Name: Cuantificación de genomas virales adenoasociados en muestras de vectores purificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa por gotas digitales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 43 s
Description: Aprende a cuantificar genomas de virus adenoasociados mediante dd_PCR en muestras de vectores purificados. Este protocolo validado mejora la precisión y fiabilidad en el control de calidad de AAV para aplicaciones de terapia génica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo estandarizado para la cuantificación del genoma viral mediante PCR digital en gotas

<ol><li>Balakrishnan, B., Jayandharan, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+biology+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+vectors+used+in+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Basic biology of adeno-associated virus (AAV) vectors used in gene therapy.</a> Curr Gene Ther. 14 (2), 86-100 (2014).</li>
<li>Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tissue-tropism+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">In vivo tissue-tropism of adeno-associated viral vectors.</a> Curr Opin Virol. 21, 75-80 (2016).</li>
<li>Pupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors%3A+The+Rubik%27s+cube+of+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy.</a> Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).</li>
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<li>Brimble, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+packaging+of+translatable+P5-associated+DNA+contaminants+in+recombinant+AAV+vector+preps%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Preventing packaging of translatable P5-associated DNA contaminants in recombinant AAV vector preps.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 24, 280-291 (2022).</li>
<li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product-related+impurities+in+clinical-grade+recombinant+AAV+vectors%3A+Characterization+and+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Product-related impurities in clinical-grade recombinant AAV vectors: Characterization and risk assessment.</a> Biomedicines. 2 (1), 80-97 (2014).</li>
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<li>Sidransky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ras+oncogene+mutations+in+the+stool+of+patients+with+curable+colorectal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors.</a> Science. 256 (5053), 102-105 (1992).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Anal Chem. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+digital+droplet-based+AAV+genome+titration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration.</a> Methods Mol Biol. 1950, 51-83 (2019).</li>
<li>Bio-Rad Laboratories Inc. Planning droplet digital PCR experiments. , 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/en-in/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/planning-ddpcr-experiments">https://www.bio-rad.com/en-in/life-science/learning-center/introduction-to-digital-pcr/planning-ddpcr-experiments</a> (2024).</li>
<li>Dorange, F., Le Bec, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+approaches+to+characterize+AAV+vector+production+%26+purification%3A+Advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Gene+Ther+Insights%22%5BJournal%5D)">Analytical approaches to characterize AAV vector production & purification: Advances and challenges.</a> Cell Gene Ther Insights. 4 (2), 119-129 (2018).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Prantner, A., Maar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+concentration%2C+characterization%2C+and+integrity+analysis+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+using+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR.</a> PLoS One. 18 (1), e0280242(2023).</li>
<li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Front Microbiol. 10, 1570(2019).</li>
<li>Suoranta, T., Laham-Karam, N., Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+accurate+titration+of+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for accurate titration of adeno-associated virus vectors.</a> Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1270-1279 (2021).</li>
<li>Bio-Rad. Droplet digital PCR applications guide. Bulletin 6407. , 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf</a> (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>pipeta de 8 canales 10 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,010</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de 8 canales 200 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,036</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de 8 canales 300 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3,12,50,00,052</td><td></td></tr><tr><td>Tira de PCR de 8 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>72.991.002</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch termociclador con 96&ndash; Módulo de Reacción de Pozo Profundo</td><td>Bio-Rad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Control de tampón para sondas 9 mL (2 x 4,5 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP) (2 x 1 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863023</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Placas de 96 pocillos (paquete de 25)</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Aceite lector de gotas (2 x 1L)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863004</td><td></td></tr><tr><td>Portacartuchos DG8</td><td>Bio-Rad</td><td>1863051</td><td></td></tr><tr><td>Cartuchos DG8 para QX200/QX100 (paquete de 24)</td><td>Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Juntas para QX200/QX100 (paquete de 24)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863009</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I (10U/&micro; L) + tampón</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de generación de gotas para sondas (10 x 7 mL)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863005</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Punta de filtro, 0.1-10 &mu; L, 34 mm, Rack, PCR Clean, ESTÉRIL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078500</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Punta de filtro, 20-300 &mu; L, 55 mm, Rack, PCR Clean, ESTÉRIL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078560</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Punta de filtro, 2-100 &mu; L, 53 mm, Rack, PCR Clean, ESTÉRIL&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30078543</td><td></td></tr><tr><td>Imprimaciones liofilizadas directas y sus respectivos maestros a 100 mM&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP como secuencia objetivo. Imprimación delantera: 5'-GAACGGCATCAAGGTGAACT-3'Sonda</td></tr> <tr><td>lyopohilizada y material maestro a 100 &micro; M&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP como secuencia objetivo. PrimeTime Eco Probe: /56-FAM/CAAGATCCG/ZEN/CCACAACATCGAGGA/3IABkFQ/</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Chemlab Analytical</td><td>CL00.1381</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasa</td><td>IDT</td><td>11-04-02-01</td><td></td></tr><tr><td>Placa PCR Heat Seal, lámina, perforable (paquete de 100)</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-68 surfactante no iónico (100x)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24040032</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Productos químicos de investigación de Honeywell</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>QX software de gestión</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Software para analizar datos de ddPCR</td></tr><tr><td>QX200 Generador de gotas</td><td>Bio-Rad</td><td>1864002</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Lector de gotas</td><td>Bio-Rad</td><td>1864003</td><td></td></tr><tr><td>Depósito de reactivos</td><td>VWR</td><td>613-1181</td><td></td></tr><tr><td>Imprimaciones liofilizadas inversas y sus respectivos maestros a 100 mM&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GFP como secuencia objetivo. Imprimación inversa: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3'SafeSeal</td></tr> <tr><td>tubo de reacción, 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.200</td><td></td></tr><tr><td>ADN de esperma de salmón, cortado (10 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>TE tampón</td><td>IDT</td><td></td><td>Acompañado de cebadores al pedir clorhidrato</td></tr><tr><td>de Tris (Tris-HCl)</td><td>Roche</td><td>10812846001</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de genomas virales adenoasociados en muestras de vectores purificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa por gotas digitales

