Protocolo para cultivos de explantes de gliomas difusos de bajo grado con mutación en IDH1

En nuestro laboratorio, nos enfocamos en el tipo raro de tumores cerebrales que se llaman gliomas difusos de bajo grado. Estos gliomas suelen afectar a adultos jóvenes y se caracterizan por una mutación en el gen llamada IDH-1. Los principales avances en el campo de los gliomas son, en primer lugar, el uso de modelos 3D, como tumoroides u organoides, en segundo lugar, el uso de imágenes directamente en el cerebro de ratones trasplantados con gliomas, y en tercer lugar, el uso de ARN transcriptómico especial y unicelular.

El principal reto al que nos enfrentamos cuando trabajamos con gliomas con mutación IDH-1 es la baja proliferación de estas células y su dificultad para mantenerse en cultivo, por lo que hemos derivado y definido un protocolo para mantener vivas las células, y para algunas de ellas, hemos podido derivar una línea celular, Pero no para todos los pacientes. Al estudiar las células mutantes IDH-1 in vitro, pero también in vivo, hemos encontrado que estas células son bastante plásticas, y pueden adoptar el destino de dos células, ya sea como un astrocito o como un óvalo, y también hemos encontrado que el empuje está jugando un papel importante en esta plasticidad. Con este nuevo protocolo de explante, hemos sido capaces de mantener las células mutantes IDH-1 in vitro durante semanas, pero aún más, durante meses, y hemos demostrado que hay diferentes tipos de células tumorales, según comprobamos en pacientes.

También hemos encontrado que hay algunas células del entorno tumoral, como las células microgliales, que permiten estudiar la interacción entre las células tumorales y su entorno, por lo que estos modelos ofrecen una representación más precisa de la diversidad biológica que se encuentra en los tumores. Para comenzar, prepare el espacio de trabajo y organice todas las herramientas esterilizadas. Transfiera la resección tumoral a hielo para preservar la viabilidad del tejido para el cultivo.

Examinar la resección tumoral para determinar el tamaño y la heterogeneidad. Seleccione partes que muestren un color gris con una textura suave o gelatinosa, ya que estas áreas son ricas en células tumorales. Transfiera las muestras tumorales seleccionadas a un microtubo de 1,5 mililitros o criovial y agregue un mililitro de medio.

Con unas tijeras estériles, corte las muestras en trozos pequeños de uno a dos milímetros cúbicos. A continuación, con unas tijeras estériles, recorte el extremo de la punta de una pipeta de 1.000 microlitros para crear una abertura amplia de aproximadamente tres o cuatro milímetros de diámetro. Pipetear de 100 a 200 microlitros de los fragmentos de tejido picado con una punta cortada en pocillos de una placa.

Rehomogeneice suavemente la suspensión para asegurar una distribución uniforme, ya que los fragmentos más pequeños tienden a asentarse rápidamente. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono y 100% de humedad. Reemplace el medio diariamente si la actividad metabólica del tumor causa un amarillamiento rápido o si la densidad del fragmento lo requiere.

Para empezar, obtenga la suspensión de tejido tumoral picado. Para la preparación del medio de congelación, agregue dos mililitros de DMSO a ocho mililitros de medio de cultivo celular. Combine un volumen de la suspensión tumoral picada con un volumen igual del medio de congelación preparado al 20% de DMSO.

Pipetee con cuidado la mezcla hacia arriba y hacia abajo para asegurar una mezcla completa. Transfiera rápidamente los crioviales a un recipiente criogénico para facilitar la reducción gradual de la temperatura, luego incube durante la noche a menos 80 grados Celsius antes de transferirlos a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Para descongelar, retire los crioviales del nitrógeno líquido y colóquelos inmediatamente en un baño de agua a 37 grados centígrados.

Caliéntelos hasta que aproximadamente el 80% de las células se hayan descongelado. Para eliminar el DMSO, transfiera rápidamente la suspensión a un tubo de centrífuga de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de PBS 1X precalentado y centrifugue el tubo a 300 g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y repita el lavado con PBS, seguido de la centrifugación.

Aspire el sobrenadante, asegurándose de que el pellet permanezca intacto. Vuelva a suspender el pellet en una cantidad adecuada de medio y transfiéralo a una placa de 24 pocillos PDL Laminin prerrevestida. Incubar la placa a 37 grados centígrados.

Se observó el crecimiento de células con morfologías alargadas, bipolares o multipolares a partir de explantes tumorales adheridos a la superficie del pocillo después de una duración mínima de cultivo de cuatro semanas. Las células derivadas de tumores exhibieron una morfología comparable entre los tumores frescos y criopreservados en tres casos, como lo demuestran las apariencias alargadas y bipolares que forman redes intrincadas. Se observó claramente la migración radial de la célula derivada del tumor a lo largo de la fibra.

Los cultivos de explantes no exitosos mostraron fragmentos no adherentes y numerosas células de Gitter, caracterizadas por autofluorescencia y contenido de lípidos.