Name: Protocolo para cultivos de explantes de gliomas difusos de bajo grado con mutación en IDH1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Aprende a cultivar explantes de gliomas difusos de bajo grado con mutación IDH1 mediante un método no enzimático que mantiene la expresión proteica y permite cultivos a largo plazo para investigación oncológica.

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Los fragmentos tumorales utilizados aquí forman parte de la colección de NEUROLOGÍA de muestras de tejido fresco mantenida por el Centro de Recursos Biológicos del Hospital Universitario de Montpellier (CRB@chu-montpellier.fr). Esta investigación se llevó a cabo en el marco del proyecto titulado "Gliomacult: Caracterización y cultivos primarios de gliomas de bajo grado", dirigido por el Prof. J. P. Hugnot (Proyecto No. RECH/P722/1-5). Este trabajo contó con el apoyo de La Ligue contre le cancer, ARC (Asociación para la Investigación del Cáncer), ARTC, ARTC SUD, Les Etoiles dans la mer, EMBALL'ISO, Région Occitanie, INCA. K.A.C cuenta con el apoyo del Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología (CONAHCYT), México, y la Asociación para la Investigación de Tumores Cerebrales (ARTC), Francia.

Los fragmentos tumorales utilizados en este protocolo se obtuvieron de una colección bien caracterizada y aprobada éticamente, con el consentimiento del paciente. Esta investigación se realizó bajo el proyecto titulado Gliomacult: Caracterización y Cultivos Primarios de Gliomas de Bajo Grado (Número de Proyecto RECH/P722/1-5) y fue aprobada por el consejo científico del biobanco de tumores el 28 de agosto de 2023.
1. Preparación de placas de cultivo
NOTA: Realice estos pasos bajo una campana de flujo laminar de cultivo celular estéril.
<ol>
	<li>Al menos 1 h antes del cultivo, prepare placas de 24 pocillos recubiertas con poli-D-lisina (PDL) y laminina.
	<ol>
		<li>Diluya 10 mg de polvo de PDL en 100 mL de tampón de borato (pH 8,4) para obtener una concentración final de 100 µg/mL. Una vez disuelto, filtre la solución (0,22 µm) para esterilizarla. El PDL ya está listo para usar; prepare alícuotas de 3 mL y almacénelas a -20 °C.</li>
		<li>Descongele el tubo de laminina de 1-2 mg/mL a 4 °C para evitar la formación de gel. Prepare alícuotas de 50 µL y almacénelas a -20 °C. 
		NOTA: Se debe evitar repetir los ciclos de descongelación y congelación.</li>
		<li>Recubrimiento de placas
		<ol>
			<li>Paso opcional: coloque cubreobjetos estériles de Ø 13 mm, adecuados para placas de cultivo celular, en una placa de 24 pocillos, un cubreobjetos por pocillo. 
			NOTA: Este paso es para realizar inmunotinciones adicionales de los explantes de glioma.</li>
			<li>Para el recubrimiento de los pocillos, mezcle 3 mL de la solución de PDL en 9 mL de PBS 1x y añada 50 µL de laminina. Añada 500 µL de esta solución a cada pocillo para obtener una concentración de recubrimiento de 1-2 µg/cm². Incube las placas recubiertas a temperatura ambiente, preferiblemente con agitación lenta (15 RPM), durante al menos 1 h.</li>
			<li>Inmediatamente antes del cultivo, retire la solución de PDL-laminina y lave dos veces con PBS 1x estéril. 
			NOTA: No permita que los pocillos se sequen.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Medios
<ol>
	<li>Cultive explantes con mutación IDH1 en un medio definido que consiste en DMEM/F12 suplementado con L-glutamina, junto con una mezcla de reemplazo del suero que incluye N2 y B27 sin vitamina A. Utilice antibióticos, como ciprofloxacino, gentamicina y fungina, para prevenir la contaminación bacteriana y fúngica. Además, incorpore factores de crecimiento como heparina, EGF y FGF2 al medio, filtre el medio (0,2 µm) y almacénelo hasta por 2 semanas a 4 °C. 
	NOTA: Para obtener más detalles sobre los componentes del medio y su preparación, consulte Tabla 1 y la Tabla de Materiales.</li>
</ol>
3. Preparación de los explantes
<ol>
	<li>Antes del procesamiento de la muestra, prepare el área de trabajo y las herramientas estériles como se muestra en Figura 1A. Sanitice una bolsa de enfriamiento rociándola con etanol al 70%. Esterilice las tijeras y pinzas sumergiéndolas en etanol al 70% y enjuagándolas con PBS.</li>
