Name: Cuantificación de los fenotipos oculares de Drosophila melanogaster : un enfoque computacional que integra ilastik y flynotyper (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Aprende a cuantificar fenotipos oculares en Drosophila melanogaster usando ilastik y Flynotyper. Este método computacional reduce el sesgo de la clasificación manual y mejora la precisión en modelos de enfermedades neurodegenerativas.

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<meta charset="utf8"></head><body>Cuantificación imparcial de omatidios en modelos oculares de Drosophila

<ol><li>Iyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+eye+phenotypes+for+functional+genetic+studies+using+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster.</a> G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).</li>
<li>Thomas, B. J., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fly%27s+eye+view+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A fly's eye view of biology.</a> Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).</li>
<li>Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye disc.</a> Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).</li>
<li>Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+representation+of+loss+of+eye+regularity+in+a+Drosophila+neurodegenerative+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model.</a> Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).</li>
<li>Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+in+Drosophila+reveals+the+conserved+role+of+REEP1+in+promoting+stress+resistance+and+preventing+the+formation+of+Tau+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates.</a> Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).</li>
<li>Pandey, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+rescues+neurodegeneration+and+provides+an+essential+link+between+autophagy+and+the+UPS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS.</a> Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).</li>
<li>Outa, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Drosophila+model+of+wild-type+and+T315I+mutated+BCR-ABL1+in+chronic+myeloid+leukemia%3A+an+effective+platform+for+treatment+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening.</a> Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).</li>
<li>Shirinian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+Drosophila+melanogaster+model+to+study+human+T-lymphotropic+virus+oncoprotein+Tax-1-driven+transformation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A transgenic Drosophila melanogaster model to study human T-lymphotropic virus oncoprotein Tax-1-driven transformation in vivo.</a> J Virol. 89 (15), 8092-8095 (2015).</li>
<li>Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+image+analysis+method+to+measure+regularity+in+biological+patterns%3A+a+case+study+in+a+Drosophila+neurodegenerative+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model.</a> Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Yusuff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+pathogenic+copy-number+variant+genes+show+global+and+non-neuronal+defects+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development.</a> PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+interactive+machine+learning+for+%28bio%29image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).</li>
<li>Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eip74EF+is+a+dominant+modifier+for+ALS-FTD-linked+VCPR152H+phenotypes+in+the+Drosophila+eye+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model.</a> BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).</li>
<li>Baek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+and+PINK1+mediate+CHCHD10S59L+mutation-induced+defects+in+Drosophila+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro.</a> Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Especificaciones</td><td></td><td></td> del ordenador <td>Ryzen 5, 16 GB de RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10</td></tr><tr><td>Flynotyper</td><td>Iyer, J. et al. (2016)</td><td>Descargue el software aquí: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html</td><td>Software de código abierto. No utilice Flynotyper 2.0. En el momento de la publicación, 2.0 era bastante nuevo y este protocolo está optimizado para la versión original de Flynotyper.</td></tr><tr><td>ilastik</td><td>Berg, S. et al. (2019)</td><td>Descargue el software aquí: https://www.ilastik.org/download.html</td><td>Software de código abierto. Descargue la versión 1.4.0.post1 en Compilaciones regulares correspondientes al sistema operativo de su computadora.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>Descargue el software aquí: https://imagej.net/ij/download.html</td><td>Software de código abierto. Se utilizaron las versiones 1.53 y 1.54. 1.54 es la versión actualizada y es la descarga predeterminada.</td></tr><tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>LASX Office 1.4.6 28433</td><td>Sistema y software utilizados para la adquisición de z-stack.</td></tr><tr><td>Microscopio Leica Z16 APO con cámara DMC2900</td><td>Leica Microsystems</td><td>10 447 173, 12 730 466</td><td>Denominado microscopio y cámara Z-stack en el texto. Este producto ya está archivado.</td></tr></tbody></table>

cuantificación de los fenotipos oculares de drosophila melanogaster : un enfoque computacional que integra ilastik y flynotyper

Quantifying Drosophila melanogaster Eye Phenotypes: A Computational Approach Integrating ilastik and Flynotyper

