Name: Uso de Mycobacterium smegmatis como bioindicador de condiciones de crecimiento limitadas por zinc en micobacterias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprende a utilizar Mycobacterium smegmatis como bioindicador de condiciones limitadas por zinc en micobacterias. Este protocolo estandarizado permite estudiar adaptaciones fisiológicas y respuestas al estrés oxidativo en investigación de tuberculosis.

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Este estudio fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias (NSF) CAREER Award 1844854, el Premio a la Innovación de la Asociación Americana del Pulmón IA-937538, y el Instituto Nacional de Salud (NIH) NIAID R21 AI109293 a S.P. La dirección actual de Allexa D. Burger es el Centro de Investigación de Biociencias del Pacífico, Universidad de Hawái en Mānoa, Honolulu, Hawái, Estados Unidos.

Assessing Bioindicator Phenotypes for Zinc Limitation in M. smegmatis

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<li>Middag, R., de Baar, H. J. W., Bruland, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationships+between+dissolved+zinc+and+major+nutrients+phosphate+and+silicate+along+the+GEOTRACES+GA02+transect+in+the+west+Atlantic+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Biogeochem+Cycles%22%5BJournal%5D)">The relationships between dissolved zinc and major nutrients phosphate and silicate along the GEOTRACES GA02 transect in the west Atlantic ocean.</a> Global Biogeochem Cycles. 33 (1), 63-84 (2019).</li>
<li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li>
<li>Panina, E. M., Mironov, A. A., Gelfand, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+bacterial+zinc+regulons%3A+Enhanced+ion+transport%2C+pathogenesis%2C+and+rearrangement+of+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of bacterial zinc regulons: Enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins.</a> Proc Natl Acad Sci. 100 (17), 9912-9917 (2003).</li>
<li>Outten, C. E., O’Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtomolar+sensitivity+of+metalloregulatory+proteins+controlling+zinc+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Femtomolar sensitivity of metalloregulatory proteins controlling zinc homeostasis.</a> Science. 292 (5526), 2488-2492 (2001).</li>
<li>Merchant, S. S., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+economy%3A+microbial+strategies+for+optimizing+growth+in+the+face+of+nutrient+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Micro+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elemental economy: microbial strategies for optimizing growth in the face of nutrient limitation.</a> Adv Micro Physiol. 60, 91-210 (2012).</li>
<li>Makarova, K. S., Ponomarev, V. A., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+C+or+not+two+C%3A+recurrent+disruption+of+Zn-ribbons%2C+gene+duplication%2C+lineage-specific+gene+loss%2C+and+horizontal+gene+transfer+in+evolution+of+bacterial+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Biol%22%5BJournal%5D)">Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins.</a> Genom Biol. 2 (9), RESEARCH 0033(2001).</li>
<li>Yutin, N., Puigbò, P., Koonin, E. V., Wolf, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+of+prokaryotic+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics of prokaryotic ribosomal proteins.</a> PLoS One. 7 (5), e36972(2012).</li>
<li>Prisic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+regulates+a+switch+between+primary+and+alternative+S18+ribosomal+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zinc regulates a switch between primary and alternative S18 ribosomal proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol Microbiol. 97 (2), 263-280 (2015).</li>
<li>Dow, A., Prisic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+ribosomal+proteins+are+required+for+growth+and+morphogenesis+of+Mycobacterium+smegmatis+under+zinc+limiting+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alternative ribosomal proteins are required for growth and morphogenesis of Mycobacterium smegmatis under zinc limiting conditions.</a> PLoS One. 13 (4), e0196300(2018).</li>
<li>Chen, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+translation+by+alternative+bacterial+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Selective translation by alternative bacterial ribosomes.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19487-19496 (2020).</li>
<li>Natori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fail-safe+system+for+the+ribosome+under+zinc-limiting+conditions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A fail-safe system for the ribosome under zinc-limiting conditions in Bacillus subtilis.</a> Mol Microbiol. 63 (1), 294-307 (2007).</li>
<li>Gabriel, S. E., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Zur-controlled+ribosomal+proteins+to+growth+under+zinc+starvation+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of Zur-controlled ribosomal proteins to growth under zinc starvation conditions.</a> J Bacteriol. 191 (19), 6116-6122 (2009).</li>
<li>Wolf, Y. I., Rogozin, I. B., Kondrashov, A. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+alignment%2C+evolution+of+prokaryotic+genome+organization%2C+and+prediction+of+gene+function+using+genomic+context%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Res%22%5BJournal%5D)">Genome alignment, evolution of prokaryotic genome organization, and prediction of gene function using genomic context.</a> Genom Res. 11 (3), 356-372 (2001).</li>
<li>Akanuma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+ribosomal+protein+S14+demonstrated+by+the+reconstruction+of+chimeric+ribosomes+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Evolution of ribosomal protein S14 demonstrated by the reconstruction of chimeric ribosomes in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 203 (10), e00599(2021).</li>
<li>Owen, G. A., Pascoe, B., Kallifidas, D., Paget, M. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-responsive+regulation+of+alternative+ribosomal+protein+genes+in+Streptomyces+coelicolor+involves+Zur+and+%CF%83R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Zinc-responsive regulation of alternative ribosomal protein genes in Streptomyces coelicolor involves Zur and σR.</a> J Bacteriol. 189 (11), 4078-4086 (2007).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+depletion+induces+ribosome+hibernation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zinc depletion induces ribosome hibernation in mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (32), 8191-8196 (2018).</li>
<li>Li, Y., Corro, J. H., Palmer, C. D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+from+remodeling+to+hibernation+of+ribosomes+in+zinc-starved+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Progression from remodeling to hibernation of ribosomes in zinc-starved mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19528-19537 (2020).</li>
<li>Graham, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+zinc+depletion+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Severe zinc depletion of Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 284 (27), 18377-18389 (2009).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F+420+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel F 420 -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Mol Microbiol. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
<li>Patino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+of+mycobacteria+as+a+tool+for+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence of mycobacteria as a tool for detection of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 46 (10), 3296-3302 (2008).</li>
<li>Dow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+limitation+triggers+anticipatory+adaptations+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Zinc limitation triggers anticipatory adaptations in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS Pathogens. 17 (5), e1009570(2021).</li>
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<li>Dow, A., Burger, A., Marcantonio, E., Prisic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+specifies+involvement+of+alternative+ribosomal+proteins+in+response+to+zinc+limitation+in+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling specifies involvement of alternative ribosomal proteins in response to zinc limitation in Mycobacterium smegmatis.</a> Front Microbiol. 13, 811774(2022).</li>
<li>Singh, A. K., Reyrat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Mycobacterium smegmatis.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit10C.1(2009).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+elicited+by+a+double+Leucine+and+Pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+Guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immunity%22%5BJournal%5D)">Protection elicited by a double Leucine and Pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in Guinea pigs.</a> Infect Immunity. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li>
<li>Cheeseman, P., Toms-Wood, A., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+properties+of+a+fluorescent+compound+factor420%2C+from+Methanobacterium+strain+M.o.H%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation and properties of a fluorescent compound factor420, from Methanobacterium strain M.o.H.</a> J Bacteriol. 112 (1), 527-531 (1972).</li>
