Name: Control espacio-temporal de la actividad proteica a través de la regulación alostérica optogenética (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Aprende a controlar la actividad proteica con precisión espacio-temporal mediante el interruptor alostérico optogenético LightR. Este método permite estudiar la señalización celular y la migración en modelos preclínicos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Control optogenético de la actividad enzimática mediante un interruptor alostérico regulado por luz

<table><tbody><tr><td>#1.5 Cubreobjetos de vidrio 25 mm Redondos</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>64-0715&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL&nbsp;</td><td>Científico de EE. UU.&nbsp;</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Tampón</td><td></td><td></td> Laemmli <td>para 500 mL: 5,18 g de&nbsp; Tris-HCL, 131,5 mL de glicerol, 52,5 mL de SDS al 20%, 0,5 g de azul de bromofenol, pH final 6,8</td></tr><tr><td>4-20% Gel prefabricado Mini-PROTEAN TGX</td><td>Biorad 4561096</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5x Tampón Phusion Plus&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>60 LED Microscopio Anillo de Luz Boli Optics</td><td></td><td>ML46241324</td><td>LED Azul, 60 mm de diámetro, 5 W</td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Erk 1/2 Anticuerpo</td><td>Señalización Celular</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Anticuerpo</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCherry Anticuerpo</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MEK</td><td>Señalización Celular</td><td>9122</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p130Cas</td><td>BD Biosciences</td><td>610271</td><td></td></tr><tr><td>Señalización celular</td><td>anti-paxilina</td><td>2542</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-Erk 1/2 T202/Y204</td><td>Señalización celular</td><td>de anticuerpos 9101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-pY249 Señalización celular p130Cas</td><td></td><td>4014</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fosfo-Y118</td><td>Señalización celular</td> de paxilina <td>2541</td><td></td></tr><tr><td>Célula Anto-fosfo-S217/221 MEK</td><td> Señalización</td><td>9121</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Fuente de alimentación compatible</td><td>Ordenador corporativo</td><td>LJH -186</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno Rev3 Arduino</td><td>&</td><td>lrm; </td><td></td>A000066</tr><tr><td>Attofluor Cell Chamber</td><td>invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)&nbsp;</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>Triple Inactivado por Calor 0.1 y micro; m con filtro estéril&nbsp;</td></tr><tr><td>bRaf-V600E-Venus</td><td></td><td></td><td>Regalo del Dr. John O'Bryan, MUSC</td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillina (disodio)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-103-25</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Rojo intenso colorante de membrana plasmática</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Colony Screen MasterMix&nbsp;</td>Células competentes <td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a&nbsp;</td><td>NEB&nbsp;</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de ADN&nbsp;</td><td>Biografía de oro&nbsp;</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs&nbsp;</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>Enzima Dpn1&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-Dithiothreitol, Reactivos de Cleland&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros&nbsp;</td><td></td><td></td>409910250</tr><tr><td>FastLightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162155</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina de plasma bovino&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 Reactivo de transfección&nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Gel Tinción de ácido nucleico verde&nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de carga en gel púrpura 6x&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024A Kit de</td><td></td></tr><tr><td>extracción de gel GeneJET &nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K0692</td><td>Kit de extracción de gel&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de plásmidos GeneJET</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Células HEK 293T&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Células HeLa&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Iot Relay</td><td>Registradores digitales</td><td>DLI 705020645490</td><td>relé de control CA/CC para iluminación</td></tr><tr><td>Kanamycin Monosulfato</td> Gold <td>Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>L-15 1x</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-045-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>LED Grow Light System</td><td>HQRP</td><td>884667106091218</td><td>sistema de lámparas de panel LED&nbsp;</td></tr><tr><td>LightR-bRaf-mVenus</td><td>Addgene</td><td>#162154</td><td></td></tr><tr><td>LightR-iCre-miRFP670</td><td>Addgene</td><td>#162158</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2024a</td><td>Software para ejecutar CellGEO Scripts</td></tr><tr><td>Metamorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Imaging Analysis Software</td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Aceite Mineral</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Kit de minipreparación