	<li>Transfiera inmediatamente la resección tumoral para su cultivo sobre hielo, idealmente dentro de las 2 h posteriores a la extracción quirúrgica (Figura 1B). 
	NOTA: La muestra tumoral debe tener un diámetro mínimo de 9-10 mm para garantizar mejores resultados. El tejido se transporta sin medio de cultivo, ya que este método es preferido para fines histológicos. La ausencia de líquido evita la formación de cristales de hielo durante la congelación rápida, preservando así la integridad del tejido para un examen histológico posterior si fuera necesario.</li>
	<li>Coloque el cultivo con la muestra tumoral sobre la bolsa de enfriamiento y enjuáguelo suavemente con PBS 1X para eliminar el exceso de sangre.</li>
	<li>El tumor resecado suele presentar un tamaño considerable y heterogeneidad, compuesto por masa tumoral, tejido infiltrado y componentes no tumorales (Figura 1C). Seleccione porciones con color grisáceo y textura blanda o similar a gelatina para el aislamiento de células tumorales, ya que tienden a contener mayor cantidad de células tumorales. Por el contrario, evite las regiones duras y blancas, ya que pueden contener menos células tumorales adecuadas para el cultivo (Figura 1D), así como las áreas ennegrecidas, que probablemente sean resultado de electrocoagulación y podrían no proporcionar resultados confiables para el análisis.</li>
	<li>Transfiera las muestras seleccionadas a un microtubo de 1,5 mL o un criovial para su picado. Añada 1 mL de medio estéril al microtubo de 1,5 mL o al criovial y corte la muestra con las tijeras estériles hasta obtener fragmentos pequeños (1-2 mm3). 
	NOTA: Se necesitan aproximadamente 1-2 min de picado para obtener fragmentos diminutos, generalmente de tamaño 1-2 mm3 (Figura 1E).</li>
	<li>Con tijeras estériles, corte cuidadosamente el extremo de una punta azul de pipeta de 1.000 µL para crear una abertura ancha, de aproximadamente 3-4 mm de diámetro. Utilizando esta punta modificada, aspire 50-200 µL de los fragmentos de tejido picado y distribúyalos uniformemente en cada pocillo. Dado que los fragmentos más pequeños tienden a sedimentar rápidamente, rehomogenice suavemente la suspensión en cada pocillo para asegurar una distribución uniforme. 
	​NOTA: Evite la sobrecarga y mantenga un equilibrio, sin introducir un número excesivo de fragmentos en cada pocillo (Figura 1F).</li>
	<li>Incube los fragmentos tumorales a 37°C en una incubadora con 5% de CO2 y humedad al 100%. Cambie el medio cada día si la actividad metabólica del tumor (indicada por el enrojecimiento rápido del medio) y la cantidad de fragmentos en cada pocillo lo requieren. Durante los cambios de medio, tenga cuidado al aspirar delicadamente el medio usando una pipeta equipada con una punta de 200 µL, asegurándose de no perturbar los fragmentos tumorales adheridos.</li>
</ol>
<img alt="Proceso de preparación del tejido tumoral; configuración del equipo; muestras de tejido; resultados del centrifugado; gráfico de análisis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67260/67260fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Procedimiento de cultivo de explantes tumorales. Se obtuvo una resección de glioma difuso de bajo grado de un paciente de 44 años diagnosticado con astrocitoma grado II según la clasificación de la OMS 2021. El tumor presentaba una mutación en IDH1 (exón 4 c.395 G&gt;A, p.Arg132His) y una mutación en TP53 (exón 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis), junto con la ausencia de tinción de ATRX. No se detectaron mutaciones en los sitios de unión Ets/TCF (C250T y C228T) del gen TERT. (A) La superficie de trabajo comprende una bolsa fría, que proporciona un entorno que minimiza la degradación de la muestra y mantiene la viabilidad de los componentes biológicos. Estas precauciones son importantes para preservar la calidad e integridad del tejido. (B) El transporte de la muestra desde el hospital hasta el laboratorio debe realizarse sobre hielo. (C) Fragmento de resección tumoral. Las flechas indican las partes más adecuadas para el cultivo. (D) Se realiza la disección del tumor para seleccionar la parte más relevante que será picada. Según nuestra experiencia, la sustancia blanca generalmente tiene menos probabilidades de generar explantes exitosos. (E) Fragmentos tumorales de aproximadamente 1-2 mm³ de diámetro en un tubo de 15 mL tras ser picados mecánicamente con tijeras. (F) Se muestra la cantidad de fragmentos tumorales necesarios para la siembra adecuada en pozos de una placa de 24 pozos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67260/67260fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
