Name: Determinación de la estabilidad sérica de la enzima adenosina desaminasa 1 humana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: Aprende a evaluar la estabilidad sérica de enzimas para mejorar la eficacia terapéutica en cáncer usando biológicos proteicos. Este método guía futuras estrategias de ingeniería de proteínas.

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1. Incubación del suero
<ol><li>Prepare un stock de 10x HsADA1 en 1x PBS pH 7.4 (1x PBS) a una concentración final de 10 μM. Descongele una alícuota de 15 mL de suero humano agrupado y precaliéntelo a 37 °C. Precalentar una alícuota de 50 mL de 1x PBS a 37 °C.</li>
	<li>Prepare las mezclas de incubación enzima-suero añadiendo 100 μL de la cepa 10x HsADA1 a 900 μL de suero humano agrupado en un tubo de microcentrífuga de baja unión, denominado mezcla de enzima + suero. En un tubo de microcentrífuga de baja unión separado, agregue 100 μL de la culata 10x HsADA1 a 900 μL de 1x PBS para compararlo con un control sin suero, denominado mezcla de enzima + 1x PBS. La concentración final de HsADA1 en cada mezcla será de 1 μM.</li>
	<li>Prepare un control adicional en un tubo de microcentrífuga de baja unión que consta de 100 μL de 1x PBS mezclado con 900 μL de suero humano combinado. Esto servirá como control no enzimático para la mezcla de enzima + suero. Además, realice un control que conste de 1 mL de 1x PBS. Esto servirá como control no enzimático para la mezcla de enzima + 1x PBS.</li>
	<li>Aliquotar 100 μL de cada mezcla del paso 1.2 en tubos separados de baja adherencia y diluir 1:1 con 100 μL de glicerol al 30% (v/v) en 1x PBS. Congele rápidamente con nitrógeno líquido y almacene a -80 °C. Estas muestras serán el punto de tiempo del Día 0, y la concentración de HsADA1 en ellas será de 500 nM. Repita este paso para las mezclas de control no enzimáticas de 1.3. Selle todas las enzimas y mezclas de control con una película transparente y colóquelas en una incubadora a 37 °C.</li>
	<li>Después de 24 h, alícuota 100 μL de cada muestra incubada y diluir 1:1 con 100 μL de glicerol al 30% (v/v) en 1x PBS. Congele rápidamente con nitrógeno líquido y almacene a -80 °C. Estas muestras serán el punto de tiempo del Día 1. Regrese todas las mezclas de enzimas y controles a la incubadora a 37 °C. Repita este paso a las 72 h y a las 120 h. NOTA: No es necesario que las muestras alícuotas se congelen rápidamente. Alternativamente, el usuario puede realizar el ensayo basado en microplacas inmediatamente después de tomar cada muestra, aunque se deben preparar curvas estándar frescas y existencias de sustrato de adenosina cada vez que se analiza una muestra.</li>
</ol>2. Ensayo basado en microplacas
<ol><li>Prepare el lector de microplacas configurando un protocolo de lectura cinética (Figura 2) para medir la absorbancia a 260 nm con el intervalo de lectura más corto durante 30 minutos y precalentar el lector a un punto de ajuste de 37 °C.</li>