<li>Wayne, L. G., Hayes, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+for+sequential+study+of+shiftdown+of+Mycobacterium+tuberculosis+through+two+stages+of+nonreplicating+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immunity%22%5BJournal%5D)">An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence.</a> Infect Immunity. 64 (6), 2062-2069 (1996).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Una contribución importante a la brecha de conocimiento sobre los fundamentos mecanicistas de los ribosomas alternativos es la dificultad para lograr condiciones limitantes de Zn2+ in vitro. La contaminación por trazas de Zn2+ en el entorno de laboratorio es común; por lo tanto, lograr condiciones de crecimiento reproducibles limitadas por Zn2+ es un desafío. La contaminación por Zn2+ puede originarse en varias fuentes, aunque la fuente más importante y común de contaminación y variabilidad es el agua ultrapura utilizada para enjuagar el material de laboratorio y fabricar medios. Los sistemas de agua ultrapura deben recibir un mantenimiento adecuado y deben enjuagarse durante 1 minuto antes de enjuagar el material de laboratorio o usar agua como medio. Los matraces que no se lavan o enjuagan bien con agua ultrapura pueden causar contaminación por Zn2+ , y esto será evidente por el aumento de la densidad celular en ciertos matraces pero no en otros del mismo lote de ZLM. Se pueden usar matraces nuevos para evaluar si la fuente de contaminación por Zn2+ proviene de matraces o medios reutilizados. La contaminación por Zn2+ en ZLM debe remediarse mediante un mayor enjuague de los elementos utilizados para fabricar medios y un conjunto designado de materiales para la preparación de ZLM. Si ninguna de estas medidas tiene éxito en lograr los fenotipos bioindicadores esperados, se debe cuantificar el [Zn2+] en agua ultrapura y ZLM para descartar la posibilidad de que la fuente de agua esté contaminada con Zn2+. Como se informó anteriormente, el [Zn2+] de ZLM es de 115 ± 37 nM23, y las concentraciones por debajo de 70 nM y por encima de 150 nM generalmente conducen a fenotipos de Zn2+ agotado y Zn2+, respectivamente. Sin embargo, una buena preparación de los medios es solo un factor que afecta el resultado, y puede ocurrir un Zn2+ inadecuado o excesivo debido a la preparación inadecuada del inóculo y/o cultivo, es decir, una decantación deficiente de los medios repletos de Zn2+ durante los pasos de lavado. Todos los cultivos de M. smegmatis incluidos aquí se prepararon de la misma manera: se incluyen resultados de crecimiento contaminados con Zn2+ (ZLM-C) y Zn2+ agotados (ZLM-D) para resaltar la variabilidad que puede ocurrir entre diferentes lotes de medios que utilizan el mismo sistema de agua ultrapura, incluso cuando los experimentos se realizan correctamente.
Para garantizar que el cultivo de células en ZLM produzca fenotipos bioindicadores limitantes de Zn2+ reproducibles, es importante etiquetar de forma única los matraces, utilizarlos siempre para la misma condición (es decir, con ZLM o ZRM), rastrear matraces en múltiples usos y desechar los matraces que están al final de su ciclo de vida, o que continúan produciendo fenotipos bioindicadores contaminados con Zn2+ con ZLM. La preparación adecuada del inóculo es muy importante para lograr un crecimiento limitante de Zn2+, ya que el arrastre de Zn2+ de las células de semillas lavadas inadecuadamente es una fuente común de contaminación por Zn2+ que puede ser difícil de analizar a partir de ZLM contaminado con Zn2+. Los cultivos de M. smegmatis deben analizarse y cosecharse después de 72 h de crecimiento en ZLM (y ZRM cultivado en paralelo). La morfogénesis y los fenotipos bioindicadores se pronuncian a partir de las 48-72 h; por lo tanto, evaluar o cosechar cultivos para la limitación de Zn2+ demasiado pronto (o demasiado tarde) puede no producir el fenotipo bioindicador completo. Los cultivos que se agotan en Zn2+ exhibirán longitudes celulares similares a las que están contaminadas con Zn2+; por lo tanto, se deben usar fluorescencia F420 y OD600 para diferenciar los dos. Del mismo modo, es posible que los cultivos contaminados con Zn2+ no siempre crezcan mejor que las bacterias limitadas por Zn2+, pero la fluorescencia de F420 y la longitud celular del tipo salvaje y el mutante ΔaltRP deberían revelar si se logra la condición limitada de Zn2+.
Lo mismo ocurre con M. tuberculosis, ya que la pérdida del fenotipo bioindicador F420 en cultivos limitados por Zn2+ es pronunciada entre 8 y 10 días de crecimiento en ZLM. Aunque M. tuberculosis no exhibe un fenotipo bioindicador fuerte limitado por Zn2+ como M. smegmatis, el método de crecimiento presentado aquí se ha utilizado para asociar la pérdida del fenotipo bioindicador F420 con el crecimiento limitado por Zn2+ utilizando ensayos funcionales y transcriptómica en las cepas virulentas y atenuadas de M. tuberculosis (ref23y datos no publicados). Por lo tanto, seguir la fluorescencia de F420 es una forma accesible de monitorear y verificar las condiciones biológicas limitantes de Zn2+ en M. tuberculosis. Es importante tener en cuenta que el mecanismo que conduce a la reducción de la fluorescencia de F420 durante las condiciones limitantes de Zn2+ sigue sin resolverse, al igual que la distinción de si la fluorescencia reducida se debe a una disminución de la abundancia del conjunto de coenzimas en su conjunto o a un cambio en su estado redox, ya que solo la forma oxidada emite fluorescencia29.
Como se demuestra aquí, la preparación de medios limitantes de Zn2+ tiene matices, y existen numerosos factores que pueden influir en la concentración efectiva de iones Zn2+ en el medio incluso cuando se sigue el mismo protocolo y se utilizan los mismos reactivos. Las trazas de Zn2+ en ZLM permiten un crecimiento y expresión suficientes del fenotipo limitante de Zn2+. Esta disminución gradual de Zn2+ para lograr la limitación es similar al modelo de hipoxia de Wayne en el que las bacterias cultivadas en un matraz cerradoconsumen gradualmente oxígeno. Dado que tanto la hipoxia como los fenotipos limitados por Zn2+ dependen del crecimiento bacteriano, si no hay suficiente oxígeno, o en este modelo, Zn2+, en el inóculo o medio, las bacterias dejarán de crecer antes de que puedan someterse al programa morfogénico correspondiente. Por lo tanto, mientras que la contaminación por Zn2+ es un problema más obvio cuando se desea lograr la limitación de Zn2+ , el agotamiento de Zn2+ también podría presentar un problema debido al deterioro del crecimiento y al desencadenante dependiente de Zn2+ que se pierde durante el crecimiento activo. Además, el uso de lectores de placas monocromadores o basados en filtros con modos de lectura superior o inferior para la intensidad de fluorescencia afecta ligeramente el porcentaje de F375/420 calculado. Por lo tanto, los valores de cada laboratorio pueden no ser directamente comparables a los presentados aquí, pero deben ser similares y seguir las mismas tendencias. Por lo tanto, los métodos y procedimientos para hacer ZLM que produzca un crecimiento limitante de Zn2+ deben optimizarse para cada laboratorio y sistema de agua ultrapura, y los fenotipos bioindicadores presentados aquí deben usarse como estándar para definir las condiciones limitantes de Zn2+.
Debido a la dificultad de estandarizar y reproducir las condiciones de crecimiento limitadas por Zn2+, un enfoque accesible para eludir la contaminación por Zn2+ es agregar un agente quelante a los medios preparados sin Zn2+ agregado. Sin embargo, este enfoque confunde la verdadera respuesta biológica a la limitación de Zn2+, a menudo creando un entorno hambriento de Zn2+ y otros micronutrientes. Incluso se ha demostrado que los agentes quelantes específicos de Zn2+ regulan al alza la respuesta a la inanición de hierro, además de la respuesta transcripcional dependiente de Zn2+ en M. tuberculosis23. Además, el uso de agentes quelantes requiere una titulación y una sincronización cuidadosas para evitar un entorno severamente hambriento de Zn2+ que no refleje la respuesta biológica durante el cambio de condiciones repletas de Zn2+ a condiciones limitadas de Zn2+ o el crecimiento soportado en entornos con disponibilidad limitada de Zn2+ libre. Finalmente, la adición de agentes quelantes puede no ser compatible con aplicaciones posteriores (por ejemplo, macrófagos o infecciones animales). Se han extraído conclusiones fundamentalmente diferentes sobre la forma y función de los ribosomas alternativos obtenidos con agentes quelantes frente al agotamiento gradual de Zn2+ en cultivos en crecimiento activo17,24. Aquí se destacan los diferentes fenotipos resultantes de diferencias relativamente menores en la pureza del agua en diferentes lotes de medios, incluso cuando el procedimiento se realiza correctamente. El sistema cuantificable, reproducible y biológicamente relevante para generar ribosomas alternativos que se presenta aquí, es decir, en cultivos de tipo salvaje limitados por Zn2+ sin agregar quelantes, ofrece un método estandarizado que será primordial para unificar las contribuciones en todo el campo hacia una mejor comprensión de la biología alternativa de los ribosomas.

