Monitoreo de cambios inducidos por electroporación en la generación de potencial de acción en celdas HEK de Tet-On Spiking diseñadas genéticamente

La electroporación aumenta temporalmente la permeabilidad de la membrana celular por medio de pulsos eléctricos de alto voltaje. Existen varios tratamientos clínicos de rápido desarrollo basados en la electroporación que se dirigen a las células musculares y neuronales. Por lo tanto, es crucial investigar cómo la electroporación afecta la capacidad de estas células excitables para desencadenar potenciales de acción.

Los experimentos in vitro son muy importantes para comprender los efectos de la electroporación en células excitables. Sin embargo, los miocitos primarios y las neuronas tienen un perfil de expresión de canales iónicos muy complejo que hace que sea extremadamente difícil desentrañar la interacción entre la excitación y la electroporación. Desarrollamos un protocolo para monitorear los cambios inducidos por la electroporación en la generación de potencial de acción utilizando celdas HEK de pico tet-on.

Estas células expresan un complemento mínimo de canales de sodio y potasio que las hacen excitables. Por lo tanto, esta célula simplificó los experimentos y el análisis teórico de los resultados obtenidos. Utilizando nuestro protocolo, descubrimos que la electroporación muy leve ya puede afectar drásticamente la aceptabilidad de las células.

Estos resultados allanarán el camino para el desarrollo de modelos teóricos de electroporación y aceptabilidad celular, y esto ayudará a la comunidad a mejorar las terapias basadas en la electroporación que emergen rápidamente en el corazón, el cerebro y los músculos esqueléticos. Para comenzar, pipetee un mililitro de PBS en uno de los pocillos de los portaobjetos de la cámara de vidrio de dos pocillos. Agregue 10 microlitros de solución estéril de poli-L-lisina de un miligramo por mililitro y mezcle bien con una pipeta.

Incubar durante 1,5 horas a temperatura ambiente en condiciones estériles en una campana de flujo laminar, luego retirar el PBS con poli-L-lisina sin más lavado. Para sembrar las células, prepare una dilución de una a 10 de la solución madre de doxiciclina en un medio de cultivo en un tubo de 1,5 mililitros. Ahora, retire el medio de cultivo del matraz T-25.

Tripsinar las células con 2,5 mililitros de solución de tripsina EDTA en una incubadora de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante dos minutos. Añadir 2,5 mililitros de medio de cultivo fresco y pipetear suavemente las células para separarlas de la superficie. Calcular el volumen de la suspensión celular tripsinizada necesario para establecer el cultivo.

Reste el volumen de suspensión celular previamente calculado de 1.470 microlitros para calcular el volumen del medio de cultivo. Para preparar muestras con células S HEK excitables, pipetee el volumen calculado del medio de cultivo y la suspensión celular tripsinizada en un pocillo. Añadir 30 microlitros de la dilución de doxiciclina.

Mezcle bien pipeteando suavemente justo antes de colocar las cámaras en la incubadora de dióxido de carbono. Para la preparación de muestras con células NS HEK no excitables, pipetee el volumen calculado de medio de cultivo en un pocillo y añada el 90% del volumen calculado de suspensión celular para células S HEK sin doxiciclina. Incubar las cámaras en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante dos o tres días antes del experimento.

Antes del experimento, pipetee tres microlitros de solución potenciométrica de colorante en un tubo de 1,5 mililitros. Deje el tubo abierto a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar durante aproximadamente 15 minutos para permitir que el etanol se evapore y el tinte potenciométrico se seque, luego agregue 997 microlitros de medio de cultivo en frío a cuatro grados Celsius al tubo para disolver el tinte a una concentración final de 12 micromolares. A continuación, retire el medio de cultivo del pozo.

Agregue un mililitro de solución de tinte potenciométrico a las células. Refrigera las celdas a cuatro grados centígrados e incuba durante 20 minutos. Después, retira la solución de tinte potenciométrico y guárdala en un tubo para reutilizarla posteriormente en hasta seis experimentos secuenciales en un día.

Lave suavemente las células tres veces con la solución de tiro. Después del último lavado, pipetee un mililitro de solución de tirodio bajo en potasio en el pocillo. Para comenzar, prepare las celdas HEK para la electroporación, luego configure la sincronización de la entrega de impulsos con la adquisición de imágenes mediante una señal TTL del sistema de microscopio que activa el generador de pulsos.

