Name: Caracterización integral de la mineralización tisular en un modelo ex vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprende a caracterizar la mineralización tisular en modelos ex vivo de regeneración ósea usando micro-CT, nanoindentación y espectroscopia Raman. Este enfoque multimodal permite evaluar la calidad del nuevo tejido mineralizado.

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<meta charset="utf8"></head><body>Análisis multimodal de la formación ósea mediante modelos de explantes

<ol><li>Feroz, S., Cathro, P., Ivanovski, S., Muhammad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+bone+grafts+and+substitutes%3A+A+review+of+recent+advancements+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Adv%22%5BJournal%5D)">Biomimetic bone grafts and substitutes: A review of recent advancements and applications.</a> Biomed Eng Adv. 6, 100107(2023).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP2+activity%2C+although+dispensable+for+bone+formation%2C+is+required+for+the+initiation+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing.</a> Nat Genet. 38 (12), 1424-1429 (2006).</li>
<li>Hadjidakis, D. J., Androulakis, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boneremodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Boneremodeling.</a> Ann N Y Acad Sci. 1092, 385-396 (2006).</li>
<li>Boivin, G., Meunier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degree+of+mineralization+of+bone+tissue+measured+by+computerized+quantitative+contact+microradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tiss+Int%22%5BJournal%5D)">The degree of mineralization of bone tissue measured by computerized quantitative contact microradiography.</a> Calcified Tiss Int. 70 (6), 503-511 (2002).</li>
<li>Boivin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+remodeling+on+the+mineralization+of+bone+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporo+Int%22%5BJournal%5D)">Influence of remodeling on the mineralization of bone tissue.</a> Osteoporo Int. 20 (6), 1023-1026 (2009).</li>
<li>Zanghellini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+analysis+and+comparison+of+stoichiometric+and+structural+characteristics+of+parosteal+and+conventional+osteosarcoma+with+massive+sclerosis+in+human+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Multimodal analysis and comparison of stoichiometric and structural characteristics of parosteal and conventional osteosarcoma with massive sclerosis in human bone.</a> J Str Biol. 216 (3), 108106(2024).</li>
<li>Trento, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((formation+around+two+titanium+implant+surfaces+placed+in+bone+defects+with+and+without+a+bone+substitute+material%3A+A+histological%2C+histomorphometric%2C+and+micro-computed+tomography+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Implant+Dent+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">formation around two titanium implant surfaces placed in bone defects with and without a bone substitute material: A histological, histomorphometric, and micro-computed tomography evaluation.</a> Clin Implant Dent Relat Res. 22 (2), 177-185 (2020).</li>
<li>Palmquist, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiscale+analytical+approach+to+evaluate+osseointegration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration.</a> J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).</li>
<li>Budán, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+radiomics+evaluation+of+bone+formation+utilizing+multimodal+%28SPECT%2FX-ray+CT%29+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel radiomics evaluation of bone formation utilizing multimodal (SPECT/X-ray CT) in vivo imaging.</a> PLoS ONE. 13 (9), e0204423(2018).</li>
<li>Hulsart-Billström, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surprisingly+poor+correlation+between+in+vitro+and+in+vivo+testing+of+biomaterials+for+bone+regeneration%3A+results+of+a+multicentre+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cells+Mater%22%5BJournal%5D)">A surprisingly poor correlation between in vitro and in vivo testing of biomaterials for bone regeneration: results of a multicentre analysis.</a> Eur Cells Mater. 31, 312-322 (2016).</li>
<li>Cramer, E. E. A., Ito, K., Hofmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+bone+models+and+their+potential+in+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Osteoporo+Rep%22%5BJournal%5D)">Ex vivo bone models and their potential in preclinical evaluation.</a> Curr Osteoporo Rep. 19 (1), 75-87 (2021).</li>
<li>Chan, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trabecular+bone+explant+model+of+osteocyte-osteoblast+co-culture+for+bone+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A trabecular bone explant model of osteocyte-osteoblast co-culture for bone mechanobiology.</a> Cell Mol Bioeng. 2 (3), 405-415 (2009).</li>