4. Criopreservación y descongelación del tejido tumoral picado
NOTA: La criopreservación garantiza una copia de seguridad en caso de contaminación y pérdida de cultivos de explantes o para procesar las muestras tumorales en un momento posterior.
<ol>
	<li>Criopreservación: Prepare el medio de congelación (solución al 20% v/v de DMSO) añadiendo 2 mL de DMSO a 8 mL de medio de cultivo celular.</li>
	<li>Combine un volumen de la suspensión de tumor triturado con un volumen igual del medio de congelación al 20% de DMSO para obtener una concentración final del 10% de DMSO. Pipetee cuidadosamente la mezcla hacia arriba y hacia abajo para asegurar una mezcla completa, luego distribuya aproximadamente 1 mL en viales criogénicos.</li>
	<li>Transfiera rápidamente los viales criogénicos a un recipiente criogénico para reducir gradualmente la temperatura, seguido de una incubación nocturna a -80 °C antes del almacenamiento final en nitrógeno líquido. 
	NOTA: Este paso debe realizarse inmediatamente después de colocar las células en el medio de congelación, ya que ciertos crioprotectores, como el DMSO, pueden ser dañinos si las células están expuestas a ellos a temperatura ambiente durante más tiempo del necesario.</li>
	<li>Descongelación: Saque los viales criogénicos del nitrógeno líquido y colóquelos inmediatamente en un baño de agua a 37 °C hasta que alrededor del 80% de las células se hayan descongelado.</li>
	<li>Para eliminar el DMSO, pipetee rápidamente la suspensión en un tubo cónico de 15 mL que contenga 5 mL de PBS 1x precalentado y centrifugue a 300 × g durante 5 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y repita el lavado con PBS 1X seguido de centrifugación (paso 4.5). Aspire el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el botón celular, y añada la cantidad adecuada de medio para transferir a una placa de 24 pocillos recubierta con PDL-Laminina y coloque en el incubador.</li>
	<li>Después de 24 h, verifique que las células se hayan adherido. Después de unos días, elimine los fragmentos no adherentes reemplazando el medio de cultivo.</li>
</ol>
5. Pase de la cultura
NOTA: Una vez establecidos, los explantes pueden utilizarse para videomicroscopía o inmunotinción. Alternativamente, si las células tumorales han migrado fuera del explante y presentan un aspecto saludable, el explante puede ser pasado mediante disociación enzimática y resembrado en pocillos para experimentos posteriores. Sin embargo, es importante tener en cuenta que este protocolo no está diseñado para pasajes repetidos. Por lo general, solo se puede realizar un único pasaje antes de que las células tumorales entren en senescencia o mueran. No todos los cultivos de explantes darán lugar a un pasaje exitoso.
<ol>
	<li>Para el pase, retire el medio antiguo, lave con PBS 1X y agregue (125 µL) de tripsina-EDTA al 0,05 % a los pocillos e incube durante 3-4 min a 37 °C, seguido por la adición de 6,5 µL de inhibidor de tripsina, 12 µL de CaCl2 20 mM (dilución final a 2 mM) y 1 µL de DNasa I. 
	NOTA: El tiempo de incubación necesario para la disociación puede variar según el cultivo. Es importante verificar si las células se han desprendido después de al menos 3 min. Por lo general, el explante puede no disociarse completamente en una suspensión de células individuales, y a menudo se conservan pequeños cúmulos, que pueden generar nuevos cultivos de explantes.</li>
	<li>Con una pipeta p1000 ajustada a 500-600 µL, realice un lavado suave para desagregar los explantes. Evite la formación de burbujas.</li>
	<li>Agregue 5 mL de PBS 1X y centrifugue durante 5 min a 300 × g. Aspire el sobrenadante, resuspenda el sedimento en medio fresco precalentado y cuente para siembra.</li>
	<li>Identifique los cultivos con potencial para generar líneas celulares observando las células en división bajo un microscopio de contraste de fases. Estas células en división suelen tener una morfología redondeada y cromosomas visibles, como se muestra en Figura 2A.</li>
</ol>

