Cebado con dispositivo de pulmón artificial para el injerto de superficie de haz de fibras in situ

Los dispositivos médicos de barrera sanguínea esenciales para los cuidados intensivos a menudo se enfrentan a la formación de trombos, lo que compromete la función y aumenta los riesgos de trombosis sistémica. Los anticoagulantes clínicos mitigan la trombosis, pero aumentan el riesgo de sangrado. La absorción de proteínas en las superficies de los biomateriales desencadena la coagulación y la inflamación.

Investigamos el impacto del recubrimiento de lavado de polímero zoura en la absorción de proteínas del circuito ECMO. En la actualidad, no existe ningún anticoagulante comercial que inhiba de forma selectiva y eficaz la trombosis en los productos sanitarios sin afectar al paciente. Además, es esencial optimizar y demostrar la eficacia de los recubrimientos y la ingeniería de superficies a lo largo de períodos que van desde días hasta semanas e incluso meses para diversos dispositivos médicos.

Nuestros nuevos objetivos científicos incluyen evaluar la influencia de diferentes enfoques de preprocesamiento en la aplicación de recubrimientos, evaluar el impacto de los métodos de manejo de la solución de recubrimiento de lavado en la uniformidad del recubrimiento, investigar los efectos de injertos de polímeros antiincrustantes alternativos en el ensuciamiento de proteínas inespecíficas y determinar la capacidad de los recubrimientos optimizados para limitar la trombosis in vivo. Para limpiar el circuito pulmonar, recircular metanol al 30% en agua desionizada durante 20 minutos. A continuación, recirculando el metanol al 10% en agua desionizada y luego solo agua desionizada durante otros 20 minutos.

Seque el circuito pulmonar con aire filtrado de la casa ajustado a flujo bajo durante dos horas. Coloque el circuito pulmonar limpio y seco en el generador de plasma de ozonólisis ultravioleta. Cierre el generador y encienda el instrumento para iniciar la exposición al plasma durante 20 minutos.

Después de completar la exposición al plasma, proceda directamente al paso de recubrimiento para evitar el reordenamiento de la cadena superficial y la pérdida de sitios reactivos generados por la interacción del plasma. Mientras el dispositivo se somete a una modificación de la superficie, disuelva 1,2 gramos de clorhidrato de dopamina en 600 mililitros de tampón tris en un vaso de precipitados. Posteriormente, disuelva el monómero de metacrilato de sulfobetaína en una proporción de uno a 15 clorhidrato de dopamina a metacrilato de sulfobetaína.

A continuación, añada cinco milimolares de periodato de sodio en forma de gotas en la solución de recubrimiento. Use una barra de agitación magnética y una placa de agitación ajustada a 150 RPM para mezclar bien la solución. A continuación, cebe el dispositivo pulmonar con la solución de recubrimiento con una jeringa grande para extraer y llenar el circuito.

Sujete un extremo del circuito y cebándolo desde el otro extremo mientras guía las burbujas de aire a través de un conector de acceso al circuito. Una vez que el circuito esté completamente cebado, coloque el dispositivo bajo una fuente de luz ultravioleta durante dos horas. Agite la solución reorientando los extremos del dispositivo principal hacia arriba y hacia abajo cada 10 minutos.

Después del tratamiento de luz, drene el circuito por completo. Enjuague suavemente todas las muestras con agua desionizada cebando y drenando repetidamente con una jeringa de 60 centímetros cúbicos hasta que el efluente de enjuague esté limpio. Finalmente, guarde el dispositivo lleno de agua desionizada en un refrigerador a cuatro grados centígrados para la autopsia y los análisis de superficie.

Para realizar la prueba de absorción de fibrinógeno, transfiera muestras de estera de fibra en un mililitro de tres miligramos por mililitro de solución de fibrinógeno en placas de pocillos e incube la placa a 37 grados Celsius durante 90 minutos a 60 RPM. Lave las muestras con PBS. Transfiéralos a nuevos pocillos y agregue un mililitro de un miligramo por mililitro de solución BSA a cada pocillo.

Incuba durante otros 90 minutos. A continuación, lave las muestras tres veces más con una solución de PBS y transfiéralas a nuevos pocillos. A continuación, agregue un mililitro de una dilución de uno a 1000 de anticuerpo de fibrinógeno conjugado con peroxidasa de rábano picante en solución de PBS a cada pocillo.

Después de incubar las muestras durante 30 minutos y lavarlas, transfiéralas a nuevos pocillos. En los nuevos pocillos, agregue 500 microlitros de ofenilendiamina en tampón de fosfato de citrato con peróxido de hidrógeno al 0,03%, ajustado a un pH de 5,0 a intervalos de 30 segundos. Incubar las muestras lejos de la luz durante 30 minutos.

Para detener la reacción de la peroxidasa y la ofenilendiamina, agregue 500 microlitros de un ácido clorhídrico normal a cada pocillo. Transfiera el sobrenadante de cada pocillo a una cubeta. Mida la absorbancia del sobrenadante a 492 nanómetros utilizando un espectrofotómetro visible UV.

Descongele el kit de ensayo de lactato deshidrogenasa durante 20 minutos. Mientras se descongela el kit de ensayo, prepare plasma humano adulto combinado para obtener plasma rico en plaquetas. Para preparar plasma rico en plaquetas, se centrifugaron tubos de muestra de plasma humano descongelados a 483 G para separar el plasma en dos regiones.

Identifique el tercio inferior que contiene plasma rico en plaquetas y los dos tercios superiores que contienen plasma pobre en plaquetas. Retire con cuidado los gránulos de plaquetas en la parte inferior de los tubos y los dos tercios superiores que contienen plasma pobre en plaquetas. Disperse suavemente la pastilla de plaquetas en el plasma superior agitando los tubos.

Antes de la prueba, agregue cloruro de calcio al plasma rico en plaquetas para revertir los efectos de los citratos. A continuación, incube las muestras de estera de fibra en 500 microlitros de plasma rico en plaquetas durante 90 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, transfiera las muestras a nuevos pocillos y enjuague tres veces con la solución de PBS.

De nuevo, transfiera las muestras a nuevos pozos. Agregue 300 microlitros de solución de PBS y 10 microlitros de tampón de lisis 10 X a cada pocillo. Incube las muestras durante 45 minutos, luego agregue 50 microlitros de la mezcla de reacción a cada pocillo e incube durante 30 minutos lejos de la luz.

Agregue 50 microlitros de ácido clorhídrico a cada pocillo para detener las reacciones. Para detectar la actividad de la lactato deshidrogenasa a partir de lisados de plaquetas absorbidas, mida la absorbancia de luz de las soluciones de pozo desarrolladas a 490 nanómetros y 680 nanómetros. El ensuciamiento de fibrinógeno se redujo significativamente en las fibras PP-PDMS codificadas en comparación con los controles no recubiertos.

No hubo diferencias significativas en el ensuciamiento de fibrinógeno entre los haces externos e internos en las fibras PP-PDMS en condiciones de no flujo. Bajo el flujo de PBS de 24 horas, el ensuciamiento de fibrinógeno en los haces externo e interno se mantuvo bajo y no mostró diferencias significativas. El ensuciamiento plaquetario fue mayor en el haz externo de fibras PP-PDMS que en el haz interno, y el control sin recubrimiento.

El ensuciamiento plaquetario fue significativamente mayor en el haz externo en comparación con las fibras PP-PDMS codificadas en el haz interno sin exposición al flujo. Bajo el flujo de PBS de 24 horas, no se observaron diferencias significativas en el ensuciamiento plaquetario entre los haces externos e internos con bajos niveles de ensuciamiento.