El ion zinc (Zn2+) es un micronutriente esencial y un componente estándar de los medios microbiológicos. Sin embargo, muchas bacterias soportan la limitación de Zn2+ en el medio ambiente, ya que las condiciones limitantes de Zn2+ están muy extendidas; soil1, marine2, y los nichos dentro del host3 suelen estar limitados por Zn2+. Como tal, la mayoría de las bacterias han desarrollado mecanismos para superar la limitación de Zn2+ y preservar la función celular4. Los sistemas involucrados en el mantenimiento de la homeostasis del Zn2+ están bajo un estricto control transcripcional5 y están involucrados en la eliminación de Zn2+ utilizando sistemas de importación de Zn2+ de alta afinidad, movilizando las reservas celulares de Zn2+ y reemplazando ciertas proteínas de unión a Zn2+ con parámetros alternativos independientes de Zn2+6. Un ejemplo de esto último son los parálogos de proteínas ribosómicas (RPs) independientes de Zn2+, que son una característica común de los regulones sensibles al Zn2+ en bacterias4. Estos RP independientes de Zn2+ altamente divergentes se distinguen de sus parálogos de unión a Zn2+ por la interrupción del motivo CXXC de unión a Zn2+7. Más de la mitad de los genomas procariotas secuenciados contienen al menos un par de RPs duplicados donde, en muchos de ellos, un RP se une a Zn2+, mientras que su parálogo no8. Mientras que la notación C+/C- (que indica la presencia/ausencia del motivo de unión Zn2+ rico en cisteína) se usa comúnmente en referencia a estos pares de RP parálogos7, los RP independientes de Zn2+ también se han descrito como versiones alternativas (Alt) de los parámetros RP primarios (Prim), de unión a Zn2+, ya que los AltRP sirven como RP alternativos para la biogénesis del ribosoma en el Zn2+-condición limitada en algunas bacterias y es una palabra clave con mejor capacidad de búsqueda9,10,11.
Debido a que la expresión de AltRP está estrictamente regulada por Zn2+, es lógico suponer que la expresión de AltRP ofrece redundancia funcional a las proteínas ribosómicas dependientes de Zn2+ frente a la limitación de Zn2+. De hecho, esta característica de las AltRPs se ha demostrado para la bacteria modelo del suelo Bacillus subtilis, donde el crecimiento se rescata durante la limitación de Zn2+ mediante la liberación de la superficie PrimRP L31 y su sustitución por la AltRP L31 L3112,13. Sin embargo, algunos AltRPs son paralógicos a los PrimRPs centrales, por ejemplo, S14, lo que significa que su incorporación es necesaria durante la biogénesis del ribosoma12,13. La reconstrucción del ribosoma con AltRPs es un programa comprometido y que requiere mucha energía. Si bien estos AltRPs centrales pueden servir para liberar Zn2+ del ribosoma, también es posible que algunos AltRPs hayan desarrollado una función adicional en el entorno limitado por Zn2+. Esto se ve respaldado por la observación de que los AltRP son divergentes de sus PrimRP parálogos; la homología de la secuencia de los genes AltRP suele ser mayor entre los homólogos de diferentes especies que con la secuencia del gen PrimRP de unión a Zn2+ dentro de la misma especie7,10. Debido a que los genes que codifican AltRPs altamente divergentes están bajo control transcripcional dependiente de Zn2+, se eliminan de la presión selectiva ejercida sobre los superoperones ribosómicos estrechamente regulados y altamente conservados14. La presión selectiva desacoplada sobre la información genética que codifica la maquinaria ribosómica y los AltRPs expone a estos RPs a trayectorias evolutivas diferentes a las de los PrimRPs homólogos y podría permitir la evolución específica del linaje del mismo AltRP en diferentes bacterias10,15. La existencia generalizada de AltRPs en bacterias y la regulación genética desacoplada de estos RPs únicos plantea una pregunta interesante sobre si la incorporación de AltRPs en los ribosomas bacterianos confiere una propiedad especial a los ribosomas que contienen AltRP (Alt-ribosomas).
Las micobacterias son un grupo ideal de bacterias para investigar las propiedades mecánicas de los ribosomas alternativos. En primer lugar, las micobacterias poseen un operón altRP altamente conservado que contiene cuatro genes que codifican AltRPs: S14-2, S18-2, L28-2 y L33-28,9. Las AltRP micobacterianas son significativamente diferentes de sus parámetros PrimRP; en los cuatro pares PrimRP/AltRP, un gen AltRP dado es más similar en todas las especies micobacterianas que en el gen PrimRP en la misma especie10. La evolución específica del linaje de las AltRPs también es evidente dentro de las micobacterias, como lo demuestran las AltRPs S18-2 y L28-2 en Mycobacterium tuberculosis y M. bovis, que contienen secuencias únicas en el extremo C-terminal que no están presentes en otras micobacterias10. En segundo lugar, este grupo de bacterias altamente relacionadas contiene miembros patógenos y no patógenos que residen en diversos entornos, desde el suelo (por ejemplo, M. smegmatis) hasta una miríada de huéspedes: humanos (por ejemplo, M. tuberculosis), bovinos (por ejemplo, M. bovis), acuáticos (por ejemplo, M. marinum) y aviares (por ejemplo, M. avium), por nombrar algunos. La naturaleza altamente conservada del operón altRP en micobacterias, la evolución específica del linaje de genes específicos de AltRP y los entornos muy diferentes en los que existen los miembros de este grupo brindan una oportunidad única para analizar la evolución conservada y específica del linaje de la función de AltRP y las propiedades mecanicistas de los ribosomas Alt. A pesar de la abundancia de AltRPs en los genomas procariotas, el papel de los AltRPs y los ribosomas Alt se ha investigado solo en unas pocas bacterias9,10,11,12,13,16,17,18,19. El establecimiento de un sistema estandarizado con métricas específicas para validar las condiciones de crecimiento limitantes de Zn2+ en micobacterias mejoraría los resultados experimentales y avanzaría en la comprensión de los ribosomas Alt en el campo de la investigación de ribosomas.
Zn2+ es un micronutriente; por lo tanto, las trazas de contaminación del Zn2+ en los productos químicos y el agua contribuyen a la biodisponibilidad del Zn2+, incluso cuando se omite en la preparación del medio. Las trazas de Zn2+ presentes en el agua o en los productos químicos pueden variar drásticamente de un laboratorio a otro, lo que afecta al resultado del crecimiento limitante de Zn2+. Cuantificar empíricamente el [Zn2+] en cada preparación independiente de medios es demasiado oneroso para la mayoría de los laboratorios que realizan ensayos de crecimiento de rutina, pero un mecanismo para eliminar la posibilidad de contaminación por Zn2+ en los medios de crecimiento sería intrínsecamente valioso. Con este fin, aquí se presenta un método detallado para preparar un medio limitado por Zn2+ (ZLM) químicamente definido, vasos de crecimiento y cultivos de semillas para el crecimiento limitante de Zn2+ y la producción de ribosoma Alt en M. smegmatis y M. tuberculosis. Las características morfogénicas clave (densidad celular medida por OD600, longitud celular y fluorescencia de la coenzima F420) después del crecimiento en ZLM se utilizan para verificar que se logró la limitación de Zn2+. La coenzimaF 420 es un cofactor de deazaflavina que tiene un papel importante en el catabolismo y la defensa contra el estrés oxidativo en metanógenos y micobacterias20,21. Es importante destacar que las micobacterias son autofluorescentes cuando se excitan a 420 nm debido a la abundancia de este cofactor22. El enlace molecular entre [Zn2+] y la fluorescencia de F420 permanece sin resolver, pero seguir la fluorescencia de F420 en cultivos es un bioindicador manejable y confiable.
En M. smegmatis, los fenotipos del bioindicador ocurren en las bacterias de tipo salvaje, pero un mutante de deleción que carece del operón altRP no experimenta el mismo programa morfogénico y puede usarse como un bioindicador diferencial10. Aunque M. tuberculosis no sigue el mismo programa morfogénico que M. smegmatis durante la limitación de Zn2+, M. tuberculosis tiene una respuesta robusta y global al ZnLimitación de 2+ y un fenotipo de bioindicador clave siguiendo este método23. Por lo tanto, el sistema definido aquí permite que los ribosomas Prim- y Alt- se generen en las mismas condiciones de crecimiento (es decir, limitación de Zn2+), lo que facilita la disección mecanicista de la función del ribosoma Alt y su papel en la configuración de la fisiología bacteriana. Este método de crecimiento se utilizó para resolver la estructura de los ribosomas alternativos activos y demostrar su actividad traslacional en M. smegmatis24 de tipo silvestre. Apoyando aún más que este método de crecimiento y fenotipo bioindicador destaca la funcionalidad biológica de AltRPs durante la limitación de Zn2+, la expresión de AltRP es necesaria para la morfogénesis dependiente de Zn2+ y tiene un profundo efecto en el transcriptoma y proteoma de M. smegmatis10,25. El mismo método, con pequeñas modificaciones en la cantidad de inóculo y el tiempo de incubación, se utiliza para generar cultivos limitados con Zn2+ de M. tuberculosis9,23. Aquí, se detallan los protocolos y fenotipos bioindicadores para lograr el crecimiento limitante de Zn2+ tanto en M. smegmatis como en M. tuberculosis, con un enfoque en M. smegmatis, ya que esta bacteria es más sensible a la contaminación por Zn2+ en los medios y es más ampliamente accesible que el patógeno de crecimiento lento.