	<li>Descongele todas las muestras recolectadas en hielo. Diluir cada muestra descongelada 1:10 utilizando 1x PBS precalentado a 37 °C como diluyente en tubos de microcentrífuga de baja fijación. La nueva concentración de HsADA1 en estas muestras será de 50 nM.</li>
	<li>Realice también una dilución 10x en 1x PBS a partir de la muestra de control de suero no enzimático. Además, prepare un caldo de adenosina de 5 mM añadiendo 66,8 mg de adenosina a 50 mL de PBS 1x. Prepare una dilución de 250 μM de adenosina añadiendo 400 μL de caldo de adenosina a 7.600 μL de 1x PBS y precaliéntelo a 37 °C en una incubadora.</li>
	<li>A una microplaca de 96 pocillos compatible con rayos UV, agregue 160 μL de la dilución de adenosina de 250 μM y 40 μL de cada muestra de proteína diluida por triplicado para un volumen total de 200 μL. Esto producirá una concentración final de adenosina de 200 μM y una concentración final de enzima de 10 nM.</li>
	<li>Repita la dilución para las muestras de control añadiendo 40 μL del suero diluido o 1x controles de PBS y 160 μL de la dilución de adenosina de 250 μM por triplicado. Esto también producirá una concentración final de adenosina de 200 μM pero sin enzima. NOTA: Puede ser beneficioso agregar primero todas las muestras de enzima y control diluidas individualmente a la microplaca y luego agregar el sustrato de adenosina con una micropipeta de 12 canales para reducir el tiempo de carga total. Además, en este paso se deben utilizar placas transparentes a los rayos UV para evitar que la propia placa confunda la señal de absorbancia medida.</li>
	<li>Mida la absorbancia de cada pocillo a 260 nm durante 30 min a 37 °C. Una vez hecho esto, exporte los datos a una hoja de cálculo para su posterior análisis.</li>
</ol>3. Análisis de los datos del lector de microplacas
<ol><li>Determine la pendiente de la región lineal de los datos de absorbancia en función del tiempo durante los primeros minutos de los datos de la microplaca. Para las muestras diluidas en suero, esto correspondió a los primeros ~120 s. Para las muestras diluidas con PBS 1x, esto correspondió a los primeros ~270 s. Esta pendiente de valores de absorbancia decrecientes tendrá un valor numérico negativo y tendrá unidades de cambio en unidades de absorbancia por segundo (ΔA260/s).</li>
	<li>Reste la pendiente del control negativo que consiste en suero humano agrupado de la pendiente de los datos de enzima + suero. Realice la misma operación en las mezclas de enzima + 1x PBS restando la pendiente del control 1x PBS.</li>
	<li>Normalice todas las pendientes ajustadas a la pendiente original a t=0 h para obtener la fracción de actividad restante utilizando la Ecuación 1. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67216/67216eq01.jpg" style="margin: auto;">Ecuación 1</li>
	<li>Representa la fracción de actividad restante en función del tiempo.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación de la estabilidad sérica de HsADA1: un enfoque basado en microplacas