<li>Doke, S. K., Dhawale, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+animal+testing%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Pharma+J%22%5BJournal%5D)">Alternatives to animal testing: A review.</a> Saudi Pharma J. 23 (3), 223-229 (2015).</li>
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<li>Paré, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+and+axially+vascularized+calcium+phosphate-based+implants+for+segmental+mandibular+defects%3A+A+promising+proof+of+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Standardized and axially vascularized calcium phosphate-based implants for segmental mandibular defects: A promising proof of concept.</a> Acta Biomater. 154, 626-640 (2022).</li>
<li>Roschger, P., Fratzl, P., Eschberger, J., Klaushofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+quantitative+backscattered+electron+imaging+for+the+measurement+of+mineral+density+distribution+in+human+bone+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Validation of quantitative backscattered electron imaging for the measurement of mineral density distribution in human bone biopsies.</a> Bone. 23 (4), 319-326 (1998).</li>
<li>Roschger, P., Plenk, H., Klaushofer, K., Eschberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+scanning+electron+microscopy+approach+to+the+quantification+of+bone+mineral+distribution%3A+backscattered+electron+image+grey-levels+correlated+to+calcium+K+alpha-line+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Micro%22%5BJournal%5D)">A new scanning electron microscopy approach to the quantification of bone mineral distribution: backscattered electron image grey-levels correlated to calcium K alpha-line intensities.</a> Scanning Micro. 9 (1), 75-86 (1995).</li>
<li>Porter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+inexpensive+paraffin-embedding+method+for+dynamic+bone+formation+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quick and inexpensive paraffin-embedding method for dynamic bone formation analyses.</a> Sci Rep. 7, 42505(2017).</li>
<li>Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undecalcified+bone+preparation+for+histology%2C+histomorphometry+and+fluorochrome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis.</a> J Vis Exp. (35), e1707(2010).</li>
<li>Kazanci, M., Roschger, P., Paschalis, E. P., Klaushofer, K., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+osteonal+tissues+by+Raman+spectral+mapping%3A+Orientation-composition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Bone osteonal tissues by Raman spectral mapping: Orientation-composition.</a> J Str Biol. 156 (3), 489-496 (2006).</li>
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<li>Kleuskens, M. W. A., van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+human+osteochondral+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">An ex vivo human osteochondral culture model.</a> J Ortho Res. 39 (4), 871-879 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,20 filtros</td><td>VWR&nbsp;</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de 18 G (1,2x40 mm)</td><td>Jeringa Sterican</td><td>4665120</td><td></td></tr><tr><td>3 mL</td><td>HENKE-JECT</td><td>8300005762</td><td></td></tr><tr><td>ácido clorhídrico al 37%&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>1.00317.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético (glacial)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A6283&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acetona &nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20063-365&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Azul Alcián 8GX</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>361186</tr><tr><td>Hidróxido de amonio</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>318612</tr><tr><td>Fosfato tricálcico apatítico&nbsp;</td><td>Centro de Ingeniería Biomédica y Sanitaria (Mines Saint Etienne, Francia)</td><td>TV26U&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Azophloxine</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>210633</tr><tr><td>Peróxido de benzoilo</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8.01641.0250</td><td></td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Medtronic&nbsp;</td><td>InductOs 1,5 mg/mL</td><td></td></tr><tr><td>Croceína Brillante&nbsp;</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>2107507</tr><tr><td>CTVox&nbsp;</td><td>Bruker-DataViewer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Skyscan-Disco</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de diamante</td><td>Struers</td><td>MOD13</td><td></td></tr><tr><td>Sierra de diamante</td><td>Struers</td><td>Accutom-50</td><td></td></tr><tr><td>DiaPro Mol B3 solución de diamante</td><td>Struers</td><td>40600379</td><td></td></tr><tr><td>DiaPro Nap B1 solución de diamante</td><td>Struers</td><td>40600373</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>102404598</tr><tr><td>ftalato de dibutilo</td><td>Chimie-Plus Laboratoires</td><td>28656</td><td></td></tr><tr><td>DragonFly software&nbsp;</td><td>ORS</td><td>2022.1.0.1231.