<table><tbody><tr><td>Sistemas de filtración al vacío de 1000 mL, línea estándar</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td></td></tr><tr><td>Matraces agitadores Erlenmeyer de 125 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679501</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo de 14 mL, plástico, con tapones de doble posición</td><td>VWR</td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Matraces agitadores Erlenmeyer de 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td> 679502 <td></td></tr><tr><td>40X-1000X Lab Compuesto biológico binocular Microscopio</td><td>Omax</td><td>M82EZ</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubos de biorreacción, estériles</td><td>VWR</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de alto rendimiento de 50 mL con tapones de bandera</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Alcojet Detergente en polvo de baja espuma</td><td>Alconox</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de hierro (III) amonical, marrón</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAA1119930&nbsp;</td><td>MW: 265 g/mol, para una solución de 1M añadir 1,325 g a 5 mL de agua ultrapura; almacenar protegido de la luz a 4 C</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Thermo Scientific</td><td>J10857-A1</td><td></td></tr><tr><td>D-pantotenato de calcio</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC243300050</td><td></td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1345-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico anhidro, cristalino</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP339-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa anhidra</td><td>Fisher Scientific</td><td>D14-500</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Caldo</td><td>BD Diagnostics</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>DiluPhotometer OD600 para la determinación de la densidad celular y los ensayos de Bradford</td><td>Implen</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>GENios FL Lector de microplacas</td><td>Tecan</td><td></td><td>Descatalogado</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 PRO Lector de microplacas</td><td>multimodo Tecan</td><td>LGE140213-20BL</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagina</td><td>Thermo Scientific AAB2147336</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1231122</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD Macrofire SP</td><td>Optronics</td><td></td><td>Para usar con el microscopio Olympus</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de purificación de agua Milli-Q Direct 8</td><td>Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Moticam X3</td><td>Motic</td><td></td><td>Descontinuado, reemplazado por Moticam X5 Plus; para uso con microscopio compuesto</td></tr><tr><td>Ácido oleico</td><td>Thermo Scientific</td><td>031997-14</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX51 microscopio vertical</td><td>Olympus</td><td></td><td>Descatalogado, reemplazado por BX53M</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio, monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de plástico desechables semimicro de dos caras</td><td>VWR</td><td>97000-590</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio, cristal</td><td>VWR</td><td>VW1494-01</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>MP Biomedicals</td><td>103170</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuro de zinc heptahidratado, cristalino/ACS</td><td>MP Biomedicals</td><td>219145290</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de mycobacterium smegmatis como bioindicador de condiciones de crecimiento limitadas por zinc en micobacterias