<ol><li>Dasgupta, P., Balasubramanyian, V., De Groot, J. F., Majd, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+low-grade+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of low-grade gliomas.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 596(2023).</li>
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<li>Suva, M. L., Tirosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glioma+stem+cell+model+in+the+era+of+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The glioma stem cell model in the era of single-cell genomics.</a> Cancer Cell. 37 (5), 630-636 (2020).</li>
<li>Augustus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+CRYAB%2B+KCNN3%2B+SOX9%2B+astrocyte-like+and+EGFR%2B+PDGFRA%2B+OLIG1%2B+oligodendrocyte-like+tumoral+cells+in+diffuse+idh1-mutant+gliomas+and+implication+of+NOTCH1+signalling+in+their+genesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Identification of CRYAB+ KCNN3+ SOX9+ astrocyte-like and EGFR+ PDGFRA+ OLIG1+ oligodendrocyte-like tumoral cells in diffuse idh1-mutant gliomas and implication of NOTCH1 signalling in their genesis.</a> Cancers (Basel). 13 (9), 2107(2021).</li>
<li>Hubert, C. G., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+explants+as+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived explants as tumor models.</a> Cancer Cell. 40 (4), 348-350 (2022).</li>
<li>Abdullah, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+patient-derived+organoid+models+of+lower-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Establishment of patient-derived organoid models of lower-grade glioma.</a> Neuro Oncol. 24 (4), 612-623 (2022).</li>
<li>Yuzhakova, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+3d+tumor+spheroid+model+from+the+patient%27s+glioblastoma+cells+and+its+study+by+metabolic+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sovrem+Tekhnologii+Med%22%5BJournal%5D)">Development of a 3d tumor spheroid model from the patient's glioblastoma cells and its study by metabolic fluorescence lifetime imaging.</a> Sovrem Tekhnologii Med. 15 (2), 28-38 (2023).</li>
<li>Kloosterman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+microglia+across+contexts+of+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Morphology of microglia across contexts of health and disease.</a> Cell. 187, 5336-5356.e30 (2024).</li>
<li>Thomas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2021+updates+to+the+World+Health+Organization+classification+of+adult-type+and+pediatric-type+diffuse+gliomas%3A+A+clinical+practice+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">2021 updates to the World Health Organization classification of adult-type and pediatric-type diffuse gliomas: A clinical practice review.</a> Chin Clin Oncol. 12 (1), 7(2023).</li>
<li>Azar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+characterization+of+IDH1-mutated+diffuse+low+grade+gliomas+reveals+tumor+heterogeneity+and+absence+of+EGFR%2FPDGFRalpha+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular characterization of IDH1-mutated diffuse low grade gliomas reveals tumor heterogeneity and absence of EGFR/PDGFRalpha activation.</a> Glia. 66 (2), 239-255 (2018).</li>
<li>Bhaduri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+radial+glia-like+cancer+stem+cells+contribute+to+heterogeneity+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Outer radial glia-like cancer stem cells contribute to heterogeneity of glioblastoma.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 48-63.e6 (2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

