Name: Monitoreo de cambios inducidos por electroporación en la generación de potencial de acción en celdas HEK de Tet-On Spiking diseñadas genéticamente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprende a monitorear cambios inducidos por electroporación en la generación de potenciales de acción utilizando células HEK Tet-On Spiking. Este método permite estudiar los efectos de la electroporación en células excitables de forma controlada.

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<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación de los efectos de la electroporación en células HEK de espiga modificadas genéticamente

<ol><li>Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+electroporation+and+electropermeabilization%3A+Mechanisms+and+models%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Membrane electroporation and electropermeabilization: Mechanisms and models.</a> Ann Rev Biophys. 48 (1), 63-91 (2019).</li>
<li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Serša, G., Kotnik, T., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+technologies+for+medicine%3A+principles%2C+applications%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Ann Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li>
<li>Kotnik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based applications in biotechnology.</a> Trend Biotechnol. 33 (8), 480-488 (2015).</li>
<li>Mahnič-Kalamiza, S., Vorobiev, E., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+in+food+processing+and+biorefinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Memb+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation in food processing and biorefinery.</a> J Memb Biol. 247 (12), 1279-1304 (2014).</li>
<li>Reddy, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+field+or+conventional+thermal+ablation+for+paroxysmal+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Pulsed field or conventional thermal ablation for paroxysmal atrial fibrillation.</a> New Engl J Med. 389 (18), 1660-1671 (2023).</li>
<li>Cvetkoska, A., Maček-Lebar, A., Trdina, P., Miklavčič, D., Reberšek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+contractions+and+pain+sensation+accompanying+high-frequency+electroporation+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Muscle contractions and pain sensation accompanying high-frequency electroporation pulses.</a> Sci Rep. 12 (1), 8019(2022).</li>
<li>Tung, L., Tovar, O., Neunlist, M., Jain, S. K., O'neill, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+strong+electrical+shock+on+cardiac+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+New+York+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Effects of strong electrical shock on cardiac muscle tissue.</a> Ann New York Acad Sci. 720 (1), 160-175 (1994).</li>
<li>Batista Napotnik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+HEK+cells+as+a+valuable+tool+for+studying+electroporation+in+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered HEK cells as a valuable tool for studying electroporation in excitable cells.</a> Sci Rep. 14 (1), 720(2024).</li>
<li>McNamara, H. M., Zhang, H., Werley, C. A., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+controlled+oscillators+in+an+engineered+bioelectric+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+X%22%5BJournal%5D)">Optically controlled oscillators in an engineered bioelectric tissue.</a> Phys Rev X. 6 (3), 031001(2016).</li>
<li>Tian, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-based+pooled+screening+yields+improved+far-red+genetically+encoded+voltage+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Video-based pooled screening yields improved far-red genetically encoded voltage indicators.</a> Nat Methods. 20 (7), 1082-1094 (2023).</li>
<li>Sweeney, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+membrane+permeability+induced+by+monopolar+and+high-frequency+bipolar+bursts+of+electrical+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell membrane permeability induced by monopolar and high-frequency bipolar bursts of electrical pulses.</a> Biochim Biophys Acta Biomembranes. 1858 (11), 2689-2698 (2016).</li>
<li>Pakhomov, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+plasma+membrane+permeabilization+in+mammalian+cells+by+nanosecond+pulsed+electric+field+%28nsPEF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectromagnetics%22%5BJournal%5D)">Long-lasting plasma membrane permeabilization in mammalian cells by nanosecond pulsed electric field (nsPEF).</a> Bioelectromagnetics. 28 (8), 655-663 (2007).</li>
<li>Lee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+ratiometric+optical+mapping+enables+high-resolution+cardiac+electrophysiology+in+pig+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo ratiometric optical mapping enables high-resolution cardiac electrophysiology in pig models.</a> Cardiovasc Res. 115 (11), 1659-1671 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo de 1,5 mL</td><td>Ratiolab&nbsp;</td><td>5615000</td><td></td></tr><tr><td>2 pocillos Nunc Lab-Tek II Chambered #1.5 Sistema de cubreobjetos alemán</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>155379</tr><tr><td>ADP305 Sonda de tensión diferencial</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AP015 Sonda de corriente</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A1113903</tr><tr><td>incubadora de CO2&nbsp;</td><td>PHCbi&nbsp;</td><td>MCO -230AICUV</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modifada' s Medio de crecimiento de glucosa medio</td><td>alto Sigma-Aldrich/Merck</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)</td><td>sondas potenciométricas</td><td>31795</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10131035</tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar</td><td>Iskra Pio&nbsp;</td><td>MC 15-2</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina&ndash; estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P07681</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-L-lisina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>P9155-5MG&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Generador de pulsos&nbsp;</td><td>Hecho a</td><td></td> medida <td>ver referencia11</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A1113803</tr><tr><td>T25 25cm&sup2; Matraz para cultivo de tejidos</td><td>TPP&nbsp;</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Tet-on spiking HEK</td><td>cells American Type Culture Collection ATCC</td><td>CRL-3479</td><td></td></tr><tr><td>Thunder Imager Live Cell system para microscopía de fluorescencia</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich/Merck</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>WavePro 7300A Osciloscopio</td><td>Teledyne LeCroy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

monitoreo de cambios inducidos por electroporación en la generación de potencial de acción en celdas hek de tet-on spiking diseñadas genéticamente

Monitoring Electroporation-Induced Changes in Action Potential Generation in Genetically Engineered Tet-On Spiking HEK cells

Los cambios en el TMV en células excitables in vitro desencadenados por pulsos eléctricos se pueden monitorear ópticamente con este protocolo, y las señales de fluorescencia se pueden analizar para extraer sus parámetros relevantes.
La configuración experimental se muestra en la Figura 1A. En la Figura 1B se muestra una señal típica de pulso eléctrico de 100 μs utilizada en los experimentos. Las células de las cámaras que se ...