Using Mycobacterium smegmatis as a Bioindicator for Zinc-Limited Growth Conditions in Mycobacteria

Muchas bacterias construyen ribosomas alternativos en condiciones de crecimiento limitantes de Zn2+ reemplazando las proteínas ribosómicas de unión a Zn2+ con parálogos independientes de Zn2+. Definir un sistema para estudiar estos ribosomas alternativos ha resultado difícil porque la contaminación por Zn2+ en el laboratorio es común. Para abordar este problema, a veces se agregan agentes quelantes a los medios de crecimiento, pero este enfoque complica la respuesta biológica a la limitación gradual de Zn2+ y se asocia con la hibernación de los ribosomas. Aquí, se describen instrucciones detalladas para preparar medios y sembrar cultivos para el crecimiento limitado por Zn2+ sin agregar quelantes. Siguiendo este método, la bacteria modelo, Mycobacterium smegmatis, se somete a una morfogénesis, que depende de ribosomas alternativos. Debido a que la morfogénesis es tratable y solo ocurre en condiciones limitantes de Zn2+, M. smegmatis se puede usar como bioindicador para verificar las condiciones de crecimiento biológicamente relevantes. Se describen tres fenotipos de bioindicadores (densidad celular, longitud celular y fluorescencia de la coenzima F420) que indican la limitación de Zn2+ en el tipo salvaje, y se describen los cambios en estos bioindicadores para un mutante de deleción que no puede construir ribosomas alternativos. Dado que la contaminación por trazas de Zn2+ es difícil de controlar para cada lote de medios, y la cuantificación precisa de Zn2+ en cada preparación de medios es demasiado onerosa, seguir este fenotipo bioindicador es una forma accesible de validar la preparación de medios de crecimiento limitados en Zn2+. Para ayudar a identificar las condiciones adecuadas para el crecimiento limitante de Zn2+ y la producción alternativa de ribosomas, se perfilaron los cambios en los fenotipos de los bioindicadores para las preparaciones contaminadas con Zn2+ o severamente empobrecidas con Zn2+ de medios limitados en Zn2+. Se presentan más detalles para lograr el crecimiento limitante de Zn2+ y la producción alternativa de ribosomas en M. tuberculosis, junto con el fenotipo bioindicador asociado. En general, las instrucciones detalladas y los fenotipos de bioindicadores descritos aquí ayudarán a estandarizar la producción de ribosomas alternativos traduccionalmente activos en micobacterias.