El desarrollo de modelos in vitro y preclínicos para gliomas de bajo grado con mutación en IDH1 es particularmente difícil debido al crecimiento lento de estos tumores y a la complejidad de replicar las extensas alteraciones genómicas y epigenómicas causadas por la mutación en IDH. Además, estas células tumorales infiltrativas interactúan activamente con células circundantes, incluyendo células inmunitarias, endoteliales, gliales y neuronales, posiblemente dependiendo de ellas para su supervivencia. Esta compleja interac...

Los gliomas difusos son los tumores cerebrales primarios más frecuentes. Estos tumores son actualmente incurables a pesar de un tratamiento muy intenso (cirugía, radio y quimioterapia)1. Cada vez hay más pruebas que apoyan la hipótesis de que la gliomagénesis se origina a partir de células madre adultas o progenitoras gliales residentes en el cerebro2. Aunque los glioblastomas representan el tipo más agresivo, los gliomas difusos de bajo grado (DLGG, tumores de grado 2) también son prevalentes (15% de los gliomas difusos)1,3. Las DLGGs crecen lentamente y migran a lo largo de los tractos de sustancia blanca, un sello distintivo de esta neoplasia 'difusa'4. Estas DLGG muy a menudo se repiten a pesar del tratamiento, progresando finalmente a neoplasias malignas de alto grado (grados 3 y 4)5.
DLGG se caracterizan por una mutación de cambio de sentido en el gen de la isocitrato deshidrogenasa 1 o 2 (IDH1 o IDH2), lo que resulta en la producción aberrante del oncometabolito 2-hidroxiglutarato (2HG). Esto interrumpe la diferenciación celular a través de desregulaciones epigenéticas6. Los gliomas con mutaciones en IDH1 se clasifican a su vez en subtipos: los astrocitomas suelen tener mutaciones en ATRX y P53, mientras que los oligodendrogliomas se caracterizan por deleciones 1p19q7. Estos tumores exhiben una heterogeneidad de células tumorales. La secuenciación del ARN de una sola célula y la inmunocaracterización han revelado una población diversa de células tumorales, que muestran fenotipos similares a las células madre, a los astrocitos y a los oligodendrocitos dentro de estos tumores8,9.
En contraste con el glioblastoma, que se beneficia de cultivos y líneas celulares fácilmente disponibles a largo plazo, existe una notable escasez de herramientas celulares diseñadas para investigar tumores con mutaciones en IDH11. Esto presenta un obstáculo importante para avanzar en el desarrollo terapéutico y profundizar nuestra comprensión de la gliomagénesis y la progresión de la enfermedad con mutación IDH1. Las líneas celulares tradicionales cultivadas en suero, aunque se utilizan durante mucho tiempo, replican inadecuadamente los tumores originales, mostrando perfiles transcripcionales alterados. Alternativamente, las condiciones de cultivo sin suero, ya sea en modelos tumoroides 2D o 3D, preservan de manera más efectiva los perfiles transcripcionales de las células tumorales y sus fenotipos in vivo, como la invasión en el tejido cerebral normal10,11.
Además, los cultivos celulares a corto plazo derivados de la muestra quirúrgica de un paciente preservan el perfil molecular y la diversidad celular del tumor, representando así mejor los rasgos biológicos de los tumores en comparación con las líneas celulares12. En este artículo, presentamos un método sencillo no enzimático para el cultivo de gliomas difusos de bajo grado con mutación IDH1 como explantes derivados de resecciones de pacientes frescas o congeladas, con el objetivo de abordar la necesidad de modelos in vitro mejorados para la investigación y el desarrollo terapéutico del glioma. También ofrecen el potencial de derivar líneas celulares con mutaciones IDH1.

<table><tbody><tr><td>Anti-ASCL1</td><td>BD Pharmingen&trade;</td><td>556604</td><td>Dilución 1:500</td></tr><tr><td>Anti-ATRX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>HPA001906 Dilución 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD68</td><td>Agilent</td><td>M081401-2</td><td>Dilución 1:500</td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Aves Labs</td><td>AB_2313547</td><td>Dilución 1:500</td></tr><tr><td>Anti-IBA1</td><td>Anticuerpos Fujifilm Wako</td><td>019-19741</td><td>Dilituion 1:1000</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-IDH1 (R132H) de ratón</td><td>Dianova</td><td>DIA-H09</td><td></td></tr><tr><td>Anti-KI67</td><td>BD Pharmingen&trade;</td><td>556003</td><td>Dilituion 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-OLIG1</td><td>R& D Sistemas&reg;</td><td>AF2417</td><td>Dulituion 1:300</td></tr><tr><td>Anti-OLIG2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN50</td><td>Dilución 1:250</td></tr><tr><td>Anti-SOX9</td><td>Abcam&reg;</td><td>EPR14335-78</td><td>Dilución 1:100</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50x), menos vitamina A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>CiteAb</td><td>A-421-100</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacina HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1044-1G</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning&reg;</td><td>432000</td><td>Contenedor de congelación de células, para viales criogénicos de 12 x 1 mL o 2</td></tr><tr><td>mL Cubreobjetos &Oslash;, 13 mm</td><td>Karl Hecht&trade; Asistencial&comercio;</td><td></td><td></td>328017</tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, sin glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish</td><td>Corning&reg;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>Falcon 24-well Clear Flat Bottom Corning</td><td>&reg;</td><td>353047</td><td>Placa de cultivo celular multipocillo tratada con TC, con tapa, estéril&nbsp;</td></tr><tr><td>Hongo</td><td>InvivoGen</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>EGF humano</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>FGF humano-básico</td><td>PeproTech</td><td>100-18B-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplemento (100x )</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>Serum acrodisc 37 mm filtro de jeringa con GF/0.2 y micro; m Supor</td><td>PALL Corporation</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de tripsina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Z1 Apotome 3 Microscopio</td> de epifluorescencia <td>Zeiss</td><td></td><td>de campo amplio recto</td></tr></tbody></table>