Quantification of Adeno-Associated Viral Genomes in Purified Vector Samples by Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

Los resultados se pueden visualizar utilizando el software adecuado. Para cada pocillo, el gráfico de amplitud 1D muestra todas las gotas en relación con su amplitud. Se espera una clara separación entre las gotas positivas y negativas. Si más del 10% del total de gotas se encuentra entre las nubes de gotas positivas y negativas (un fenómeno conocido como lluvia de gotas), es necesario volver a medir la muestra (ver Figura 1). Información adicional sobre la lluvia de gotas está disponible en la discusión.
Se puede crear una tabla de datos para resumir toda la información registrada, incluido el nombre de la muestra, el número de gotas aceptadas (recuentos de eventos) y la concentración (copias/μL). Lo ideal es que el recuento de eventos se sitúe entre 15.000 y 20.000 gotas aceptadas. Si el recuento de eventos de un pozo es inferior a 10.000, el punto de datos debe excluirse del análisis. En el Cuadro 5 se proporciona un ejemplo de los datos de salida.
El título vg se puede calcular en función de la concentración (copias/μL), teniendo en cuenta las diluciones de la muestra. El rango de trabajo de dd_PCR es de 10-10.000 copias/μL. Los valores inferiores a 10 copias/μL deben excluirse del análisis. Se debe calcular el título vg de las muestras, así como los controles positivos y negativos. El valor medido del testigo positivo debe tener un coeficiente de variación (%CV) inferior al 20% en relación con el valor teórico. El testigo negativo debe ser inferior a 5 copias/μL. Además, se debe calcular el %CV entre repeticiones y diferentes diluciones para cada muestra. Si el %CV entre las diferentes diluciones supera el 20%, el valor puede considerarse inexacto y puede ser necesario volver a medir la muestra.
Una medición exitosa se caracteriza por una clara separación de las nubes de gotas positivas y negativas, al menos 10.000 gotas aceptadas, un valor entre 10 copias/μL y 10.000 copias/μL, y un %CV entre repeticiones inferior al 20%.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig01.jpg"> Figura 1: Visualización de dd_PCR gotas. (A) El gráfico de amplitud 1D muestra una clara separación de gotas positivas y negativas, lo que indica una partición exitosa de las gotas. (B) El gráfico muestra una mala separación de gotas positivas y negativas, conocida como lluvia de gotas, lo que sugiere una partición subóptima o problemas potenciales con el ensayo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67252/67252fig02.jpg"> Figura 2: Flujo de trabajo para cuantificar genomas virales mediante PCR digital en gotas. (1) Los tampones, reactivos y soluciones se preparan de acuerdo con las instrucciones del fabricante o el paso 1 del protocolo (Preparación de soluciones madre). (2) Se alícuota 45 μL de la solución de DNasa I en cada tubo de una tira de PCR de 8 tubos. Después de vórtice y centrifugar brevemente las muestras, se añaden 5 μL de la muestra a uno de los tubos. La DNasa I y la tira de PCR de ocho tubos que contiene la muestra se incuban en un termociclador durante 1 h a 37 °C, seguidas de diluciones en serie de las muestras. (3) La mezcla maestra de PCR se prepara como se describe y se alícuota 19,8 μL en cada tubo de una tira de PCR de 8 tubos. Las diluciones en serie de muestra del paso 2 se añaden a la mezcla maestra. 