Fenotipos bioindicadores de M. smegmatis 
tipo silvestre M. smegmatis cultivos crecidos en ZLM que alcanzan Zn2+-limitación del crecimiento presentan tres fenotipos bioindicadores principales cuando se comparan con células cultivadas bajo condiciones de Zn2+-condiciones de saciedad: [1] disminución de la DO600, [2] células alargadas y [3] disminución del pico de fluorescencia a 420 nm. El mutante que carece de AltRPs (ΔaltRP) no tiene el mismo Zn2+dependiente de la morfogénesis del tipo silvestre10, y su fenotipo único en Zn2+los medios limitantes pueden utilizarse como bioindicadores diferenciales. Por lo tanto, los tres parámetros bioindicadores deben evaluarse primero en el tipo silvestre cultivado en ZRM y ZLM. Si el Zn esperado2+-se observa un fenotipo silvestre limitado, el ΔaltRP la cepa con deleción debe evaluarse entonces. El crecimiento en ZLM no siempre alcanza Zn2+-condiciones limitadas, que es precisamente la razón por la que se necesitan bioindicadores. Salvaje único y ΔaltRP fenotipos bioindicadores verifican que el Zn biológicamente relevante2+se lograron condiciones limitantes. Cuando los cultivos crecidos en ZLM no alcanzan Zn2+crecimiento limitado debido al Zn2+ contaminación en el medio o en los recipientes de cultivo (ZLM-C), estos fenotipos bioindicadores serán menos pronunciados, como se muestra en Figura 1 y Figura 2. Por el contrario, si la concentración de Zn2+ en ZLM es demasiado bajo, el crecimiento se ve afectado por el Zn2+ agotamiento (ZLM-D), que se evidencia en una baja turbidez del cultivo y fenotipos alterados de los bioindicadores, también detallado en Figura 1 y Figura 2.
La densidad celular es un parámetro sólido de la limitación de Zn2+. Los cultivos crecidos en ZRM alcanzan consistentemente una alta turbidez (por encima de una DO600 de 5) después de 72 h, posiblemente formando agregados, y son visiblemente más amarillos (datos no mostrados) que los cultivos crecidos en ZLM (Figura 1A). La limitación de Zn2+ restringe el crecimiento (marcado por una disminución en la DO600) de todas las cepas en comparación con la condición repleta de Zn2+, y la cepa ΔaltRP presenta una densidad celular menor que la silvestre (Figura 1A). El crecimiento limitado en Zn2+ en ZLM produce consistentemente una DO600 superior a 3,5 y menor a 5 en la cepa silvestre, y menor a 3 en la cepa ΔaltRP (Figura 1A). Los cultivos crecidos en ZLM que presentaron contaminación con Zn2+ (ZLM-C) alcanzan una densidad celular similar (DO600 superior a 5) a la de los cultivos repletos de Zn2+ crecidos en ZRM (Figura 1A). Si la [Zn2+] en ZLM es demasiado baja, los cultivos estarán severamente deficientes en Zn2+ (ZLM-D), y el crecimiento se verá afectado, como lo demuestra la disminución de la densidad celular en los cultivos silvestres (DO600 menor a 3; Figura 1A). La densidad celular de tipo silvestre (3,5 &lt; DO600 &lt; 5) debe ser el primer punto de control fenotípico del bioindicador para verificar condiciones limitantes de Zn2+. Solo deben considerarse los cultivos silvestres que alcancen la densidad celular esperada, y el análisis de la cepa ΔaltRP debe realizarse después de confirmar el fenotipo del bioindicador limitado en Zn2+ en la cepa silvestre.
Los cultivos de fase estacionaria de tipo salvaje crecidos en ZLM limitado en Zn2+ son alargados, con una longitud celular promedio de aproximadamente 9 µm, mientras que los cultivos repletos de Zn2+ crecidos en ZRM son cortos, con una longitud celular promedio de alrededor de 3 µm (Figura 1B). Los cultivos de tipo salvaje crecidos en ZLM con contaminación de Zn2+ (ZLM-C) no se alargan completamente, pero son ligeramente más largos que las células repletas de Zn2+, con una longitud celular promedio de 5 µm. La bioindicación de contaminación de Zn2+ en lotes completos de ZLM indica una posible contaminación durante la preparación, mientras que en cultivos individuales (es decir, matraces) indica contaminación debida a un lavado inadecuado de los matraces o a la preparación del cultivo. Los cultivos de tipo salvaje crecidos en ZLM severamente agotado en Zn2+ (ZLM-D) presentan un alargamiento menos pronunciado, con una longitud celular promedio de alrededor de 7 µm (Figura 1B). El fenotipo alargado de tipo salvaje no se observa en la cepa ΔaltRP, y las células ΔaltRP limitadas en Zn2+ tienen una longitud celular promedio de alrededor de 5 µm (Figura 1B). Figura 2 muestra imágenes representativas de células crecidas en diferentes preparaciones de ZLM o ZRM (siguiendo el paso 2) y visualizadas con un microscopio compuesto de luz. Tras el paso 4, se utilizan células de múltiples campos en imágenes como la mostrada en Figura 2 para calcular la longitud celular promedio de los cultivos mostrados en Figura 1B. El fenotipo alargado de tipo salvaje es específico de condiciones limitantes de Zn2+; no se observa alargamiento celular cuando los cultivos están repletos de Zn2+ o severamente agotados en Zn2+ (Figura 1B y Figura 2).
El fenotipo del bioindicador con fluorescencia reducida de F420 se observa mejor en los escaneos de fluorescencia (Figura 1C). La disminución de la fluorescencia del cofactor F420 se cuantifica tomando el porcentaje de intensidad de fluorescencia a 375 nm (fondo) respecto a 420 nm (autofluorescencia del cofactor F420), como se describe en el paso 3.16.5, representado como F375/420. Para lectores de placas monocromáticos sin capacidad de escaneo fluorescente, lecturas puntuales a 375 nm y 420 nm (ambas con emisión a 475 nm) son adecuadas para calcular F375/420. Los cultivos de tipo salvaje crecidos en condiciones con Zn2+ suficiente (es decir, en ZRM) presentan valores altamente reproducibles de F375/420 alrededor del 17 % (Figura 1D). La reducción de la fluorescencia de F420 en cultivos limitados en Zn2+ crecidos en ZLM se marca por un aumento en F375/420 hasta aproximadamente el 27 % (Figura 1D). La fluorescencia de F420 en la cepa ΔaltRP limitada en Zn2+ es notablemente menor que la del tipo salvaje en la misma condición, lo cual es visualmente evidente en los escaneos de fluorescencia (Figura 1C). El valor de F375/420 es más variable en la cepa ΔaltRP limitada en Zn2+, con un rango de aproximadamente entre 50 % y 80 % (Figura 1D). Los cultivos crecidos en ZLM pero que muestran bioindicación de contaminación con Zn2+ (ZLM-C) presentan una reducción de F375/420 hasta aproximadamente el 21 %, y los cultivos que están agotados en Zn2+ (ZLM-D) tienen un valor de F375/420 alrededor del 35 % (Figura 1D).
En resumen, se deben evaluar tres fenotipos bioindicadores en las cepas de tipo salvaje y ΔaltRP para verificar el estado limitado en Zn2+ de los cultivos crecidos en ZLM. Los bioindicadores deben ser los siguientes para un crecimiento biológicamente relevante limitado en Zn2+: [1] la DO600 de la cepa de tipo salvaje debe estar entre 3,5 y 5, y la cepa ΔaltRP debe ser inferior a 3, [2] las células de tipo salvaje deben tener aproximadamente 10 µm de longitud, y las células ΔaltRP deben medir la mitad de esa longitud, y [3] la relación F375/420 de la cepa ΔaltRP debe ser alta, es decir, superior al 50 %.
Fenotipos bioindicadores de M. tuberculosis 