Monitoreo de cambios inducidos por electroporación en la generación de potencial de acción en celdas HEK de Tet-On Spiking diseñadas genéticamente

Excitable cells such as&#160;neuronal and muscle cells can be primary targets in rapidly emerging electroporation-based treatments. However, they can be ...

monitoring-electroporation-induced-changes-action-potential

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Una sola célula de electroporación (SCE) es una técnica especializada que permite la entrega de ADN u otras macromoléculas en las células individuales en el tejido intacto, incluso en los preparativos vivo. Aquí detallamos el procedimiento para la SCE de un colorante fluorescente o de ADN plásmido en las neuronas en el cerebro intacto de los renacuajos Xenopus laevis.

La electroporación in vivo sola célula en el cerebro intacto desarrollo

Vamos a demostrar la forma de estudiar el efecto de un único punto de mutación en la función de un canal iónico.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

Cartílagos craneofaciales en estrecho contacto con otros tejidos, y son difíciles de manipular en animales vivos. Estamos utilizando electroporación para ofrecer herramientas moleculares durante el crecimiento del esqueleto craneofacial sin pasar por los primeros efectos de embriones. Este enfoque nos permite analizar de manera eficiente las moléculas...

Electroporación de mesénquima craneofacial

Fuente: Keener, D. G., et al. Electroporación unicelular a través de diferentes cultivos de cortes organotípicos de neuronas inhibidoras excitadoras y específicas de clase del hipocampo de ratón. J. Vis. Exp. (2020).Este video demuestra el proceso de electroporación unicelular para introducir ADN plasmídico en las neuronas dentro de cultivos de cortes de hipocampo de ratón. El procedimiento implica un posicionamiento preciso de la pipeta, ajustes de presión y pulsos de electroporación para...

Expresión génica mediante electroporación unicelular en cultivos de cortes de hipocampo de ratón

En este video, los cultivos de células embrionarias de riñón que expresan proteínas de canal iónico dependientes de la luz fusionadas con un reportero fluorescente demuestran el efecto de la luz en el movimiento de los iones. La pinza de parche de celda completa se utiliza para monitorear el movimiento de iones.

Registro de electrofisiología optogenética de células con canales iónicos dependientes de la luz

Esta presentación demuestra un método mediante el cual la electroporación de células adherentes y cultivadas se utiliza para el estudio de la comunicación intercelular y de unión, mientras las células crecen en un portaobjetos recubierto con óxido de indio-estaño conductor y transparente.

Un ensayo funcional para Gap Junctional examen; La electroporación de células adherentes de indio-óxido de estaño

La electroporación se utilizó para insertar proteínas efectoras de virulencia bacteriana purificadas directamente en células eucariotas vivas. La localización de proteínas se monitorizó mediante microscopía de inmunofluorescencia confocal. Este método permite estudiar el tráfico, la función y las interacciones proteína-proteína utilizando proteínas exógenas activas, evitando la necesidad de expresión heteróloga en células eucariotas.

La electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero

Se describe un método para obtener imágenes de los cambios en el potencial de membrana utilizando indicadores de voltaje codificados genéticamente.

Membrana de imagen potencial con dos tipos de sensores de tensión fluorescentes genéticamente codificados

Aquí se presenta un protocolo para la electroporación unicelular que puede entregar genes en neuronas excitatorias e inhibitorias a través de un rango de edades in vitro de cultivo de rebanadas de hipocampo. Nuestro enfoque proporciona una expresión precisa y eficiente de genes en células individuales, que se pueden utilizar para examinar las funciones intercelulares y autónomas de la célula.

Electroporación Unicelular A Través De Diferentes Cultivos Organotípicos Slice De Ratón Excitatorio Hipocampal Y Neuronas Inhibitorias Específicas De Clase

Este protocolo describe las técnicas de microfabricación necesarias para construir un dispositivo de electroporación microfluídica de laboratorio en un chip. La configuración experimental realiza transfecciones controladas a nivel de una sola célula en un flujo continuo y se puede extender a rendimientos más altos con control basado en la población. Se proporciona un análisis que muestra la capacidad de monitorear eléctricamente el grado de permeabilización de la membrana celular en tiempo real.

La fabricación y operación de un sistema de microelectroporación de flujo continuo con detección de permeabilización

Aprende a monitorear cambios inducidos por electroporación en la generación de potenciales de acción utilizando células HEK Tet-On Spiking. Este método permite estudiar los efectos de la electroporación en células excitables de forma controlada.

Monitoreo de cambios inducidos por electroporación en la generación de potencial de acción en celdas HEK de Tet-On Spiking diseñadas genéticamente (Video) | JoVE Journal

Monitoreo de cambios inducidos por electroporación en la generación de potencial de acción en celdas HEK de Tet-On Spiking diseñadas genéticamente

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