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) alta glucosa, GlutaMAX(TM), piruvato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Eosine Y- Surgipath&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>1002830105</tr><tr><td>Eritrosina B</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>102141057</tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR&nbsp;</td><td></td><td></td>20820362</tr><tr><td>Eukitt&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>6.00.01.0003.06.01.01</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro férrico hexahidratado (FeCl3, 6H2O)&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>1.03943.0250</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)&nbsp;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fucsina</td><td>Merck&nbsp;</td><td>1.05231.0025&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)</td><td>Biosera</td><td>MS01NG100J</td><td></td></tr><tr><td>hematoxilina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>86.118.9&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Prensa isostática</td><td>Nova Suisse</td><td>Pmax 1500 bares</td><td></td></tr><tr><td>Granulometría de difracción láser</td><td>&nbsp; Malvern</td><td>Mastersizer 3000</td><td></td></tr><tr>Prolabo<td>verde claro</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td>28947135</tr><tr><td>Carbonato de litio</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A13149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Paño de pulido MD-Mol</td><td>Struers 40500077</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metilciclohexano</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metilciclohexano&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metilciclohexano&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>8.06147.1000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Metilmetacrilato</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>8.00590.2500</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT, micro-escáner&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1272</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico (NAH2PO4)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>71496</td><td></td></tr><tr><td>Mortero</td><td>Fritsch&nbsp;</td><td>Pulverisette 6</td><td></td></tr><tr><td>N,N, Dimethylanilin</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>803060</td><td></td></tr><tr><td>Estación de nanoindentación</td><td>Anton Paar</td><td>NHT2</td><td></td></tr><tr><td>ND-Nap paño de pulido</td><td>Struers</td><td>40500080</td><td></td></tr><tr><td>OATS Juego de Sistema de Transferencia de Autoinjerto Osteocondral, 4,75 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-04S</td><td></td></tr><tr><td>OATS Juego de Sistema de Transferencia de Autoinjerto Osteocondral OATS, 8 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-08S</td><td></td></tr><tr><td>Naranja G</td><td>Ral</td><td>M15</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de inclusión desechables Peel-a-way</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18646C-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina (P/S)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfomolíbdico&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>221856-100 g</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfotúngstico</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td>12863-5&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pulidora</td><td>Sturers</td><td>Dap V</td><td></td></tr><tr><td>Poupinel</td><td>MEMMERT</td><td>TV26U&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microespectrómetro Raman</td><td>Renishaw</td><td>InVia Qontor</td><td></td></tr><tr><td>Safran du G&acirc; tinais&nbsp;</td><td>Labonord&nbsp;</td><td></td><td></td>11507737</tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>Carl Zeiss</td><td>Evo LS 10</td><td></td></tr><tr><td>SEM</td><td>Zeiss</td><td>Carl Zeiss Evo LS10</td><td></td></tr><tr><td>SiC Láminas/Papeles de esmerilado</td><td>Struers</td><td>40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)</td><td></td></tr><tr><td>Pintura de plata</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>12686-15</td><td></td></tr><tr><td>Talón estándar con patrones de copa de Faraday, carbono, aluminio y silicona</td><td>Micro-Analysis Consultants Ltd</td><td>8602</td><td></td></tr><tr><td>T25 Matraz</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>VWR&nbsp;</td><td>28975.325</td><td></td></tr><tr><td>Xilidina Ponceau</td><td>Aldrich&nbsp;</td><td>19.976-1&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización integral de la mineralización tisular en un modelo ex vivo