protocolo para cultivos de explantes de gliomas difusos de bajo grado con mutación en idh1

A Protocol for Explant Cultures of IDH1-mutant Diffuse Low-grade Gliomas

Los gliomas difusos, los tumores cerebrales primarios más prevalentes, se clasifican en grados bajos y altos en función de criterios histopatológicos y mutaciones genéticas. Los gliomas difusos de grado bajo constituyen un subgrupo, que afecta predominantemente a adultos jóvenes y predispone a gliomas de grado alto. Hay dos tipos principales de gliomas difusos de grado bajo: los astrocitomas y los oligodendrogliomas, cada uno definido por características genéticas e histológicas distintas. Estos tumores exhiben característicamente una variante mutada de la enzima metabólica IDH1, que interrumpe la diferenciación celular. Son heterogéneas y comprenden tanto células madre proliferativas como células gliales más diferenciadas y quiescentes. 
Los modelos tumorales in vitro específicos del paciente tienen un potencial significativo para desentrañar los mecanismos oncogénicos y adaptar la selección de fármacos para una terapia personalizada. Sin embargo, la ausencia de modelos in vitro fiables específicos para los gliomas de bajo grado con mutación en IDH1 ha dificultado la investigación fundamental y traslacional. Aquí, presentamos un método simple para cultivar tumores con mutación IDH1 como explantes en medios definidos sin necesidad de disociación enzimática. Estos explantes pueden mantenerse durante períodos prolongados, manteniendo la expresión de la proteína mutante IDH1, así como marcadores para células progenitoras de oligodendrocitos como ASCL1 (MASH1), OLIG1 y OLIG2 y para astrocitos (GFAP, SOX9). También se pueden establecer a partir de tumores congelados en DMSO. Estos cultivos pueden servir como una plataforma valiosa para la detección de fármacos, la videomicroscopía y los estudios genéticos, lo que facilita los avances en la comprensión y el tratamiento de estos tumores difíciles. También ofrecen el potencial de derivar líneas celulares con mutaciones IDH1.

Después de unos días, algunos fragmentos tumorales se adherirán a las superficies de las pocilas, iniciando la migración celular a partir de los explantes. El tiempo entre el cultivo inicial y la aparición de células tumorales en crecimiento varía según la muestra. Los cultivos iniciales suelen contener una cantidad considerable de restos celulares, lo que dificulta evaluar la presencia de células viables. Por consiguiente, el cultivo debe mantenerse durante un mínimo de 4 semanas. Una vez que las células comienzan a cre...

Los gliomas difusos de bajo grado con mutación IDH1 son tumores raros y difíciles de cultivar. Presentamos un método simple de explante no enzimático que preserva la expresión de la proteína mutante IDH1 y mantiene los cultivos durante meses. Es importante destacar que esta técnica funciona con tumores criopreservados, lo que ofrece un recurso valioso para la investigación del glioma.

Protocolo para cultivos de explantes de gliomas difusos de bajo grado con mutación en IDH1

Diffuse gliomas, the most prevalent primary brain tumors, are categorized into low and high grades based on histopathological criteria and genetic ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este video demuestra el proceso de aislar y cultivar células progenitoras gliales de glioma pontino intrínseco difuso, o tejido del tronco encefálico afectado por DIPG. Las células gliales aisladas del tejido tumoral mediante digestión enzimática se cultivan en un medio neurobasal, lo que promueve su crecimiento y el desarrollo de neuroesferas que flotan libremente.