20 μL de mastermix plus la solución de muestra se carga en la fila central del cartucho y se transfieren 60 μL de aceite generador de gotas a los pocillos inferiores de un cartucho generador de gotas. A continuación, el cartucho se coloca en el generador de gotas y funciona de acuerdo con las condiciones especificadas. Después de la generación de gotas, 42,5 μL de la fila superior del cartucho se transfieren a una placa de PCR de pocillos múltiples. (4) La placa PCR se carga en un termociclador PCR y se ejecuta de acuerdo con las condiciones proporcionadas. La placa se analiza utilizando un lector de dd_PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Datos de precisión. Esta tabla presenta datos de precisión de cuatro conjuntos de muestras de control de calidad (QC), cada uno con cinco concentraciones (QC1-QC5). Cada control de calidad se midió cinco veces. Se muestra el coeficiente de variación (%CV) entre diferentes corridas, que representa la repetibilidad (A), y entre diferentes conjuntos de muestras, que representa la precisión intermedia (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 2: Diluciones de la muestra. La tabla muestra las diluciones de muestra recomendadas en función del título esperado del genoma viral (vg/mL). Se recomienda un total de tres diluciones para garantizar que al menos dos valores se encuentren dentro del rango de trabajo del ensayo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%202.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 3: dd_PCR composición de la mezcla maestra. Esta tabla describe la composición de la mezcla maestra de dd_PCR, que incluye un cebador directo e inverso (909 nM), una sonda (227 nM) y una supermezcla dd_PCR para sondas (sin dUTP, 1x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%203.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 4: Condiciones de termociclado. La tabla detalla el programa de PCR recomendado, que incluye: (1) una incubación de 10 minutos a 95 °C para la disrupción de la cápside y la activación de enzimas, (2) 40 ciclos de 30 s a 94 °C para la desnaturalización del ADN, y 1 minuto a 60 °C para el recocido y la extensión, (3) una incubación de 10 minutos a 98 °C para la desactivación de enzimas, y (4) manteniéndose a 4 °C. La temperatura de recocido puede requerir una optimización basada en el conjunto de cebador/sonda utilizado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%204.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla 5: Ejemplo de datos de salida de una ejecución real de AAV. La tabla proporciona un ejemplo de los datos de salida de una ejecución real de AAV, donde se midió una muestra en dos diluciones diferentes, cada una duplicada. El título del genoma viral (vg) (en vg/mL) se calcula utilizando la siguiente fórmula: 10 (pretratamiento con DNasa I) x 10 (dilución en la mezcla maestra) x 1.000 (μL a mL) x dilución en tampón de dilución AAV. STDEV representa la desviación estándar y CV indica el coeficiente de variación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67252/67252_Table%205.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Cuantificación de genomas virales adenoasociados en muestras de vectores purificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa por gotas digitales

Adeno-associated virus (AAV) is a non-pathogenic virus used as a delivery vehicle to transfer therapeutic genes into patients. Accurate quantification of ...

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Investigación

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Bioengineering

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Cuantificación de genomas virales adenoasociados en muestras de vectores purificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa por gotas digitales (Video) | JoVE Journal

Cuantificación de genomas virales adenoasociados en muestras de vectores purificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa por gotas digitales

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