Comprehensive Characterization of Tissue Mineralization in an Ex Vivo Model

En la Figura 2 se muestra una imagen de micro-TC del explante. El uso de la segmentación manual no puede separar de manera óptima el hueso del cemento, presente en el canal central, utilizando el umbral global. Para mejorar el reconocimiento del hueso trabecular y el cemento, proponemos utilizar el aprendizaje profundo. El aprendizaje profundo es poderoso para reconocer las características de los biomateriales y ayuda a mejorar la separación entre el hueso y el cemento, lo que permite una mejor evaluación de las interacciones entre el cemento y el hueso. Esto es de suma importancia para cuantificar con precisión la cantidad de hueso formado en la interfaz con el cemento y no incorporar píxeles falsos en este cálculo.
Sin embargo, la simple cuantificación del hueso en la interfase no es suficiente para caracterizar el hueso recién formado. Se requiere un estudio más profundo de la calidad de la matriz ósea y la composición celular para comprender mejor la fuerza del nuevo hueso y los mecanismos celulares que llevaron a la formación de esta nueva matriz. La matriz ósea se puede caracterizar utilizando dos enfoques complementarios: qBEI y microespectroscopía Raman. En la Figura 3 se presenta un ejemplo de una imagen qBEI. Con qBEI, cada píxel codificado en escala de grises se transforma en una concentración de calcio. Este es un requisito previo para evaluar la distribución del contenido de calcio en el hueso trabecular y para comprender (i) el grado de mineralización del hueso recién formado en la interfaz con el cemento y (ii) si la presencia de cemento interrumpe la mineralización del hueso trabecular. La ventaja de qBEI es su capacidad para adquirir una imagen de alta resolución en muy poco tiempo, a diferencia de la microespectroscopia Raman que requiere un tiempo de adquisición más largo. Los parámetros de qBEI, como lamedia de Ca, elpico de Ca y laanchura de Ca, pueden derivarse de la distribución de calcio y utilizarse para comparar la respuesta entre dos cementos o biomateriales.
Por otro lado, qBEI no proporciona ninguna información sobre la calidad de la fase orgánica de la matriz ósea en la interfaz con el biomaterial. La información adicional sobre las propiedades del material de la fase orgánica se deriva de la microespectroscopía Raman. La microespectroscopia Raman se realiza en la misma muestra que se utiliza para qBEI después de un rápido esmerilado y pulido de la superficie para eliminar la capa de carbono conductor. En la microespectroscopia Raman, los espectros se adquieren en cada ubicación de píxel. En la Figura 4 se proporcionan ejemplos de espectros Raman sin procesar, sin procesar y sin procesar. Cada espectro contiene información sobre la composición del píxel analizado e incluye picos relacionados con la resina de incrustación, en este caso, pMMA, la fase mineral, picos v1PO4 y v1CO3, y la fase orgánica, picos Pro, Hyp, CML, Amide III, PG, CH2, Pen. y Amida I. En el ejemplo de la Figura 4, el espectro sin tratar muestra la contribución de la resina de recubrimiento a ~812 cm-1 y una línea de base curva distinta de cero debido a la fluorescencia, aunque se utiliza un láser rojo de infrarrojo cercano. El procesamiento del espectro es un requisito previo para garantizar un cálculo preciso de los diversos parámetros Raman, en particular la eliminación de la fluorescencia de fondo. Al adquirir datos, el usuario debe asegurarse de un posicionamiento preciso y evitar la saturación del detector para confirmar la presencia del pico v1PO4 ubicado a ~960 cm-1. Después del posprocesamiento, las relaciones de intensidad máxima se calculan de acuerdo con la ubicación del modo vibratorio característico.
Sin embargo, es cuestionable si los cambios en la composición del material condujeron a cambios en la respuesta biomecánica. Para recopilar información sobre la biomecánica del hueso recién formado, llevamos a cabo sistemáticamente investigaciones de nanoindentación en la misma muestra utilizada para la microespectroscopia Raman. La información mecánica de los tejidos se obtiene a partir de curvas de nanoindentación representadas por curvas de carga frente a profundidad (Figura 5). Vale la pena señalar que la profundidad no vuelve a cero al final de la prueba, lo que representa la deformación plástica y el daño permanente creado en el material. La tasa de fluencia de la indentación se deriva de la curva de profundidad frente al tiempo.
