Modelado del glicocálix endotelial después de la neumonectomía en un chip fluídico 3D: un enfoque para fabricar un sistema de órgano en chip basado en el sistema vascular

El laboratorio de Mensah se centra en la investigación vascular y está desarrollando nuevas técnicas para investigar el glicocáliz endotelial y su papel en la enfermedad vascular. Los desarrollos recientes implican la creación de modelos in vitro más avanzados para la investigación del glicocálix y la investigación de estrategias terapéuticas para atacar la salud y la reparación del glicocálix endotelial en enfermedades. Los desafíos experimentales incluyen modelos in vitro incompletos, que no logran replicar con precisión el glicocáliz sano, así como técnicas difíciles de cuantificación y medición.

Nuestra contribución actual al campo ha ampliado la comprensión actual del glicocáliz endotelial, particularmente en su papel en la metástasis del cáncer, la regeneración del glicocáliz dañado y las interacciones con los receptores de la superficie vascular. Nuestro método presenta un método económico y eficaz para crear sistemas vasculares de órgano en un chip que expresan un glicocálix endotelial más desarrollado y biomimético en comparación con las técnicas convencionales. Para comenzar, pese 10 partes de base de elastómero de silicona en un tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Vierta una parte de agente de curado en el tubo que contiene la base de elastómero de silicona hasta un volumen final de 30 mililitros. Mezclar bien para obtener una solución uniforme. Ahora vierta la solución bien mezclada en los moldes, luego coloque los moldes en una cámara de vacío para desgasificar el PDMS durante 30 a 60 minutos o hasta que no queden burbujas.

Retire el PDMS desgasificado de la cámara de vacío y déjelo curar a temperatura ambiente durante 48 horas. Extraiga el PDMS curado del molde de PLA. Luego coloque dos trozos de cinta adhesiva de doble cara en cada placa de cultivo celular.

A continuación, coloque cada mitad de la vasculatura de PDMS encima de la cinta en su propia placa de cultivo celular. Coloque varias gotas de fibronectina de 30 microlitros a lo largo de la vasculatura del PDMS con una micropipeta. Incline el PDMS según sea necesario y use una punta de pipeta para cubrir uniformemente la superficie.

Después de una incubación de 30 minutos, aspire la solución de fibronectina del PDMS. Luego deje que las piezas se sequen al aire dentro del gabinete. Coloque tapones impresos en 3D en cada extremo de las mitades de la vasculatura del PDMS para evitar fugas en la suspensión celular, utilizando dos tapones por pieza.

Con una micropipeta, siembre 300 microlitros de suspensión celular HLMVEC en cada pieza de PDMS e incube. Luego regrese las mitades al gabinete y retire los cuatro tapones. Agregue medio de cultivo HLMVEC para sumergir las mitades de la vasculatura de PDMS e incube nuevamente durante seis a 10 horas.

Ahora aspire el medio HLMVEC de la placa de Petri que contiene las mitades de vasculatura. Coloque cada mitad de PDMS en los bloques de policarbonato, asegurando una alineación adecuada. Aplique sellador de silicona en los extremos de la vasculatura de PDMS.

Inserte un tubo de una pulgada de largo en ambos extremos de la pieza PDMS inferior. Luego voltee el bloque acrílico superior que contiene la mitad superior del PDMS sobre el bloque acrílico inferior. Atornille los bloques acrílicos, asegurándose de que el bloque roscado esté en la parte inferior.

Tape los extremos libres del tubo con tapones impresos en 3D. Retire un tapón e inyecte suavemente 500 microlitros de medio de cultivo HLMVEC en la vasculatura con una micropipeta. Inclínelo para eliminar las burbujas de aire y luego vuelva a colocar el tapón.

Lleve el chip ensamblado y los componentes estériles al gabinete de bioseguridad. Conecte todos los tubos y ensamble el sistema de flujo, asegurándose de que el tubo de entrada se conecte a la parte inferior del depósito de la jeringa para facilitar el flujo por gravedad. Ahora cebe suavemente el sistema de flujo con medio HLMVEC.

Utilice una pipeta serológica de 50 mililitros. Inyecte 30 mililitros de medio en la parte superior del depósito de la jeringa y opere la bomba peristáltica a baja velocidad para llenar el tubo. Lave cada mitad de la vasculatura de PDMS en PBS durante cinco minutos, agregando suficiente solución para sumergir completamente la sección vascular.

La simulación de fluidos mostró un esfuerzo cortante significativamente elevado en las bifurcaciones de los vasos en el modelo de neumonectomía en comparación con el modelo de control. La microscopía de campo claro confirmó la unión uniforme de células HLMVEC tanto en condiciones estáticas como de flujo a 93,1 mililitros por minuto después de 24 horas. Las imágenes de fluorescencia de la bifurcación de entrada mostraron capas celulares intactas y bien distribuidas tanto en modelos de control como de neumonectomía.

Las imágenes inmediatamente después de la segunda bifurcación revelaron una pérdida celular sustancial tanto en el modelo de control como en el de neumonectomía. Las células permanecieron adherentes y mostraron una tinción consistente en la región aguas abajo de la segunda bifurcación en ambos modelos. Los núcleos uniformes teñidos con DAPI en los modelos vasculares indicaron que la confluencia se mantuvo a pesar de la exposición al flujo.

Una prueba temprana del modelo de control resultó en una distribución desigual de las células debido a las burbujas de aire introducidas durante el cebado del sistema.