<ol><li>Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-stable+RNA+aptamer+specific+for+SARS-COV-2+neutralizes+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A serum-stable RNA aptamer specific for SARS-COV-2 neutralizes viral entry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (50), e2112942118(2021).</li>
<li>Iannuzo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+synthetic+peptides+with+antibacterial+activity+against+mycobacterium+abscessus+and+serum+stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies synthetic peptides with antibacterial activity against mycobacterium abscessus and serum stability.</a> ACS Omega. 7 (27), 23967-23977 (2022).</li>
<li>Ma, M. T., Jennings, M. R., Blazeck, J., Lieberman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytically+active+holo+homo+sapiens+adenosine+deaminase+i+adopts+a+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallograph+Sect+D%22%5BJournal%5D)">Catalytically active holo homo sapiens adenosine deaminase i adopts a closed conformation.</a> Acta Crystallograph Sect D. 78 (1), 91-103 (2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+4+nucleosides+via+one+reference+compound+in+chinese+cordyceps+by+hplc-uv+at+equal+absorption+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Prod+Comm%22%5BJournal%5D)">Determination of 4 nucleosides via one reference compound in chinese cordyceps by hplc-uv at equal absorption wavelength.</a> Natural Prod Comm. 18 (3), 1934578X231161410(2023).</li>
<li>Whitmore, K. V., Gaspar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+deaminase+deficiency+-+more+than+just+an+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adenosine deaminase deficiency - more than just an immunodeficiency.</a> Front Immunol. 7, 314(2016).</li>
<li>Jennings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+expression+and+purification+of+a+human+adenosine+deaminase+in+E.+coli+and+characterization+of+its+asp8asn+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Prot+Express+Purificat%22%5BJournal%5D)">Optimized expression and purification of a human adenosine deaminase in E. coli and characterization of its asp8asn variant.</a> Prot Express Purificat. 213, 106362(2024).</li>
<li>Blazeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bypassing+evolutionary+dead+ends+and+switching+the+rate-limiting+step+of+a+human+immunotherapeutic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Catalysis%22%5BJournal%5D)">Bypassing evolutionary dead ends and switching the rate-limiting step of a human immunotherapeutic enzyme.</a> Nat Catalysis. 5 (10), 952-967 (2022).</li>
<li>Lu, J., Grenache, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid%2C+microplate-based+kinetic+assay+for+measuring+adenosine+deaminase+activity+in+body+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid, microplate-based kinetic assay for measuring adenosine deaminase activity in body fluids.</a> Clinica Chimica Acta. 413 (19), 1637-1640 (2012).</li>
<li>Maciel, L. G., Dos Anjos, J. V., Soares, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+low-cost+evaluation+of+hydroxykynurenine+activity%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Fast and low-cost evaluation of hydroxykynurenine activity.</a> MethodsX. 7, 100982(2020).</li>
<li>Bokman, A. H., Schweigert, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-hydroxyanthranilic+acid+metabolism.+Iv.+Spectrophotometric+evidence+for+the+formation+of+an+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">3-hydroxyanthranilic acid metabolism. Iv. Spectrophotometric evidence for the formation of an intermediate.</a> Arch Biochem Biophys. 33 (2), 270-276 (1951).</li>
<li>Tanford, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanford%2C+C+%22Advances+in+protein+chemistry%22">Advances in protein chemistry</a>. 23, Academic Press. 121-282 (1968).</li>
<li>Tritsch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+the+continuous+spectrophotometric+assay+of+kalckar+for+adenosine+deaminase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validity of the continuous spectrophotometric assay of kalckar for adenosine deaminase activity.</a> Anal Biochem. 129 (1), 207-209 (1983).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catalytic+site+structural+gate+of+adenosine+deaminase+allosterically+modulates+ligand+binding+to+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The catalytic site structural gate of adenosine deaminase allosterically modulates ligand binding to adenosine receptors.</a> FASEB J. 27 (3), 1048-1061 (2013).</li>