Zn2+-limitado M. tuberculosis no muestra el mismo programa morfogénico que M. smegmatis. Específicamente, no hay diferencia en la DO600 entre Zn2+-repletos y Zn2+-cultivos limitados y Zn2+los cultivos limitados no muestran ningún fenotipo morfológico evidente, es decir, no se alargan23. De manera similar, no hay un Zn2+-fenotipo bioindicador agotado (es decir, densidad celular reducida) en M. tuberculosis como se observa en M. smegmatis. Zn2+-los cultivos limitados presentan una aglomeración más evidente en comparación con Zn2+-cultivos completos, aunque ambas condiciones presentan una considerable formación de grumos al día 10 (observado tanto en Mtb-H37Rv como en Mtb-Aux). El fenotipo bioindicador clave para el Zn2+ limitación en M. tuberculosis es el pico reducido de F420 fluorescencia, como se informó previamente23. Los resultados para cultivos crecidos durante 8 días se presentan aquí en lugar de los de 10 días para minimizar la formación de agregados. Disminución de F420 la fluorescencia es evidente en Zn2+-cultivos limitados con ambos monocromáticos (Figura 3) y lectores de placas basados en filtros. Para lectores de placas basados en filtros, utilizando Mtb-H37Rv, Zn2+los cultivos limitados (es decir, crecidos en ZLM) tienen aproximadamente el 50 % de los valores de fluorescencia crudos en comparación con el Zn2+-cultivos completos (es decir, cultivados en ZRM; datos no mostrados). Utilizando un lector de placas monocromático, modo de lectura desde la base y Mtb-Aux, Zn2+-cultivos completos tienen F375/420 alrededor del 75%, y Zn2+-cultivos de ZLM contaminados tienen valores similares. Disminución de F420 fluorescencia en Zn2+-cultivos limitados crecidos en ZLM se reflejan por F375/420 de más del 100%. El Zn2+-limitado ΔaltRP la cepa tiene un crecimiento y F similares420 fluorescencia observada en el Zn2+-salvaje limitado (Figura 3) y no es útil como bioindicador en M. tuberculosis tal como está en M. smegmatis (Figura 1). Por lo tanto, es recomendable probar los medios que se utilizarán para cultivar M. tuberculosis con el rápido crecimiento M. smegmatis
<img alt="Curvas de crecimiento, distribución de longitud y análisis de fluorescencia en el estudio bacteriano; gráficos y diagramas de caja." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1: Fenotipos bioindicadores de M. smegmatis cultivado bajo Zn2+ limitación y el efecto del Zn2+ contaminación y Zn2+ agotamiento sobre los fenotipos. Ejemplos representativos del fenotipo del bioindicador mostrados en cada panel provienen de las mismas cultivos a las 72 h. Ejemplos de Zn2+-contaminado (ZLM-C), Zn2+limitado (ZLM-L) y Zn2+-depleted (ZLM-D) los resultados de crecimiento provienen de preparaciones independientes de medio que siguieron todas el mismo método de preparación presentado aquí (paso 2). Los fenotipos representativos para el Zn2+-salvaje limitado y ΔaltRP las cepas provienen del mismo lote de ZLM. Todas las cepas y condiciones tienen tres réplicas biológicas (n=3). (A) Curvas de crecimiento que muestran la densidad óptica detectada a 600 nm (OD600) y disminución de la densidad celular con Zn2+ limitación y agotamiento. Las barras de error representan la desviación estándar entre réplicas. (B) Longitudes celulares de tipo salvaje y ΔaltRP cepas que demuestran el fenotipo alargado de Zn2+-límite tipo silvestre. El diagrama de caja y bigotes muestra la distancia intercuartílica, así como las longitudes mínima, máxima y mediana de las células en µm. (C) Escaneos de fluorescencia representativos de cultivos que muestran una disminución del pico F420 fluorescencia con Zn2+ limitación y F disminuida420 fluorescencia en Zn2+-limitado ΔaltRP cepa. Solo se muestra una cultura representativa de los triplicados biológicos en cada una de las preparaciones de medio diferentes. Los escaneos de fluorescencia utilizan un rango de longitud de onda de excitación de 230 nm a 440 nm con un tamaño de paso de 5 nm y una longitud de onda de emisión de 475 nm. El panel en plano mostrado en la esquina superior izquierda es una vista ampliada del Zn2+-salvaje limitado y ΔaltRP cepas para acentuar el pico de fluorescencia disminuido a 420 nm en el Zn2+-limitado ΔaltRP cepas. Las unidades del eje son las mismas que en el gráfico principal. Todas las leyendas son iguales que en (A). (D) Cuantificación de la disminución de la fluorescencia del cofactor F420, calculado a partir del porcentaje de F375/420. Los porcentajes se calculan a partir de los valores obtenidos en los escaneos de fluorescencia en (C). El diagrama de caja y bigotes muestra la distancia intercuartílica, los porcentajes mínimo, máximo y mediano. Abreviaturas que representan el Zn2+-estado relevante del medio proporcionado entre paréntesis después del tipo de medio: R = Zn2+-repleto, C = Zn2+-contaminado, L = Zn2+-limitado, y D = Zn2+-agotado, y otras abreviaciones son: WT = cepa tipo silvestre, u.a. = unidades arbitrarias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Resultados de la electroforesis según el estado de Zn²⁺, WT frente a ΔaltRP, análisis de separación de proteínas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Imágenes representativas de microscopía de M. smegmatis a las 72 h. Las imágenes corresponden a los cultivos mostrados en la Figura 1. Las células se visualizaron mediante un microscopio óptico compuesto con un aumento total de 1000x utilizando una lente de inmersión en aceite de 100x. Las barras de escala representan 10 µm. Las abreviaturas que indican el estado relativo al Zn2+ del medio, indicadas entre paréntesis tras el tipo de medio, son: R = medio con Zn2+ abundante, C = medio contaminado con Zn2+, L = medio limitado en Zn2+ y D = medio agotado de Zn2+; otras abreviaturas son: WT = cepa silvestre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráfico del espectro de excitación de fluorescencia; longitud de onda frente a fluorescencia; análisis del estudio de proteínas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3: Pérdida del fenotipo del bioindicador F420 en M. tuberculosis limitado en Zn2+, demostrada mediante escaneos representativos de fluorescencia de Mtb auxótrofo mc26206 (Mtb-Aux). Ejemplos de resultados de crecimiento contaminados con Zn2+ y limitados en Zn2+ proceden de preparaciones independientes de medio. Las cepas silvestre y ΔaltRP limitadas en Zn2+ provienen del mismo lote de ZLM. Todas las cepas y condiciones tienen tres réplicas biológicas (n=3). Solo se muestra una cultura representativa de las réplicas biológicas en cada una de las diferentes preparaciones de medio y cepas en el gráfico. Los escaneos de fluorescencia se realizaron en modo de lectura inferior tras 8 días de crecimiento, utilizando un rango de longitud de onda de excitación de 230 nm a 440 nm con un tamaño de paso de 5 nm y una longitud de onda de emisión de 475 nm. Las abreviaturas que representan el estado relevante al Zn2+ del medio, indicadas entre paréntesis tras el tipo de medio, son: R = medio repleto de Zn2+, C = medio contaminado con Zn2+, L = medio limitado en Zn2+, D = medio agotado de Zn2+; y otras abreviaturas son: WT = cepa silvestre, a.u. = unidades arbitrarias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.</a>

