Control espacio-temporal de la actividad proteica a través de la regulación alostérica optogenética
4 de octubre de 2024
Este protocolo describe la aplicación de un dominio de interruptor alostérico activado por luz azul (LightR) para el control espacio-temporal reversible de la actividad de las proteínas. Utilizando la tirosina quinasa Src como modelo, este estudio ofrece un protocolo elaborado para desarrollar y caracterizar Src regulado por luz (LightR-Src). Demuestra la versatilidad de este enfoque en todas las clases de enzimas.
Nuestra investigación general se centra en el desarrollo de métodos optogenéticos que logren un control espacio-temporal preciso de la actividad de las proteínas mediante la luz. Diseñamos dominios regulables por luz llamados lightR para la regulación alostérica, lo que nos permite estudiar cómo la actividad de las proteínas controlada espacio-temporalmente afecta la señalización y las funciones celulares, lo que ayuda en el modelado preclínico de enfermedades y el desarrollo de terapias. La optogenética se enfrenta a varios desafíos, entre ellos lograr un control preciso y reversible de la actividad de la proteína diana e imitar con precisión la cinética de señalización endógena.
Las cuestiones clave son la prevención de la activación no deseada, la activación subcelular dirigida y la gestión de la fototoxicidad para preservar la viabilidad celular. Además, el desarrollo de herramientas robustas y universalmente compatibles es crucial para mejorar la versatilidad y la reproducibilidad de las aplicaciones. Nuestro protocolo para herramientas de ingeniería lightR combina de manera única múltiples funciones avanzadas en un solo sistema, incluida la regulación alostérica, la alta sensibilidad, la resolución espacial, el control temporal estricto y la especificidad de señalización precisa.
Esta integración permite la sintonización a través de diversas proteínas objetivo, abordando las brechas en otros métodos que pueden carecer de una o más de estas capacidades críticas. Estamos interesados en definir los procesos estructurales y de señalización clave que regulan la migración celular. Nuestro objetivo es utilizar nuestra tecnología optogenética para diseccionar las regulaciones de la migración y las interacciones de las células endoteliales.
Comprender cómo la remodelación de la matriz extracelular está mediada por las células endoteliales y determinar cómo la desregulación de estos procesos contribuye al desarrollo de la enfermedad. Para el análisis bioquímico de la placa de quinasas lightR una vez 10 a la potencia de seis células lin XE para una placa de cultivo celular de 3,5 centímetros para cada grupo experimental, incube las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 16 a 18 horas. Al día siguiente, transfecte las células con la construcción de ADN seleccionada utilizando un reactivo de transfección adecuado.
Cubra el plato con papel de aluminio y devuélvalo a la incubadora. Después de 16 a 18 horas de transfección, coloque un sistema de lámpara de panel LED de 465 nanómetros dentro de la incubadora de cultivo de tejidos. Coloque un panel de plexiglás perforado a 10 centímetros por encima de la lámpara para lograr una iluminación de tres milivatios por centímetro cuadrado.
Utilice la iluminación continua en las celdas que expresan LightR-Src y D388 R-LightR-Src. Encienda y apague el panel LED manualmente para controlar la iluminación. Al final de los puntos de tiempo experimentales, recoja las células bajo luz roja segura, aspire el medio y lave las células con PBS frío.
La iluminación global de las células lin XE con LightR-Src diseñado durante 60 minutos muestra la fosforilación de los sustratos Src, la paxilina endógena y las células p130Cas que expresan el mutante catalítico inactivo D388 RLightR-Src no muestra fosforilación de los sustratos Src en la iluminación global. Para empezar, placa dos veces 10 a la potencia de cinco células hela por placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros en medios de cultivo celular. Incubar las células durante dos horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Una vez que las células se hayan unido y hayan alcanzado un 60 a 70% de confluencia, cotransfecte las células del infierno con la mezcla dada. Cubra el plato con papel de aluminio para evitar la iluminación accidental de las celdas. Luego incube las células durante 16 a 18 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
A continuación, coloque vidrios cubiertos con un diámetro de 25 milímetros y un grosor de 0,17 milímetros en una cámara de placa de seis pocillos. Cubra tres cubreobjetos de vidrio redondos con cinco miligramos por litro de fibronectina en PBS e incube a 37 grados centígrados durante la noche. A continuación, enjuague los cubreobjetos con PBS de 16 a 18 horas después de la transfección.
Recoja las células hela transfectadas en una luz roja segura, luego reproduzca aproximadamente una vez 10 a la potencia de cinco células hela transfectadas en cada cubreobjetos bajo una luz roja segura. Cubrir la placa con papel de aluminio e incubar en medios de cultivo celular durante dos horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. A continuación, caliente el medio de imagen preparado y el aceite mineral a 37 grados centígrados.
A continuación, lave dos veces las cubrebotellas que contienen las células con PBS. Después de teñir y lavar las células, coloque con cuidado el cubreobjetos en una cámara de imágenes de células vivas. Agregue un mililitro de medio de imagen L15 a la cámara.
Agregue un mililitro de aceite mineral precalentado al medio para evitar la evaporación durante la toma de imágenes. Mantenga la cámara protegida de la luz a 37 grados centígrados hasta que esté lista para tomar imágenes. Coloque la cámara en una platina de microscopio precalentada a 37 grados centígrados.