Por último, la tinción histológica se utiliza para evaluar la respuesta del tejido al biomaterial a nivel celular (Figura 6). Las tinciones histológicas propuestas permiten determinar la presencia de tejido osteoide, pero también la identificación de células (macrófagos, células gigantes multinucleadas, osteoclastos, osteoblastos) y la posible presencia de una cápsula fibrosa en la interfaz con el biomaterial. Esto es muy importante para comprender la biocompatibilidad de un biomaterial, pero también la persistencia de hueso nuevo cuando el biomaterial se degrada.
En general, el enfoque multimétodo permite un estudio en profundidad de la formación ósea, la calidad del hueso recién formado y la composición celular. Cuando se lleva a cabo en el orden secuencial propuesto, todas las investigaciones se pueden realizar en la misma muestra, lo que reduce el costo y el tiempo de procesamiento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig01.jpg"> Figura 1: Resumen gráfico. Aquí se proporciona un resumen de los pasos del protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig02.jpg"> Figura 2: Análisis de micro-CT y aprendizaje profundo. (A) Reconstrucción 3D de imágenes de micro-CT. (B) Segmentación ósea y cementosa: comparación entre la segmentación manual y el aprendizaje profundo. Barra de escala = 5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig03.jpg"> Figura 3: Imágenes cuantitativas de electrones retrodispersados para determinar el contenido de calcio. (A) La imagen retrodispersada compuesta por los niveles de gris obtenidos en la microscopía electrónica de barrido (SEM) es convertida por el software de análisis de imágenes en (B) un mapa de calcio que muestra los puntos calientes de la muestra ósea. (C) Se traza la distribución del contenido de calcio en función del área ósea y se calculan los tres parámetros principales de qBEI, Camean, Capeak yancho de Ca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig04.jpg"> Figura 4: Ejemplo de espectros Raman. (A) Espectro Raman crudo sin procesar obtenido en el rango espectral de 800 a 1800 cm-1. El fondo de fluorescencia es claramente visible ya que los espectros no parten de 0. La contribución de resina (pMMA) es claramente visible a ~812 cm-1. (B) Espectro procesado. La posición de los diferentes modos vibratorios de interés se indica en el espectro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig05.jpg"> Figura 5: Investigación de las propiedades mecánicas de los tejidos mediante nanoindentación. (A) El dispositivo de nanoindentación se compone de una parte óptica que se utiliza para definir la ubicación de la región de interés en la superficie del bloque de muestra, y luego el bloque se traduce debajo de la parte de indentación. (B) La carga frente al tiempo y la profundidad frente al tiempo se trazan durante la prueba de indentación y se utilizan para generar el (C) Curva de carga en función de la profundidad. En este ejemplo, la profundidad elegida se fijó en 400 nm. La carga máxima (Lm), la profundidad al final de la carga (hl), la profundidad después del período de pausa (hm), la pendiente del segmento de descarga (S) y el área bajo la fase de carga-descarga del ensayo (W plast) se derivan de la curva de carga versus profundidad y se utilizan para calcular los diferentes parámetros de nanoindentación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig06.jpg"> Figura 6: Análisis histológico de explantes osteocondrales tratados con cemento después de 28 días de cultivo. (A) La tinción con Movat demuestra la estructura del tejido, incluyendo el hueso y el cemento que rellena el defecto. (B) La tinción HES ilustra la integración del tejido y la respuesta celular alrededor del cemento. Barra de escala: 2,5 mm. (C) Aumento del área resaltada en (B), que detalla la interfaz entre el cemento y el tejido circundante, donde se pueden observar las células invadiendo el cemento. Barra de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Caracterización integral de la mineralización tisular en un modelo ex vivo

