Flujo de trabajo de biofabricación escalable para producir y aislar bioterapéuticos contra el cáncer basados en vesículas extracelulares derivados de células asesinas naturales

Nuestra investigación se centra en pequeñas vesículas producidas por un tipo de células inmunitarias que son naturalmente eficaces para matar las células cancerosas. Estas vesículas tienen un potencial terapéutico prometedor para el tratamiento de tumores sólidos, tanto en el sitio primario como en el secundario, como el cerebro. En este estudio, utilizamos una resina bimodal para aislar vesículas mediante cromatografía de exclusión por tamaño, maximizando la pureza del producto al separar físicamente las vesículas de los contaminantes mientras atrapamos aún más los contaminantes dentro de la resina a través de fuerzas electrostáticas.

A continuación, esterilizamos, concentramos y tamponeamos las vesículas antes de su uso Los detalles del flujo de trabajo de biofabricación en este vídeo utilizan condiciones clínicamente relevantes y son escalables por su coste, produciendo eficazmente grandes cantidades de vesículas extracelulares de alta pureza. Esto hace que la técnica sea accesible para que los laboratorios académicos inviertan con confianza recursos en el estudio de dichas terapias con un proceso de producción y aislamiento confiable. Actualmente estamos investigando el potencial terapéutico de estas vesículas y modelos preclínicos y fortaleciendo aún más nuestra comprensión de cómo funcionan.

Para comenzar, realice el inicio rápido del sistema de cromatografía líquida de proteínas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Realice las conexiones utilizando el método de goteo a goteo para asegurarse de que no se introduzca aire dentro de la columna. Configure el colector de fracciones con tubos de recolección apropiados para recolectar las muestras.

Cambie la configuración de fraccionamiento al volumen de recolección deseado. Retire de 40 a 80 mililitros de vesícula extracelular previamente preparada o de medios acondicionados ricos en EV del congelador a 80 grados Celsius y descongele rápidamente a 37 grados Celsius. Centrifugar la muestra a 10.000 g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.

Para reducir los niveles de ADN bicatenario, trate los medios acondicionados ricos en EV con cinco milimoles de cloruro de magnesio y 50 unidades por mililitro de endonucleasa. Incubar la muestra durante dos a cuatro horas a 37 grados centígrados con una mezcla moderada. Una vez que el sistema de cromatografía esté listo, cargue el medio acondicionado rico en EV en una jeringa de 60 mililitros y conéctelo a la línea de muestras.

Haga clic en Ejecución manual para iniciar el sistema y establecer el caudal en cero. Siga las instrucciones del software para guardar la ejecución de forma preferente. A continuación, haga clic en Inicio.

Seleccione Line Beat Double-Filtered PBS y ejecute a una velocidad de flujo de dos mililitros por minuto, asegurando que la solución corra a través de la columna. Una vez que el absorbente se estabilice, presione Auto Zero UV. Cambie la ruta de flujo para dirigir la muestra a la botella de residuos antes de la columna. Después de cinco a 20 segundos, dirija la muestra a la columna.

Una vez que las lecturas UV alcancen aproximadamente 230 unidades de miliabsorbancia, haga clic en Fraccionamiento. Una vez completada la inyección de la muestra, cambie el sistema tampón a PBS de doble filtro para continuar con la purificación. Cuando el valor UV alcance aproximadamente 1.600 unidades de miliabsorbancia, de nuevo, haga clic en Fraccionamiento.

Una vez que se haya detenido la ejecución, guarde el cromatograma como un documento PDF. Enjuague todos los componentes del aparato de ultrafiltración con 20 a 30 mililitros de etanol al 90%. Centrifugar a 4.000 g durante cinco a 10 minutos y desechar el caudal.

A continuación, realice el enjuague con PBS estéril para equilibrar el dispositivo y repita los pasos de centrifugación como antes. Combine todas las fracciones diluidas de NK-EV. Para maximizar la esterilidad, filtre la solución diluida de NK-EV con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros, prehumedecido con PBS de doble filtrado.

Recoja el filtrado en el aparato de concentración esterilizado. Centrifugar el filtrado a 4.000 g durante 15 a 40 minutos. Después de centrifugar, mezcle la solución dentro del compartimento del filtro superior con una pipeta serológica.

De nuevo, centrifugar a 4.000 g durante 10 minutos. Invierta el dispositivo de filtración y conéctelo al dispositivo colector para recoger el NK-EV. Girar el NK-EV a 2.000 g durante dos minutos y transferir el producto purificado a un tubo estéril.

Inicie el sistema de análisis de seguimiento de nanopartículas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Observe la celda de flujo en busca de burbujas de aire. Si hay una burbuja de aire, elimínela enjuagando la celda de flujo con etanol al 20% y agua filtrada dos veces.

Una vez limpio, vuelva a insertar con cuidado el módulo láser en el instrumento de análisis de seguimiento de nanopartículas. Cierre la puerta y haga clic en Iniciar cámara. Cambie la configuración de captura a una ganancia de pantalla de dos y un nivel de cámara de 14.

Encienda el calentador para estabilizar la temperatura de la celda de flujo. Haga clic en Medición estándar para crear un script en la pestaña SOP para recopilar una captura durante un minuto a un caudal de 30 a 23 grados Celsius. Agregue la carpeta y el nombre del archivo al nombre de la ruta para guardar los datos.

Agite el producto NK-EV purificado y prepare su dilución con PBS de doble filtrado. Después de vorexear la muestra diluida, cárguela en la jeringa de adquisición de 1 mililitro sin introducir burbujas de aire. Conecte con cuidado la jeringa a la línea de carga del instrumento.

Empuje lentamente la mitad de la muestra, dejando aproximadamente 0,5 mililitros en la jeringa. Una vez que las partículas sean visibles en la pantalla, enfoque la cámara para que tenga un máximo de un halo alrededor de cada partícula, en la pestaña Hardware, haga clic en Infundir y establezca una tasa de 1, 000 durante cinco segundos. Luego baje la tasa a 30.

Presione Ejecutar script. Después de asegurarse de que la configuración es correcta, haga clic en Sí y siga las instrucciones del software. Después de completar la captura, haga clic en Cancelar cuando el software le pida procesar o exportar archivos.

Después de registrar cinco capturas por dilución, importe las cinco capturas para su análisis. Resalte los archivos y haga clic en Procesar archivos seleccionados. En la pestaña Proceso, ajuste la configuración del análisis a una ganancia de pantalla de dos y un umbral de detección de 15.

Marque y haga clic en Aceptar para el análisis. Después de procesar, haga clic en Sí sin hacer clic en casillas adicionales o haga clic en Exportar para exportar los archivos. El tamaño de partícula purificado de NK-EV osciló entre 76,30 y 174,30 nanómetros con una concentración promedio de 1,39 veces 10 a una potencia de 12 EV por mililitro.

Además, la cuantificación con fluorímetro mostró una concentración de proteína de aproximadamente 300 miligramos por mililitro y una concentración de ADN bicatenario de 225 miligramos por mililitro. El tratamiento con células leucémicas humanas K562 con NK-EV mostró una disminución dependiente de la dosis en la viabilidad celular con una EC 50 de 9,33 veces 10 a una potencia de nueve EV por mililitro.