Este protocolo detalla la preparación de medios limitados en Zn2+, vasos de crecimiento y cultivos de semillas para producir ribosomas limitados en Zn2+ en micobacterias. Las trazas de Zn2+ conducen al crecimiento limitante de Zn2+ y describimos las características morfogénicas utilizadas como bioindicadores para verificar la limitación de Zn2+ in vitro en la bacteria modelo, Mycobacterium smegmatis, y el patógeno humano M. tuberculosis.

Uso de Mycobacterium smegmatis como bioindicador de condiciones de crecimiento limitadas por zinc en micobacterias

Many bacteria build alternative ribosomes in Zn2+-limiting growth conditions by replacing Zn2+-binding ribosomal proteins with Zn2+-independent paralogs. ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Mycobacterium tuberculosis forma biofilms de drogas tolerantes cuando se cultivan en ciertas condiciones. Aquí se describen los métodos para el cultivo de M. biopelículas la tuberculosis y la determinación de la frecuencia de las drogas persisters tolerantes. Estos protocolos serán útiles para futuros estudios sobre los mecanismos de tolerancia a las drogas en M. la tuberculosis.

Crecimiento de Mycobacterium tuberculosis Las biopelículas

Las pruebas de diagnóstico actual sensibilidad a los antimicrobianos se basa en el crecimiento de plancton de las cepas en condiciones de nutrientes ricos y aeróbicas. En este caso, contamos con un medio alternativo de esputo artificiales para estudiar la susceptibilidad antimicrobiana de las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa, tanto en condiciones aeróbicas y microaerófilos más representativos de la fibrosis quística pulmonar.

Uso de un medio artificial de esputo para probar la eficacia de antibióticos contra la<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; En condiciones más pertinentes a la fibrosis quística pulmonar

Fuente: Gupta, S., et al. Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas en hierro. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el procedimiento para cultivar Mycobacterium tuberculosis en condiciones limitadas de hierro para inducir estrés ferropérico y promover la secreción de sideróforos que apoyan la supervivencia bacteriana.

Cultivo de Mycobacterium tuberculosis en condiciones limitadas por el hierro

Aquí, se describe un ensayo fenotípico aplicable a las pantallas de alto rendimiento / alto contenido de ARN sintético de interferencia pequeña (siRNA), compuesto químico, y bibliotecas de mutantes de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa en la detección de tuberculosis de la micobacteria fluorescentemente etiquetada dentro de la célula huésped etiquetada fluorescentemente usando microscopia confocal automatizada.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

El charcoal a gar resazurin assay (CARA) es un método semicuantitativo de rendimiento medio para evaluar la actividad de los agentes de prueba contra micobacterias que se replican, no replican o ambas.  El CARA permite una evaluación rápida de la actividad dependiente del tiempo y la concentración e identifica los parámetros a seguir mediante ensayos de unidades formadoras de colonias (UFC).

La visualización de la resazurina prueba de carbón en agar para semi-cuantitativa, Enumeración de mediano rendimiento de Micobacterias

Mycobacterium tuberculosis muestra un aumento de la producción y liberación de vesículas extracelulares en respuesta a condiciones bajas de hierro. Este trabajo detalla un protocolo para generar condiciones de hierro bajas y métodos para la purificación y caracterización de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas en respuesta a la deficiencia de hierro.

Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas por hierro

Este protocolo describe un método robusto para desarrollar biofilm de película. El método es escalable a diferentes volúmenes de cultivo, lo que permite una fácil adopción para diversos objetivos experimentales. El diseño del método permite evaluar cualitativa o cuantitativamente el potencial formador de biopelículas de varias especies de micobacterias.

Cultivo de biopelículas micobacterianas como modelo para estudiar la resistencia a los antimicrobianos

Este estudio desarrolló un ensayo para el cribado de alto rendimiento contra Mycobacterium abscessus con una cepa doble reportera de reciente creación, utilizando fluorescencia y luminiscencia para evaluar rápidamente la viabilidad bacteriana. Este protocolo será relevante para los investigadores que buscan cribar nuevos fármacos contra esta bacteria resistente a los fármacos.

Desarrollo de ensayos para el cribado de fármacos de alto rendimiento contra micobacterias

CD4 + T-linfocitos capturar usando un chip de microfluidos desechables para el VIH

Estrategias de micobacterias patógenas siguen siendo poco conocidos. El lento crecimiento de la mayoría de las especies, la naturaleza impenetrable de la pared celular, y los riesgos de trabajar con agentes patógenos que las micobacterias difíciles de estudiar y son en gran parte responsable de nuestro pobre entendimiento de estos organismos. En este video vamos a demostrar la técnica de la electroporación, que consiste en someter las células a un breve impulso eléctrico de alta para permitir...

Electroporación de micobacterias

Aprende a utilizar Mycobacterium smegmatis como bioindicador de condiciones limitadas por zinc en micobacterias. Este protocolo estandarizado permite estudiar adaptaciones fisiológicas y respuestas al estrés oxidativo en investigación de tuberculosis.

Uso de Mycobacterium smegmatis como bioindicador de condiciones de crecimiento limitadas por zinc en micobacterias

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