M5310</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Elección de genes&nbsp;</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Geles Prefabricados 12 pocillos</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado de biología molecular&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>46-000-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Espejo policroico multibanda</td><td>89903BS</td><td>Chroma</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS sin Ca y Mg&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-iCre</td><td>Addgene</td><td>#89573</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry</td><td>Addgene</td><td>#122963</td><td></td></tr><tr><td>pCEFL-ERK2</td><td></td><td></td><td>Regalo del laboratorio del Dr. Channing Der,</td></tr><tr><td>UNC PCR Tubes&nbsp;</td><td>labForce</td><td>1149Z65</td><td>0.2 mL 8 tiras y tapas, tiras rígidas tapas de cúpula unidas individualmente&nbsp;</td></tr><tr><td>Phusion Plus ADN Polimerasa</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>pmiRFP670-N1</td><td>Addgene</td><td>#79987</td><td></td></tr><tr><td>Polygon 400 Iluminador con patrón</td><td>Mightex</td><td>DSI-G-00C</td><td></td></tr><tr><td>Primers&nbsp;</td><td>Membranas de</td> PVDF IDT <td></td><td></td></tr><tr><td>BioRad 1620219</td><td></td><td>Immun-Blot PVDF/Sándwiches de papel de filtro&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T0.25% Tripsina, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodio</td><td>Corning&nbsp;</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acetato-EDTA (TAE) 50x&nbsp;</td><td>Fischer&nbsp;</td><td>BP1332-1&nbsp;</td><td>Para electroforesis&nbsp;</td></tr><tr><td>UPlanSApo 40x Microscopio Objetivo</td><td>Olympus</td><td>1-U2B828</td><td></td></tr><tr><td>USB TTL Box</td><td>National Instruments</td><td>6501</td><td>Para interfaz TTL</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>Fisher Chemical&nbsp;</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr></tbody></table>

control espacio-temporal de la actividad proteica a través de la regulación alostérica optogenética

Spatiotemporal Control of Protein Activity through Optogenetic Allosteric Regulation

El LightR-Src se diseña y genera siguiendo la estrategia descrita en la Figura 1A,B. El análisis bioquímico de LightR-Src accede a la fosforilación de sustratos endógenos conocidos de Src, p130Cas (Y249)22 y paxilina (Y118)23 en respuesta a la luz azul a 60 min de iluminación continua (Figura 2B). En particular, no se observa una activación de fondo de la cinasa Src cuando LightR-Src se expresa solo en la oscuridad durante 16-18 h después de la transfección. Además, el mutante catalíticamente inactivo de LightR-Src con mutación D388R no induce la fosforilación del sustrato Src, lo que demuestra que la fosforilación es llevada a cabo por LightR-Src activo y no causada por el efecto inespecífico de la iluminación de luz azul (Figura 2B). Reconociendo los informes de actividad oscilatoria de la quinasa Src27 en células vivas, investigamos si LightR-Src podría ajustarse para exhibir activación cíclica. El LightR-Src original mostró una cinética de desactivación lenta (Figura 2C), lo que provocó la generación de una nueva variante, Fast-LightR-Src, que alberga la mutación I85V en ambos VVD. La Figura 2D ilustra que Fast-LightR-Src muestra una cinética de desactivación notablemente más rápida y se inactiva completamente dentro de los 10 minutos posteriores al apagado de la luz, en comparación con más de una hora para LightR-Src. Con FastLightR-Src, también pudimos lograr ciclos repetidos de activación/inactivación (Figura 2E). Estos resultados demuestran colectivamente la capacidad de la herramienta LightR para lograr una regulación específica y estrictamente controlada de la actividad de Src en células vivas.
La aplicación de FastLightR-Src también permite evaluar los efectos de la activación transitoria de Src en la morfodinámica celular. La activación de FastLightR-Src en las células HeLa induce la propagación celular, y este proceso se detiene tan pronto como FastLightR-Src se inactiva. Tras la activación, observamos la translocación de FastLightR-Src desde el compartimento perinuclear a las adherencias focales y la membrana plasmática, un comportamiento exhibido por la quinasa Src11,12 de tipo salvaje. Las células iluminadoras que expresan el mutante catalíticamente inactivo D388RLightR-Src no muestran tales efectos de propagación (Figura 3B, C). Esto confirma aún más que FastLightR-Src funciona de manera similar a su contraparte de tipo salvaje. La iluminación local de una región celular da como resultado la activación localizada de FastLightR-Src indicada por la acumulación local de LightR Src en la adhesión focal y acompañada por la formación de protuberancias locales en la membrana (Figura 4B (i), (ii)) y desplazamiento del centroide de la célula (Figura 4C (i), (ii)) que resulta en el movimiento de la célula hacia la luz. Una vez establecida la aplicación de la herramienta LightR para la regulación de la quinasa Src, mostramos la amplia utilidad de LightR extendida a la regulación de la quinasa bRaf y la recombinasa de ADN Cre. El análisis de LightR-bRaf muestra la fosforilación inducida por la luz del sustrato endógeno de bRaf, MEK1, y la fosforilación posterior de las quinasas ERK1/224,25 a niveles comparables a los del mutante bRaf constitutivamente activo (V600E) (Figura 5A). Por el contrario, el D575RLightR-bRaf catalíticamente inactivo no muestra fosforilación de MEK1 y ERK1/2, comparable a las muestras de LightR-bRaf no iluminadas, lo que confirma la especificidad de la regulación de LightR-bRaf. Las imágenes de células vivas demostraron que los ciclos repetidos de activación/inactivación de FastLightR-bRaf inducen la translocación repetida de ERK2 dentro y fuera del núcleo, lo que corrobora los resultados conocidos de la activación de bRaf28 (Figura 5B). La activación de LightR-Cre da como resultado la recombinación exitosa de un gen mCherry reportero, lo que demuestra la aplicabilidad de LightR a diferentes clases de enzimas (Figura 5C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig01.jpg"> 