Seleccione una sola celda que exprese una cereza LightR-Src rápida y Src un IRFP. Seleccione regiones específicas de interés dentro de la celda para iluminar. Para este estudio, elija un área pequeña en la periferia de la celda seleccionada.
Obtenga una imagen de la celda seleccionada cada minuto durante 20 minutos en el estado basal antes de la iluminación. Continúe con la obtención de imágenes durante 50 minutos mientras se ilumina localmente, seguido de 20 minutos después de la activación para un total de 90 minutos. Después de la creación de imágenes, guarde las películas en formato de archivo de pila tif para su análisis.
La iluminación global de las células hela condujo a la localización de las adherencias rápidas de LightR-Src a focales, que se invirtieron una vez que se apagó la luz azul. Esta iluminación también provocó un aumento significativo en la dispersión de las células, que se detuvo una vez que se apagó la luz azul. El mutante catalítico inactivo D388 R-LightR-Src no mostró diseminación celular.
La iluminación localizada de las células hela que expresan LightR-Src rápido dio lugar a la acumulación de la construcción en adherencias focales, lo que dio lugar a protuberancias localizadas de la membrana con una iluminación de 50 minutos. No se observó más ganancia de área en la oscuridad de 20 minutos después de la iluminación. Fast LightR-Src desapareció gradualmente de las adherencias focales en la fase oscura.
El centroide de la célula se desplazó hacia la región iluminada. Después de una rápida activación de LightR-Src, que indica un movimiento celular dirigido.
Visión general
Este estudio se centra en el desarrollo de un interruptor alostérico activado por luz azul diseñado (LightR) para el control espaciotemporal preciso de la actividad de proteínas, utilizando la tirosina quinasa Src como modelo. El protocolo permite a los investigadores lograr un control reversible y regulado por luz sobre las funciones de las proteínas, lo que facilita la comprensión de la dinámica de la señalización celular.
Componentes clave del estudio
Área de investigación
- Optogenética
- Ingeniería de proteínas
- Señalización celular y migración
Antecedentes
- Los desafíos en la optogenética incluyen lograr un control preciso de la actividad de las proteínas y imitar la señalización endógena.
- Abordar la fototoxicidad y la activación no deseada son críticos para preservar la viabilidad celular.
- El estudio introduce una nueva herramienta LightR que integra alta sensibilidad, resolución espacial y capacidades de señalización específicas.
Métodos utilizados
- Ingeniería y caracterización del dominio LightR para la quinasa Src
- Uso de células HeLa y lin XE para los experimentos
- Ensayos bioquímicos y técnicas de imagen de células vivas
Resultados principales
- LightR-Src permite la fosforilación controlada de los sustratos de Src bajo iluminación de luz azul.
- La iluminación localizada induce la expansión celular y el movimiento dirigido en células HeLa.
- La activación y desactivación de LightR-Src demuestran reversibilidad y especificidad en las funciones celulares.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un método innovador para el control optogenético de la actividad de las proteínas, proporcionando valiosas ideas sobre el comportamiento celular.
- Los hallazgos tienen implicaciones para los modelos preclínicos en la investigación de enfermedades y el desarrollo terapéutico.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Precise spatiotemporal control of protein activity is a critical challenge in early discovery and mechanistic de-risking for biopharma R&D. The LightR optogenetic system enables reversible, light-regulated allosteric modulation of target proteins, supporting high-confidence interrogation of signaling pathways and cellular behaviors. This capability enhances predictive confidence and translational continuity from discovery through preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of therapeutic hypotheses by temporally controlling protein function in live cells.
- Supports mechanistic de-risking by isolating the effects of specific protein activation or inactivation.
- Facilitates functional target validation through reversible ON/OFF modulation and minimal background activity.
- Improves predictive confidence in pathway analysis and target prioritization.
Screening & Assay Development
- Provides validated, light-responsive biological systems for quantitative readouts in cell-based assays.
- Enables reproducible and scalable screening of compounds affecting light-regulated protein activity.
- Supports assay standardization by minimizing leakiness and ensuring tight temporal control.
- Allows for platform reuse across diverse enzyme classes and target proteins.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling subcellular and tissue-level control of signaling events.
- Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by modeling dynamic cellular responses.
- Supports risk-adjusted advancement decisions through robust, reversible modulation of disease pathways.
- Enables mechanistic studies of cell migration and extracellular matrix remodeling relevant to disease progression.
Pipeline & Workflow Integration
The LightR optogenetic system integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven modulation of protein activity and quantitative analysis of downstream effects.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification by isolating protein function with light.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in light-regulated assays.
- Analytics: Provides phosphorylation and cell migration readouts for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical models by enabling disease-relevant, reversible protein control.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for diverse target classes and mechanistic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of optogenetic assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust functional studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, optogenetics, and live-cell imaging.
- Needs access to blue-light illumination systems and quantitative imaging platforms.
- Demands cross-team standardization for reproducible light delivery and data analysis.
- Adaptable to various cell types and enzyme classes with appropriate construct design.
- Phototoxicity and off-target effects must be managed to preserve cell viability and data integrity.