Aislamiento y cultivo de células del glioma pontino intrínseco difuso

Las gliomas malas constituyen un grupo heterogéneo de neoplasmas glial altamente infiltrativos con las características clínicas y moleculares distintas. Los xenografts orthotopic primarios recapitulan las características histopatológicas y moleculares de los subtipos malos de la glioma en modelos animales preclínicos.

Xenoinjertos de glioma ortotópico primario Recapitulan el crecimiento infiltrativo y la mutación de la isocitrato deshidrogenasa I

Protocolo para la propagación de muestras quirúrgicas de glioma de alto grado disociadas en medio de neuroesfera sin suero para seleccionar células con fenotipo de células madre cancerosas. Para los especímenes que no pueden crecer como neuroesferas, se sugiere un protocolo alternativo. Una técnica de incrustación de la parafina para mantener la arquitectura 3D de la neuroesfera para el immunocytochemistry se describe.

Optimización Del Cultivo Celular De Glioma De Alto Grado De Muestras Quirúrgicas Para Su Uso En Modelos Animales Clínicamente Relevantes E Inmunoquímica 3D

Se presenta aquí un método sencillo para el aislamiento y análisis de citometría de flujo de células mononucleares de sangre periférica de glioma infiltrantes que produce datos cuantitativos dependientes del tiempo sobre el número y el estado de activación de las células inmunes que entran en el microambiente tumoral temprano del cerebro.

El aislamiento y la citometría de flujo análisis de las células mononucleares de sangre periférica Glioma infiltrantes

Este protocolo describe un método para el rápido procesamiento de las muestras difusas pontina glioma intrínseco post mortem para la creación de modelos de cultivos celulares derivados de pacientes o la caracterización directa de las células tumorales y microambientales.

Un protocolo para la rápida post-mortem de cultivos celulares de glioma pontino intrínsecos difusos (DIPG)

Este estudio introduce y describe protocolos para derivar dos organoides neuronales humanos específicos como un modelo relevante y preciso para el estudio de 1) desarrollo de glioblastoma humano dentro de organoides neuronales humanos exclusivamente en humanos y 2) neurona dopaminérgica diferenciación que genera un organoide tridimensional.

Organoides neuronales humanos para el estudio del cáncer cerebral y las enfermedades neurodegenerativas

Aquí presentamos un sistema de cultivo monocapa mixto ex-vivo para el estudio de la migración de células de glioma humano (hGC) en tiempo real. Este modelo proporciona la capacidad de observar interacciones entre hGCs y axones mielinados y no mielinizados dentro de una cámara compartimentada.

Monitoreo en tiempo real de la migración de células de glioma humano en cocultivos de axón-oligodendrocitos de ganglios de raíz dorsal

Este estudio presenta un protocolo de inmunocitoquímica de células vivas en 3D aplicado a una línea celular de glioma difuso de línea media pediátrico, útil para estudiar en tiempo real la expresión de proteínas en la membrana plasmática durante procesos dinámicos como la invasión y migración de células 3D.

Ensayos de inmunocitoquímica de células 3D vivas del glioma difuso de línea media infantil

La desregulación proteómica juega un papel importante en la propagación de gliomas infiltrantes difusos, pero varias proteínas relevantes permanecen sin identificar. El procesamiento espacial digital (DSP) ofrece un enfoque eficiente y de alto rendimiento para caracterizar la expresión diferencial de proteínas candidatas que pueden contribuir a la invasión y migración de gliomas infiltrativos.

Perfil espacial digital para la caracterización del microambiente en glioma infiltrante difuso de tipo adulto

Aquí, describimos un método para generar organoides de glioblastoma (GBM) a partir de muestras primarias de pacientes o cultivos celulares derivados de pacientes y mantenerlos hasta la madurez. Estos organoides GBM contienen poblaciones celulares fenotípicamente diversas y recrean microambientes tumorales ex vivo.

Mantenimiento de la diversidad celular del glioblastoma humano ex vivo mediante cultivo de organoides tridimensionales

Aprende a cultivar explantes de gliomas difusos de bajo grado con mutación IDH1 mediante un método no enzimático que mantiene la expresión proteica y permite cultivos a largo plazo para investigación oncológica.

Protocolo para cultivos de explantes de gliomas difusos de bajo grado con mutación en IDH1

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