Figura 1: Estrategia de desarrollo del enfoque LightR. (A) Estructuras cristalinas de dos monómeros Vivid en el estado oscuro (PDB: 2PD7) y el dímero en el estado iluminado (PDB: 3RH8). (B) Representación de dibujos animados del diseño LightR. Dos fotorreceptores VVD conectados en tándem insertados en el dominio catalítico interrumpen la actividad catalítica de la proteína en la oscuridad. La dimerización de VVD en respuesta a la luz azul restaura la actividad de la proteína. (C) Estructuras cristalinas de (i) Src (PDB 1Y57) y (ii) dominios catalíticos bRaf (PDB 4MNF). (ii) Estructura de la recombinasa Cre (PDB 1MA7). Las flechas amarillas indican el sitio de inserción de LightR e indican un aminoácido sustituido. (D) Diagrama esquemático de la estrategia de clonación para la inserción del dominio LightR en una secuencia de enzima diana19. En el paso 1, se utilizan cebadores específicamente diseñados para la síntesis por PCR de un fragmento LightR flanqueado por sitios de recocido en el gen objetivo antes y después del sitio de inserción. En el paso 2, se muestra que el fragmento de LightR así producido se utiliza como un "megacebador" para la inserción de LightR en el gen de la enzima objetivo mediante mutagénesis dirigida al sitio de cambio rápido. Los paneles A-C han sido adaptados y modificados con permiso de Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig02.jpg"> 
Figura 2: Caracterización bioquímica de las proteínas LightR modificadas. (A) Representación esquemática del protocolo experimental para la caracterización bioquímica de LightR Src. (B) Las células LinXE que expresan transitoriamente la construcción LightR Src con un mCherry y una etiqueta myc en el extremo C-terminal se iluminaron continuamente con luz azul durante 60 minutos, utilizando una configuración de LED de 465 nm. Los lisados celulares se sondearon para la fosforilación de sustratos de Src, paxilina y p130Cas. Los resultados de Western Blot muestran la fosforilación de la paxilina endógena y p130Cas en respuesta a la activación de LightR-Src en células vivas. (C,D) Las células LinXE que expresaban transitoriamente las construcciones LightR-Src indicadas que llevaban la etiqueta mCherry-myc en tándem en el extremo C-terminal se expusieron continuamente a la luz azul durante tiempos especificados (0 min y 30 min) y luego se colocaron en la oscuridad durante períodos de tiempo indicados. Los lisados celulares se sondearon para la fosforilación de sustratos Src, mostrando la comparación de la cinética de activación y desactivación entre (C) LightR-Src y (D) FastLightR-Src. (E) Las células LinXE que expresan transitoriamente las construcciones LightR-Src indicadas que llevan la etiqueta mCherry-myc en tándem en el extremo C-terminal se expusieron continuamente a la luz azul durante 20 minutos, seguidas de una incubación repetida en la oscuridad durante 10 minutos y a la luz durante 20 minutos. Se recolectaron lisados celulares y se sondearon para la fosforilación de sustratos de Src, mostrando la eficiencia del ciclo de la quinasa Src entre los estados de activación e inactivación. Todos los experimentos se repitieron al menos tres veces con resultados similares. Los números que se muestran al lado de cada panel de Western blot B-E representan los pesos moleculares de las proteínas, medidos en kilodaltons (kDa). Los paneles B-E han sido adaptados y modificados con permiso de Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig03v3.jpg"> 
Figura 3: Control y efecto de la iluminación global y temporal en la actividad de FastLightR-Src. (A) Representación en dibujos animados del esquema experimental de iluminación cíclica global y temporal y los análisis de datos posteriores. (B,C) La regulación de la morfología celular y la localización de FastLightR-Src por luz azul se representa en imágenes representativas de células HeLa obtenidas a partir de una serie de lapso de tiempo utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio. Estas células coexpresaban transitoriamente FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 células) o D388RLightR-Src-mCherry-myc (N = 9 células) inactivas catalíticamente junto con Stargazin-iRFP670 (marcador de membrana plasmática). Se realizaron imágenes de células vivas cada minuto mientras las células se iluminaban globalmente con luz azul (contornos azules). (B) Las flechas amarillas resaltan la localización de FastLightR-Src en estructuras que se asemejan a adherencias focales. Las imágenes se obtuvieron a partir de una serie de células HeLa de lapso de tiempo utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio. (C) La cuantificación de los cambios en el área de la celda inducidos por la activación de FastLightR-Src frente a D388RLightR-Src se muestra en cada panel. La ventana de iluminación se indica como rectángulos azules. Los gráficos representan intervalos de confianza de media ± 90%. Los paneles B y C han sido adaptados y modificados con permiso de Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig04.jpg"> 