<li>Kalckar, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+spectrophotometry+of+purine+compounds+by+means+of+specific+enzymes%3A+Iii.+Studies+of+the+enzymes+of+purine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes: Iii. Studies of the enzymes of purine metabolism.</a> J Bio Chem. 167 (2), 461-475 (1947).</li>
<li>Hartwick, R., Jeffries, A., Krstulovic, A., Brown, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+assay+for+adenosine+deaminase+using+reverse+phase+high+pressure+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatographic+Sci%22%5BJournal%5D)">An optimized assay for adenosine deaminase using reverse phase high pressure liquid chromatography.</a> J Chromatographic Sci. 16 (9), 427-435 (1978).</li>
<li>Paul, M. K., Grover, V., Mukhopadhyay, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merits+of+hplc-based+method+over+spectrophotometric+method+for+assessing+the+kinetics+and+inhibition+of+mammalian+adenosine+deaminase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Merits of hplc-based method over spectrophotometric method for assessing the kinetics and inhibition of mammalian adenosine deaminase.</a> J Chromatography B. 822 (1), 146-153 (2005).</li>
<li>Ubbink, J. B., Vermaak, W. J. H., Bissbort, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+assay+of+human+lymphocyte+kynureninase+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%3A+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic assay of human lymphocyte kynureninase activity levels.</a> J Chromatography B: Biomed Sci Appl. 566 (2), 369-375 (1991).</li>
<li>Tsentalovich, Y. P., Snytnikova, O. A., Forbes, M. D. E., Chernyak, E. I., Morozov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+and+thermal+reactivity+of+kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Photochemical and thermal reactivity of kynurenine.</a> Exp Eye Res. 83 (6), 1439-1445 (2006).</li>
<li>Demain, A. L., Vaishnav, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+microbes+and+higher+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms.</a> Biotechnol Adv. 27 (3), 297-306 (2009).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Faber, M. S., Whitehead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-driven+engineering+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Data-driven engineering of protein therapeutics.</a> Curr Opin Biotechnol. 60, 104-110 (2019).</li>
<li>Das, S., Zhao, L., Elofson, K., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+stabilization+by+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme stabilization by virus-like particles.</a> Biochemistry. 59 (31), 2870-2881 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Adenosina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9251-25G</td><td>25 g</td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT Lector</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>microplacas Eppendorf LoBind Tubos de microcentrífuga: Proteína&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>13-698-795</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>de glicerol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>G33-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>HsKYNase66-W102H-T333N</td><td>Suero humano interno</td><td></td><td></td></tr><tr>, <td>MP Biomedicals</td><td>agrupado</td><td>92931149</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>de hidroxi-quinurenina</td><td>Cayman Chemicals</td><td>27778</td><td></td></tr><tr><td>Inosina&nbsp;</td><td>TCI</td><td>I0037</td><td>25 g</td></tr><tr><td>PBS, 1x&nbsp; pH 7.4+/- 0.1</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal 5-fosfato monohidratado, 99%&nbsp;</td><td>Thermo Scientifc</td><td>228170010</td><td>1 g</td></tr><tr><td>MICROPLACA UV-STAR, 96 POCILLOS, COC, F-BOTTOM</td><td>Greiner Bio</td><td>&nbsp; </td><td></td>655801</tr><tr><td>Adenosina desaminasa humana de tipo salvaje 1</td><td>en casa</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determinación de la estabilidad sérica de la enzima adenosina desaminasa 1 humana