En un estudio previo, utilizamos este protocolo para determinar modificadores genéticos de la proteína VCP mutante relacionada con la esclerosis lateral amiotrófica con demencia frontotemporal (ELA-FTD)12. Además, este método también se utilizó en otro artículo para evaluar la toxicidad de CHCHD10 ALS-FTD mediada porS59L, incluso cuando se utilizó un microscopio estereoscópico más antiguo13. Para validar aún más estos resultados, utilizamos ilastik y Flynotyper en la misma mutación de la enfermedad ELA-DFT que Baek et al.13; Sin embargo, un personal de laboratorio no capacitado realizó el experimento y obtuvo resultados similares. Por lo tanto, la combinación de ilastik y Flynotyper es un método robusto para puntuar de forma imparcial la degeneración de Drosophila ommatidia.
Preferimos el uso de un anillo de luz porque permite mejores evaluaciones cualitativas (Figura 3). Sin embargo, el uso de un anillo de luz provoca una sombra que Flynotyper no puede analizar directamente. Para superar esto, preprocesamos las imágenes en ilastik antes de cuantificar las puntuaciones P con Flynotyper. En general, las puntuaciones P del ojo de mosca no degenerado (GMR-GAL4) fueron significativamente más bajas en comparación con un ojo moderadamente degenerado (2x_S81L) y un ojo severamente degenerado (3x_S81L) (Figura 4A, B y Tabla 1). Este es el resultado esperado, ya que las puntuaciones P más altas generadas a partir de Flynotyper indican un ojo más degenerado1. Cuando no se utilizó ilastik, hubo diferencias insignificantes en las puntuaciones P entre un ojo no degenerado y un ojo moderadamente degenerado (Figura 4C y Tabla 1). Esto sugiere que Flynotyper tiene dificultades para identificar con precisión los patrones de omatidios en condiciones de luz anular sin usar ilastik. Esto se debe a que Flynotyper está diseñado para utilizar imágenes tomadas con una luz de doble punto que se convierte en escala de grises con ajustes adicionales para identificar el centro omatidianal1. Ilastik replica este proceso incorporando un punto en el centro de cada omatidio, lo que permite la cuantificación dentro de Flynotyper.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig01.jpg"> Figura 1: Ejemplo de flujo de trabajo de ilastik. (A) Creación de un nuevo proyecto en ilastik. (B) Elección de la imagen estándar. (C) Selección de valores sigma en Selección de características. (D) Marcar el primer plano de los omatidios para la sensibilidad. (E) Marcar el fondo de los omatidios para la sensibilidad. (F) Seleccionar cómo el software exportará los archivos procesados. (G) Elegir qué imágenes experimentales de ojo de mosca se analizarán. (H) Mostrar qué imágenes experimentales de ojo de mosca se analizarán. (I) Producto terminado después de ejecutar el software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig02.jpg"> Figura 2: Ejemplo de flujo de trabajo de Flynotyper. (A) Seleccionar solo el ojo de la mosca para su posterior análisis. (B) Abrir la imagen del ojo cortado en una nueva ventana. (C) Seleccionar las imágenes cortadas que se van a analizar y los parámetros que se van a comprobar para el análisis. (D) Ejemplos de resultados. Las puntuaciones fenotípicas se presentan en el extremo derecho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig03.jpg"> Figura 3: Imágenes cualitativas del ojo de Drosophila . El mismo ojo de mosca tomado con una luz anular (izquierda) y tomado con una luz de doble punto (derecha) en condiciones no degeneradas (arriba) y degeneradas (abajo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig04.jpg"> Figura 4: Uso de ilastik antes de Flynotyper para una cuantificación precisa del fenotipo de ojo rugoso en Drosophila. (A) Imágenes representativas del ojo de Drosophila de un ojo no degenerado (GMR-GAL4), un ojo moderadamente degenerado (2x_S81L) y un ojo severamente degenerado (3x_S81L). (B) Resultados de cuantificación de Flynotyper después de usar ilastik. Se calcularon los valores p de una prueba t de permutación bilateral para facilitar la interpretación de los resultados (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0) (C) Resultados de cuantificación de Flynotyper sin usar ilastik. Se calcularon los valores p de una prueba t de permutación bilateral para facilitar la interpretación de los resultados (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0,597, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0,687). N = 3 para cada grupo. Los puntos de datos se desplazan o apilan en el eje x para mayor claridad visual. La línea horizontal continua representa el promedio. Las barras de error representan la desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">GMR-GAL4</td>
			<td colspan="2">2x_S81L</td>
			<td colspan="2">3x_S81L</td>
		</tr><tr><td>Con ilastik</td>
			<td>Sin ilastik</td>
			<td>Con ilastik</td>
			<td>Sin ilastik</td>
			<td>Con ilastik</td>
			<td>Sin ilastik</td>
		</tr><tr><td>26.7</td>
			<td>55.7</td>
			<td>52.5</td>
			<td>51.2</td>
			<td>59.9</td>
			<td>55.6</td>
		</tr><tr><td>17.4</td>
			<td>53.5</td>
			<td>50</td>
			<td>54.9</td>
			<td>60.7</td>
			<td>52</td>
		</tr><tr><td>22.8</td>
			<td>55.5</td>
			<td>56.8</td>
			<td>55.2</td>
			<td>60.1</td>
			<td>55.1</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Puntuaciones P cuando se utiliza Flynotyper con ilastik y cuando se utiliza Flynotyper solo. 
Figura suplementaria S1: Montura de cabeza de mosca configurada para la adquisición de imágenes. Este es un ejemplo de cómo configurar la adquisición de imágenes utilizando varias hojas de papel. Sin embargo, se puede utilizar cualquier método que asegure la orientación adecuada de la cabeza y el ojo de la mosca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%201.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S2: Resultados cuantitativos de ilastik y Flynotyper cuando se utiliza un valor sigma de 2,5 en la selección de características. El uso de un valor sigma distinto de 5.0 en la selección de características en ilastik puede resultar en una cuantificación inexacta. En concreto, un valor sigma de 2,5 provoca una pérdida de sensibilidad. Se calcularon los valores p de una prueba t de permutación bilateral para facilitar la interpretación de los resultados (GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0,192, GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0). N = 3 para cada grupo. Los puntos de datos se desplazan o apilan en el eje x para mayor claridad visual. La línea horizontal continua representa el promedio. Las barras de error representan la desviación estándar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%202.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria S3: Pérdida de sensibilidad y puntuaciones P inexactas debido a parches necróticos. Las flechas blancas apuntan a segmentos de parches necróticos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%203.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria S1: Puntuaciones P cuando se utiliza un valor sigma de 2,5 en la selección de características. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219_Supp%20Table%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Cuantificación de los fenotipos oculares de Drosophila melanogaster : un enfoque computacional que integra ilastik y flynotyper

The Drosophila melanogaster compound eye is a well-structured and comprehensive array of around 800 ommatidia, exhibiting a symmetrical and hexagonal ...

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Investigación

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