The extensive characterization of tissue mineralization in the context of bone regeneration represents a significant challenge, given the numerous ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

No destructivos visualización de volumen sólo se puede lograr por medio de técnicas tomográficas, de los cuales el más eficiente es la tomografía de rayos X micro computarizada (TC).

3D de alta resolución de imagen de Ex-Vivo Muestras Biológicas por Micro CT

Los modelos animales se utilizan con frecuencia para estudiar la metástasis del cáncer de hueso. En este protocolo vamos a describir dos métodos comunes de la inoculación del tumor para los estudios de metástasis óseas y describir brevemente algunos de los análisis utilizados para supervisar y cuantificar estos modelos.

Los modelos de metástasis en los huesos

En este vídeo, describimos un método para la detección de depósitos de calcio secretados por osteoblastos utilizando un colorante aniónico, Alizarin Red S. Primero se tiñen los osteoblastos cultivados y luego se recupera el colorante para la cuantificación colorimétrica de los depósitos de calcio o el grado de mineralización de los osteoblastos.

Ensayo de mineralización in vitro: un método colorimétrico para cuantificar los depósitos de calcio osteoblásticos en el sustituto de injerto óseo mediante tinción y extracción de rojo de alizarina S

En este manuscrito, presentamos una plataforma de criohistología semiautomatizada de alto rendimiento para producir imágenes compuestas alineadas de múltiples medidas de respuesta a partir de varias rondas de imágenes fluorescentes en secciones congeladas de tejidos mineralizados.

De alto rendimiento, de múltiples imágenes Cryohistology de tejidos mineralizados

Presentamos un protocolo para comparar el estado de los minerales en vesículas por dos líneas de células de hueso humano: hFOB 1.19 y Saos-2. Sus perfiles de mineralización fueron analizados por alizarina rojo-S (AR-S) coloración, visualización luz de ultravioleta (UV), la proyección de imagen de microscopía electrónica (TEM) transmisión y microanálisis por energía dispersiva por rayos x (EDX).

Análisis de minerales producidos por hFOB 1.19 y Saos-2 células usando la microscopia electrónica transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de muerte en todo el mundo. La calcificación vascular contribuye sustancialmente a la carga de morbilidad y mortalidad cardiovascular. Este protocolo describe un método simple para cuantificar la precipitación de calcio mediada por células del músculo liso vascular in vitro mediante imágenes fluorescentes.

Un método biológico semiautomatizado y reproducible para cuantificar la deposición de calcio in vitro

Aquí, describimos un sistema microfisiológico estandarizado y fácil de implementar que refleja la complejidad de la estructura in vivo de la médula ósea humana, proporcionando un modelo pertinente para estudiar finamente una amplia gama de eventos normales y patológicos.

Un modelo 3D de médula ósea humana para investigar la dinámica y las interacciones entre células residentes en contextos fisiológicos o tumorales

Este trabajo presenta la metodología para obtener y evaluar la calcificación vascular mediante el aislamiento de aortas murinas seguido de la extracción de vesículas extracelulares calcificadas para observar el potencial de mineralización.

Análisis de calcificación vascular mediada por vesícula extracelular utilizando modelos in vitro e in vivo

Este protocolo presenta un método económico y eficiente para la evaluación cuantitativa de la microarquitectura ósea en un modelo murino de osteoporosis mediante la combinación de técnicas de tinción de hematoxilina-eosina (HE) y microtomografía computarizada (Micro-CT).

Evaluación de la microarquitectura ósea trabecular en un modelo murino de osteoporosis

Proponemos un protocolo para evaluar la regeneración ósea en varios niveles jerárquicos. Este enfoque multimodal permite el análisis estructural a diferentes escalas de longitud, abordando eficazmente los desafíos en la preparación de la muestra. También proporciona un flujo de trabajo fiable para evaluar la eficacia de los biomateriales en la promoción de la regeneración ósea.

Enfoque multimodal para evaluar la regeneración ósea y el rendimiento en andamios

Este protocolo describe la fabricación de construcciones óseas 3D utilizando osteocitos humanos incrustados en hidrogelatinas metacriladas (GelMA) suplementadas con matriz extracelular descelularizada. El método es de bajo coste, escalable y compatible con equipos básicos de laboratorio, proporcionando una plataforma traslacional para estudiar los procesos de enfermedad musculoesquelética.

Una plataforma de cultivo óseo 3D que utiliza osteocitos humanos y matriz extracelular descelularizada para modelar enfermedades musculoesqueléticas

Aprende a caracterizar la mineralización tisular en modelos ex vivo de regeneración ósea usando micro-CT, nanoindentación y espectroscopia Raman. Este enfoque multimodal permite evaluar la calidad del nuevo tejido mineralizado.

Caracterización integral de la mineralización tisular en un modelo ex vivo

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