Determining the Serum Stability of Human Adenosine Deaminase 1 Enzyme

Las figuras muestran los resultados de la ejecución del ensayo cuando se realizó con HsADA1 de tipo salvaje. La figura 3A, B ilustra las curvas de disminución de la absorbancia a 260 nm de las muestras que se originan a partir de las mezclas 1x de PBS/suero-enzima para HsADA1 de tipo salvaje después de la adición de adenosina. Esta disminución de la absorbancia en función de los datos de tiempo es lo que el usuario puede esperar al completar con éxito el ensayo basado en microplacas y es similar a los datos de absorbancia que surgirían después de agregar cantidades suficientes de HsADA1 funcional a la adenosina. La figura 3C, D ilustra las curvas de absorbancia de los controles negativos probados, que no contienen enzima después de la adición de adenosina. En comparación con las muestras de enzimas reales, el cambio de absorbancia de estos controles negativos es casi insignificante. En la Figura 3, se puede ver que las pendientes de las curvas enzimáticas cambian en función del tiempo de incubación. Por ejemplo, la pendiente del punto de tiempo del Día 0 es drásticamente más pronunciada que el punto de tiempo del Día 5.
La Figura 4 ilustra la fracción de actividad retenida por el HsADA1 de tipo salvaje en función del tiempo cuando se incuba en 1x PBS o en suero humano combinado a 37 °C. Específicamente, las pendientes de todas las curvas de disminución de absorbancia en la Figura 3A, B se normalizan a las pendientes del Día 0 de sus respectivos grupos. Como se puede ver en la Figura 4, existe una divergencia en la actividad retenida para el HsADA1 de tipo salvaje en 1x PBS frente al suero humano combinado. Específicamente, la enzima pierde su actividad más rápido en el suero humano agrupado, y la enzima conserva aproximadamente el 10% de su actividad original en el día 5. Todavía se puede detectar una pérdida de actividad cuando HsADA1 se incuba en 1x PBS, aunque la enzima conserva aproximadamente el 75% de su actividad. Esto es congruente con los resultados de Jennings et al., que también reportan una disminución de la actividad después de la incubación con suero a 37 °C en casi un 40% después de 48 h6. Lu et al. también han demostrado que la actividad de HsADA1 disminuye en los fluidos corporales pleurales, peritoneales y cefalorraquídeos a temperatura ambiente (25 °C)8.
Para demostrar la flexibilidad de este protocolo, lo utilizamos para probar la estabilidad sérica de otra enzima de origen humano, una variante modificada de la quinureninasa humana anteriormente denominada HsKYNase66-W102H-T333N7. HsKYNase66_W102H-T333N cataliza eficientemente la conversión de OH-Kyn en OH-AA, similar a la enzima HsKYNasa de tipo salvaje, aunque en realidad es un mutante de reversión de dos aminoácidos de una variante de quinureninasa humana modificada con especificidad de sustrato alterada, es decir, que degrada eficientemente la quinurenina en ácido antranílico7. OH-Kyn absorbe fuertemente a 379 nm, mientras que OH-AA no lo hace, lo que resulta en una disminución de absorbancia medible tras la adición de nuestra variante de HsKYNasa diseñada a OH-kyn 9,10. La figura 5A,B ilustra las curvas de disminución de absorbancia a 379 nm de las muestras que se originan a partir de las mezclas 1x de PBS/suero-enzima para HsKYNasa después de la adición de OH-Kyn. La Figura 5C,D ilustra las curvas de absorbancia de los controles probados que no contienen enzimas. Como se ha visto con HsADA1, hay una clara diferencia en las pendientes de las curvas de absorbancia entre las muestras. Esto es especialmente evidente en la Figura 5A, ya que la pendiente de los puntos de tiempo de 0 h es mucho más pronunciada que los puntos de tiempo de 3 h y 24 h. La Figura 6 ilustra la fracción correspondiente de actividad retenida para la HsKYNasa probada en función del tiempo. Al igual que HsADA1, HsKYNase66-W102H-T333N pierde actividad en el suero más rápidamente que en PBS (~85% de actividad perdida frente a ~40% en el transcurso de 24 h). Si bien la estabilidad sérica de esta variante enzimática no se ha probado previamente, sigue la tendencia general que otras variantes de HsKYNasa, que también perdieron la mayor parte de su actividad dentro de las 24 h en suero a 37 °C7. 
