/mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3858-10G</td><td>Diluido de la culata</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CaptoHiRes Q (5/50)</td><td>Cytiva</td><td>29275878</td><td>Conectado al sistema de purificación de proteínas AKTA; columna de cromatografía de intercambio iónico de alta resolución</td></tr><tr><td>Caseína (5% en agua, 50 mg/mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4765-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Sistema ChemiDoc</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Clips</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tabla de cortar</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubería de diálisis (3,5 kDa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11425859</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigenina-11-dUTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de carga de ADN 6x&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 10 mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de doble cara (0,14 mm de grosor)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluorochem Limited</td><td>M02712-10G</td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDK péptido&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Sintetizado por el STP de biología química del Instituto Francis Crick</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D/0700/68</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-RPA&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Purificado tal y como se desriba en ' 'Análisis de molécula única', Series Methods in Molecular Biology, Vol. 783 (2011), Peterman, E. J. G. y Wuite G. J. L. editores, Humana Press. Información sobre proteínas: 2 mM, humana, expresada en E. coli.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03779-10G</td><td></td></tr><tr><td>Epoxi - 5 minutos</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td></td></tr><tr><td>Fujifilm FLA-5000&nbsp;</td><td>Fujifilm</td><td>&nbsp; FLA-5000&nbsp;</td><td>Analizador de imágenes fluorescentes</td></tr><tr><td>tinción de ácido nucleico GelRed; 10000x</td><td>Cambridge Bioscience</td><td>41003-BT</td><td>Ejemplo de tinción de ácido nucleico que es una alternativa más segura al bromuro de etidio.</td></tr><tr><td>Corredera de vidrio o cuarzo con agujeros para tuberías&nbsp;</td><td>Dremel Modelo 395</td><td></td><td>Corredera de 1 mm de grosor, cortada a 2,4 cm x 1 cm, dos agujeros perforados separados por 1,4 mm. Los agujeros deben perforarse de diferentes tamaños para acomodar diferentes tubos en cada extremo.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>Glicina HCl, pH 3,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Jeringuilla Hamilton, serie 1000 GASTIGHT, bloqueo Luer PTFE 1010TLL, bloqueo Luer PTFE (con ranuras), volumen 10 mL</td><td>Merck</td><td>26211-U</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>I-CeuI</td><td>NEB</td><td>R0699L</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2545</td><td></td></tr><tr><td>Kit de diálisis Maxi GeBaFlex-tube; MWCO 14 kDa&nbsp;</td><td>Generon</td><td>D055</td><td></td></tr><tr><td>Espátula metálica</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas metálicas</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP (filtros de jeringa) 0,22 y micro; M&nbsp;</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Aguja</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Noti-HF</td><td>NEB</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4%&ndash; Geles de proteína bis-tris al 12%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10247002;</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Ejecutando Buffer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Calentador objetivo</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla PCR - 2x</td><td></td><td></td><td>Preparado a partir de la ADN polimerasa Phusion (20 & micro; L), 10 mM dNTPs (40 y micro; L), 5x Phusion HF buffer (400 y micro; L) y agua (540 y micro; L).</td></tr><tr><td>Péptido NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, marcado con LD655-MAL&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>el péptido NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, marcado con LD655-MAL (Lumidyne Technologies) sobre el residuo de cisteína, fue sintetizado y purificado por el sistema de química peptídica STP del Instituto Francis Crick</td></tr><tr><td>Plásmido pGC261</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.053</td></tr><tr><td>Polimerasa de ADN de alta fidelidad Phusion</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de plástico</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE20 (diámetro interior 0,015", diámetro exterior 0,043")</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno PE60 (diámetro interior 0,03", diámetro exterior 0,048")</td><td>Becton Dickinson</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>columnas de Cromatografía Poly-Prep; 10 ml y 20 ml&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>Glutamato de potasio (ácido L-glutámico sal potástica monohidrato)</td><td>Sigma</td><td>G1501-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel inhibidor de proteasas (cOmplete, libre de EDTA)</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Jeringuilla simple Pump 11 Elite Infusión/Retirada Programable</td><td>Aparato de Harvard</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificación QIAquick para PCR</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla de afeitar</td><td>VWR International Ltd</td><td>233-0156</td><td></td></tr><tr><td>Buffer rCutSmart; 10x</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S/2120/53</td><td></td></tr><tr><td>Sortasa (pentamutante)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Purificado basándose en: https://doi.org/10.1073/pnas.1101046108</td></tr><tr><td>filtros de tubos centrifugados Spin-X; 0,22 & micro; acetatos de celulosa de m &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>10310361</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí estéril</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de filtración desechable accionado por vacío Steritop; 0,22 mmm; PES; &nbsp;</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina (1 mg/mL) en 1x buffer PBS</td><td>Sigma</td><td>S4762-10MG</td><td>20 & micro; Comillas L</td></tr><tr><td>SYBR Oro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td>Tinción de ácido nucleico altamente sensible que usamos para visualizar el sustrato de la horquilla de ADN.</td></tr><tr><td>naranja SYTOX; 5 & micro; M en DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Ligasa de ADN T4</td><td>NEB</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN Ligasa Reaction Buffer&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TEV proteasa (1 mg/mL); EZCut&nbsp;</td><td>Biovisión</td><td>7847-10000</td><td></td></tr><tr><td>Trituradoras de tejido, tipo Dounce (40 mL, Wheaton)</td><td>DWK Ciencias de la Vida</td><td>432-1273</td><td></td></tr><tr><td>Base de Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Usado para preparar Tris Buffer (pH 8)</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Preadolescente-20</td><td>Promega UK Ltd</td><td>H5152</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del adn mediante cmg helicase