Figura 4: Control y efecto de la iluminación subcelular local en la actividad de FastLightR-Src. (A) Representación de dibujos animados del esquema experimental de control de iluminación subcelular local. (B) (i) Secuencia de lapso de tiempo que ilustra una celda HeLa que expresa FastLightR-Src-mCherry, iluminada localmente con luz azul (representada por un círculo azul). Las imágenes se capturaron cada minuto utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (objetivo de 60x). Las imágenes se presentan como imágenes de contraste invertido obtenidas a intervalos de tiempo especificados. (ii) Imágenes de proyección celular que muestran protuberancias formadas durante intervalos de tiempo especificados. El umbral y el enmascaramiento de la morfología celular a lo largo de la línea de tiempo experimental representa la plataforma para analizar la propagación celular y la dinámica del borde celular. El área iluminada especificada de la celda está delimitada por un círculo azul. (C) (i) Gráfico polar para células que representan la distancia de migración del centroide (d) y el ángulo de desviación (θ) en relación con la iluminación de luz azul local. Los puntos negros representan células HeLa individuales que expresan D388RLightR-Src (N = 6 células) o FastLightR-Src (N = 10 células) catalíticamente inactivas. (ii) Representación esquemática que demuestra la distancia de desplazamiento del centroide (d) recorrida por el centroide de la célula desde el inicio (1) hasta la conclusión (2) de la estimulación local con luz azul. El ángulo de desviación (θ) indica el grado de divergencia del movimiento del centroide de la célula con respecto a la ubicación de la luz azul. El sombreado gris claro indica la región que sobresale de la célula en respuesta a la estimulación local de FastLightR-Src. El área iluminada especificada de la celda se indica mediante un círculo azul sólido. Los paneles B y C han sido adaptados y modificados a partir de Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67261/67261fig05.jpg"> 
Figura 5: Amplia aplicabilidad del enfoque LightR. (A) Regulación de LightR-bRaf. Las células LinXE que expresan transitoriamente LightR-bRaf-Venus, D575R LightR-bRaf Venus catalíticamente inactivas o bRaf (V600E)-Venus constitutivamente activas se expusieron a luz azul continua durante el período de tiempo especificado. Los lisados celulares se probaron para la fosforilación de las proteínas indicadas. (B) Las imágenes representativas obtenidas de una serie de imágenes de células vivas en lapso de tiempo utilizando microscopía de fluorescencia de campo amplio ilustran la regulación de la respuesta global a la luz azul en las células LinXE que coexpresan transitoriamente FastLightR-bRaf-Venus y mCherry-ERK2. Estas células se iluminaron globalmente con luz azul (50 ms pulsos por segundo, 50 pulsos por minuto) durante duraciones especificadas resaltadas en azul. Se realizaron imágenes de células vivas de mCherry-ERK2 cada minuto. Las flechas amarillas resaltan las etapas de la localización nuclear de ERK2 inducida por la activación con luz azul de bRaf diseñado. (C) Las células LinXE se transfectaron transitoriamente con un reportero Floxed-stop-mCherry y LightR-Cre-iRFP670. Las células se sometieron a condiciones de oscuridad o a luz azul pulsante (2 s encendidos, 10 s apagados) durante un máximo de 8 h. Las imágenes de todos los puntos de tiempo de cada canal se adquirieron utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio (objetivo 10x) en configuraciones idénticas y se ajustaron a niveles de brillo y contraste consistentes para facilitar la comparación de los niveles de expresión de proteínas entre muestras. El experimento se repitió al menos tres veces, arrojando resultados similares. La figura ha sido adaptada y modificada a partir de Shaaya et al.10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/67261fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla complementaria 1: Secuencia LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria 2: Descripción de los sitios de inserción de LightR y lista de verificación para el diseño de LightR-Protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria 3: Imprimaciones para la clonación de LightR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%203.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria 4: Condiciones de transfección para el análisis bioquímico de la actividad de LightR-Protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%204.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla suplementaria 5: Condiciones de transfección para el análisis basado en imágenes de la actividad de LightR-Protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20Table%205.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Fichero complementario 1: Iluminación pulsada mediante Entorno de Desarrollo Integrado (IDE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: Ajustes de iluminación del microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67261/Supplementary%20File%202_Updated.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Control espacio-temporal de la actividad proteica a través de la regulación alostérica optogenética

Optogenetics offers the potential for mimicking complex spatiotemporal control of enzyme activity down to a subcellular resolution. However, most ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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