En términos generales, las enzimas pueden perder actividad con el tiempo debido a una serie de factores, como el pH, la concentración de sal, la temperatura, etc. Por lo tanto, un resultado que no siga esta tendencia podría considerarse anormal. Por ejemplo, si la actividad enzimática aumenta drásticamente con el tiempo, esto podría indicar que los resultados no son válidos. Esto es asumiendo que las condiciones de las enzimas no cambian, y estamos hablando estrictamente en un sentido de tiempo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig01.jpg"> Figura 1: Diagrama de flujo que detalla los pasos del protocolo para HsADA1. La figura muestra los pasos seguidos en este protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig02.jpg"> Figura 2: Configuración de lectura cinética del lector de microplacas. Se creó un protocolo de lectura cinética para medir la absorbancia a 260 nm durante 30 min a 37 °C con el intervalo mínimo. La figura muestra la configuración elegida para configurar este protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig03.jpg"> Figura 3: Curvas de absorbancia frente al tiempo para HsADA1 después de la adición de 200 μM de adenosina. (A) Curvas de absorbancia frente al tiempo para HsADA1 incubado en suero después de la adición de 200 μM de adenosina. (B) 1x HsADA1 incubado con PBS. (C) Control sérico negativo. (D) 1x control negativo PBS (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig04.jpg"> Figura 4: Retención de la actividad HsADA1. La actividad se evalúa en 1x PBS frente a suero humano combinado a 37 °C. Se determinó la fracción de actividad original retenida para HsADA1 incubado en 1x PBS frente a suero humano combinado en el transcurso de 5 días (bares = media ± DE, n = 3). Se utilizó una prueba t no apareada de dos colas *p&lt;0.05, **p &lt; 0.01 y ***p &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig05.jpg"> Figura 5: Curvas de absorbancia frente al tiempo para HsKYNase66-W102H-T333N después de la adición de 400 μM de OH-Kyn. (A) Curvas de absorbancia frente al tiempo para la HsKYNasa incubada en suero después de la adición de 400 μM de OH-Kyn. (B) 1x HsKYNasa incubada con PBS. (C) Control sérico negativo. (D) 1x control negativo PBS (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig06.jpg"> Figura 6: Retención de la actividad de HsKYNase66-W102H-T333N. La actividad se evalúa en 1x PBS frente a suero humano combinado a 37 °C. Se determinó la fracción de actividad original retenida para HsKYNase66-W102H-T333N incubada en 1x PBS frente a suero humano combinado en el transcurso de 24 h (barras = media ± DE, n = 3). Se utilizó una prueba t no apareada de dos colas; p &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Curva estándar de adenosina e inosina. El gráfico se dibujó para 0-200 μM. Se añadió adenosina o inosina a 1x PBS a las concentraciones observadas, y luego se midió la absorbancia a 260 nm. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Curva estándar de OH-Kyn. El gráfico se dibujó para 0-400 μM. Se añadió OH-Kyn a 1x PBS a las concentraciones observadas, y luego se midió la absorbancia a 379 nm. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria 3: Curvas de absorbancia frente al tiempo a 260 nm con concentraciones crecientes de HsADA1 después de la adición de 200 μM de adenosina. (A) Curvas de reacción para concentraciones variables de HsADA1. (B) Cambio de pliegue en la pendiente de la región lineal de las curvas de absorbancia en relación con un control PBS 1x (barras = media ± SD, n = 3). Se utilizó una prueba t no apareada de dos colas: **p &lt; 0.01 y ****p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%203.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 4: Curvas de absorbancia frente al tiempo a 379 nm con concentraciones crecientes de HsKYNasa modificada después de la adición de 400 μM de OH-Kyn. (A) Curvas de reacción para concentraciones variables de HsKYNasa modificada. (B) Cambio de pliegue en la pendiente de la región lineal de las curvas de absorbancia en relación con un control PBS 1x (barras = media ± SD, n = 3). Se utilizó la prueba t no apareada de dos colas ****p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%204.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 5: Curvas de absorbancia frente al tiempo a 379 nm utilizando enzima desactivada por calor en 400 μM de OH-Kyn. Se añadió la enzima HsKYNasa desactivada por calor a 400 μM de OH-Kyn en 1x PBS, y luego se midió la absorbancia a 379 nm. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%205.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Determinación de la estabilidad sérica de la enzima adenosina desaminasa 1 humana