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

single-molecule-real-time-visualization-dna-unwinding-cmg

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo demuestra un sencillo de una sola molécula de la técnica de microscopía de fluorescencia para la visualización de la replicación del ADN por replisomes individuales en tiempo real.

Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

Se describe un método para observar la replicación en tiempo real de las moléculas individuales de ADN mediada por proteínas del sistema de replicación del bacteriófago.

La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

Informamos de un ensayo híbrido de conjunto y de una sola molécula para obtener imágenes directas y cuantificar el movimiento de la helicasa Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) totalmente reconstituida y marcada con fluorescencia en moléculas de ADN lineales mantenidas en su lugar en una trampa óptica.

Ensayo híbrido de conjunto y molécula única para obtener imágenes del movimiento de la CMG totalmente reconstituida

Este protocolo describe un ensayo de replicación de ADN de una sola molécula basado en microscopía de fluorescencia, que permite la visualización en tiempo real de las interacciones entre las ADN polimerasas y obstáculos como las estructuras G-cuádruples.

Visualización de fluorescencia de una sola molécula de la dinámica de la ADN polimerasa en G-Quadruplex

Este protocolo muestra un ensayo de extensión de flujo simple, robusto y alto rendimiento sola molécula para estudiar la difusión unidimensional de (1D) de moléculas de ADN.

Una sola molécula Simple, robusto y alto rendimiento flujo estiramiento aplicación de análisis para el estudio de transporte de moléculas a lo largo de la DNA

Los experimentos de electroforesis en gel de placas tradicionales (SGE) requieren un aparato complicado y un alto consumo de productos químicos. Este trabajo presenta un protocolo que describe un método de bajo costo para separar los fragmentos de ADN dentro de un corto período de tiempo.

Seguimiento en tiempo real de la separación de fragmentos de ADN por Smartphone

Una plataforma de una sola molécula magnética Pinzas para manipular G-quadruplexes se divulga, que permite el estudio de estabilidad de G4 y regulación por diversas proteínas.

Manipulación de una sola molécula de G-quadruplexes por pinzas magnéticas

Este protocolo describe la inmovilización covalente de las proteínas con un agente de acoplamiento de silano heterobifunctional a superficies de óxido de silicio diseñado para la espectroscopia de fuerza de fuerza atómica microscopio basado sola molécula que es ejemplificada por el interacción de RrgA (adhesina de pilus-1 punta de S. pneumoniae) con fibronectina.

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

Se desarrollaron fluorescencia resonancia energética basada en la transferencia en tiempo real observación sistemas de la DNA del filamento reacción de intercambio mediada por Rad51. Utilizando los protocolos aquí presentados, que son capaces de detectar la formación de intermedios de reacción y su conversión en productos, mientras que analizar también la cinética enzimática de la reacción.

Observación en tiempo real de la reacción de intercambio de filamento de ADN mediada por Rad51

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la homogeneidad de etiquetado para cada especie de proteína en una muestra de proteína compleja en el nivel de molécula única.

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Aprende a visualizar el desenrollado del ADN en tiempo real mediante helicasa CMG de Drosophila melanogaster usando microscopía TIRF. Este protocolo revela la dinámica de la replicación del genoma a nivel de molécula única.

Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase

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