En el fondo de la cámara, coloque dos electrodos de alambre paralelos de platino-iridio con un diámetro de 0,8 milímetros y una distancia de cinco milímetros entre los bordes interiores. Fije la cámara bajo el microscopio, luego conecte los electrodos al generador de pulsos. Usando una sonda de voltaje y corriente, conecte la salida del generador de pulsos a un osciloscopio para permitir la verificación de la entrega de pulsos correcta durante el experimento.

Enfoque las células en el campo claro y obtenga imágenes de las células situadas en el centro entre los electrodos. Adquiera 80 imágenes en modo time-lapse a una velocidad de al menos 25 fotogramas por segundo. Ilumine las celdas con una longitud de onda de excitación de 635 nanómetros, establezca el tiempo de exposición en 10 milisegundos y detecte la emisión a aproximadamente 700 nanómetros.

Después de la adquisición, espere dos minutos. Ajuste el voltaje en la interfaz del generador de pulsos a 63 voltios. Grabe un lapso de tiempo de la misma manera cada dos minutos.

Durante estas adquisiciones, aplique un solo pulso de 100 microsegundos en el momento de la adquisición de la décima imagen. Adquiera imágenes con voltajes de pulso de 63, 75, 88, 100, 125, 150, 175 y 200 voltios. Estime el campo eléctrico al que están expuestas las celdas como la relación entre el voltaje aplicado y la distancia del electrodo.

Para el análisis de datos, exporte las grabaciones de lapso de tiempo a formato TIFF y, a continuación, coloque todas las grabaciones de lapso de tiempo de los voltajes aplicados de un experimento individual en una sola carpeta. Cambie el nombre de cada grabación time-lapse para que MATLAB pueda reconocer el campo eléctrico. Para la adquisición al principio del experimento, donde no se aplica ningún pulso, cámbiele el nombre con la frase 000Vcm.

A continuación, abra la aplicación descargada de GitHub. Haga clic en Seleccionar carpeta de datos" para elegir la carpeta que contiene las grabaciones de lapso de tiempo de un experimento. Para seleccionar los píxeles, utilice dos controles deslizantes para determinar el umbral bajo para obtener una imagen clara de las membranas y el umbral alto para eliminar los residuos del análisis.

Ahora, haga clic en Analizar datos. En la pestaña "Análisis", aparecerá una tabla con los parámetros extraídos. En el lado derecho de la tabla, se mostrarán gráficos de fluorescencia relativa a lo largo del tiempo para cada campo eléctrico utilizado.

Seleccione los gráficos para un campo eléctrico dado en el menú desplegable en el lado izquierdo sobre la tabla. Examine todos los gráficos y realice la corrección manual en caso de detección de picos falsos. seleccione Borrar picos AUTO" en la parte inferior de la pestaña Análisis" para borrar los picos detectados automáticamente.

Haga clic en el gráfico para determinar manualmente un nuevo punto de hora punta. Si es necesario, seleccione Volver a ejecutar la detección automática de picos" en la parte inferior de la pestaña Análisis" para volver a realizar la detección automática de picos. Los parámetros extraídos ahora se ajustarán al nuevo pico.

Luego, seleccione Exportar datos" en la parte inferior derecha de la pestaña Análisis" para exportar datos a la misma carpeta que un archivo de mapa de puntos, un archivo de hoja de cálculo e imágenes PNG para cada campo eléctrico utilizado. Los pulsos eléctricos de 126 voltios por centímetro desencadenaron múltiples picos de fluorescencia en las células excitables, como lo demuestran las distintas oscilaciones en el cambio de fluorescencia con el tiempo. Con el aumento de la intensidad del campo eléctrico, la respuesta cambió y exhibió una despolarización sostenida a 400 voltios por centímetro.

Las celdas no excitables no mostraron picos significativos en respuesta a las intensidades de campo eléctrico más bajas, lo que indica que no hubo excitación. A intensidades de campo eléctrico más altas, las celdas no excitables también exhibieron una despolarización sostenida, lo que indica electroporación. El número máximo de picos en las celdas excitables se observó a 150 voltios por centímetro, con una tendencia decreciente en el número de picos a medida que el voltaje aumentaba más allá de este punto.