The concept of enzyme stability is typically used to refer to an enzyme's thermostability - its ability to retain structure and activity as temperature ...

determining-the-serum-stability-of-human-adenosine-deaminase-1-enzyme

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un método para la determinación de la actividad quinasa de acetato se describe. Este ensayo utiliza una reacción directa para determinar la actividad enzimática y la cinética de la cinasa de acetato en la dirección de acetato de formación con diferentes aceptores fosforilo. Además, este método puede ser utilizado para el ensayo de fosfato de otros o acetil de acetil-CoA utilizando enzimas.

La detección directa de la actividad de acetato de formación de la enzima cinasa de acetato

En este artículo se describe el procedimiento para la síntesis de una enzima modificada hidrófobamente membrana Nafion inmovilización y cómo inmovilizar las proteínas y / o enzimas dentro de la membrana y probar su actividad específica.

Hidrófobo sal modificada Nafion para inmovilización de enzimas y Estabilización

Este video explica un método cuantitativo de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) para medir el metabolismo de la adenosina y las purinas asociadas generadas por el consumo de AMP en el entorno extracelular de las células de cáncer leucémico. El protocolo describe un ensayo RP-HPLC sensible, específico, fiable y reproducible desarrollado y validado para la cuantificación de nucleótidos y nucleósidos de purina extracelular producidos por células de leucemia...

Metabolismo extracelular de las purinas: un ensayo basado en HPLC para medir la generación y el metabolismo de adenosina en células leucémicas

Radical basado en la química biomimética ha sido aplicada a bibliotecas de hasta edificio-necesarias para el desarrollo de biomarcadores.

Radicales Libres en Biología Química: del comportamiento químico al desarrollo de biomarcadores

PAD4 es una enzima responsable de la conversión de peptidil-arginina en peptidil-citrulina. La desregulación de la PAD4 se ha implicado en una serie de enfermedades humanas. Se describe un ensayo PAD4 basado en fluorescencia fácil y compatible con alto rendimiento.

Monitoreo basado en la fluorescencia de PAD4 actividad a través de un sustrato Analog Pro-fluorescencia

El protocolo descrito aquí representa un método fácil y reproducible que emplea cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) para medir el metabolismo de las purinas en células de leucemia linfocítica crónica (LLC) cultivadas en diferentes condiciones.

Ensayo basado en HPLC para supervisar extracelular de nucleótidos / nucleósidos de metabolismo en las células de la leucemia crónica humana linfocítica

La estabilidad térmica de la actividad enzimática se mide fácilmente por calorimetría isoterma de titulación (ITC). Ensayos de estabilidad de la proteína la mayoría actualmente utilizan medir proteína despliegue, pero no proporcionan información sobre la actividad enzimática. CCI permite la determinación directa del efecto de las modificaciones de la enzima sobre la estabilidad de la actividad enzimática.

Medir estabilidad enzimática por calorimetría isoterma de titulación

Un ensayo ATPase acoplado a la nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) se ha adaptado al cribado de rendimiento semialto de inhibidores de la miosina de moléculas pequeñas. Este ensayo cinético se ejecuta en un formato de microplaca de 384 pocillos con volúmenes de reacción totales de sólo 20 s por poca. La plataforma debe ser aplicable a prácticamente cualquier enzima productora de ADP.

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

La oxidación fotoquímica rápida de proteínas es una técnica emergente para la caracterización estructural de proteínas. Diferentes aditivos solventes y ligandos tienen variadas propiedades de barrido hidroxilo radical. Para comparar la estructura proteica en diferentes condiciones, se requiere una compensación en tiempo real de los radicales hidroxilo generados en la reacción para normalizar las condiciones de reacción.

Habilitación de la compensación en tiempo real en oxidaciones fotoquímicas rápidas de proteínas para la determinación de los cambios en la topografía proteica

Este protocolo describe un método colorimétrico para evaluar de forma fiable la influencia de los compuestos químicos en la actividad de la Deiodinasa 1 (DIO1) en microsomas hepáticos humanos utilizando la reacción de Sandell-Kolthoff. Incluye criterios de aceptación predefinidos y métricas estadísticas de desempeño, y apoya los esfuerzos continuos para la inclusión en las directrices de pruebas de la OCDE.

Evaluación colorimétrica de la actividad de la deiodinasa 1 en microsomas hepáticos humanos utilizando la reacción de Sandell-Kolthoff

Aprende a evaluar la estabilidad sérica de enzimas para mejorar la eficacia terapéutica en cáncer usando biológicos proteicos. Este método guía futuras estrategias de ingeniería de proteínas.

Determinación de la estabilidad sérica de la enzima adenosina desaminasa 1 humana

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