Name: Ablación de osteoblastos mediada por láser de dos fotones en larvas de pez cebra en desarrollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: Aprende la ablación láser de dos fotones en larvas de Danio rerio para estudiar regeneración ósea y respuesta inmune. Este método permite investigar mecanismos de inmunomodulación en regeneración ósea.

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El protocolo de estudio recibió la aprobación de la Landesdirektion Sachsen, permisos números 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. Las cepas de pez cebra utilizadas se mantuvieron de acuerdo con la legislación nacional y en condiciones estandarizadas como se describió anteriormente27,28. Los detalles de todos los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de materiales y soluciones
<ol><li>Mantener los embriones en 1x medio E3. Prepare el medio 1x E3 diluyendo 170 mL de un caldo E3 60x en 10 L de agua desionizada y agregando 2 mL de azul de metileno al 0,1%.<ol><li>Prepare el material de papel 60x E3 mezclando 17,2 g de NaCl, 0,76 g de KCl, 2,90 g de CaCl2,2 H2O, 4,90 g de MgSO4,7 H2O en 1 L de agua desionizada esterilizada en autoclave.</li>
	</ol></li>
	<li>Para la inclusión de larvas, prepare alícuotas de 1% de agarosa de bajo punto de fusión (LMA) con anticipación y manténgalas a temperatura ambiente.<ol><li>Para preparar alícuotas, disuelva LMA en 1x medio E3, por ejemplo, 500 mg de LMA en 50 mL de 1x E3 en un matraz Erlenmeyer, caliente la solución en el microondas hasta que la agarosa se disuelva por completo y dispense en alícuotas de 1 mL en tubos de 1,5 mL.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cría y recolección de embriones de pez cebra
NOTA: Aquí se utilizaron larvas dobles de pez cebra transgénicas que informaron la presencia de osteoblastos comprometidos [osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 y macrófagos [mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23]30 (Figura 1A).
<ol><li>Instale el pez cebra parental con los transgenes individuales deseados en jaulas de apareamiento estándar la noche antes del apareamiento. NOTA: Las jaulas de apareamiento estándar permiten que los huevos pasen a un compartimento inferior donde el pez cebra parental no puede alcanzarlos.<ol><li>Mantenga a los machos y las hembras separados hasta el apareamiento usando un divisor en la jaula de apareamiento. Retire el divisor en la mañana del día siguiente para iniciar el apareamiento.</li>
	</ol></li>
	<li>Al mediodía, a más tardar, retire el pez cebra parental de los tanques de cría y recoja los embriones, filtrando el agua de la jaula de apareamiento a través de un colador. NOTA: En caso de que la edad exacta de las larvas sea decisiva, coseche los embriones en intervalos regulares de aproximadamente 30 min. Los acoplamientos de embrague deben usarse en experimentos con diferentes grupos experimentales.</li>
	<li>Colocar los embriones en una placa de 100 mm de diámetro que contenga 1x medio E3 y mantenerlos en una incubadora a 28 °C31.</li>
	<li>Retire los óvulos no fertilizados y los embriones muertos del plato con una pipeta de plástico con la ayuda de un microscopio estereoscópico y cambie 1 medio E3 al día.</li>
	<li>Antes del experimento, clasifique las larvas positivas para los transgenes reporteros utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia.</li>
</ol>3. Incrustación de larvas en agarosa de bajo punto de fusión
<ol><li>Derretir las alícuotas de LMA en un termobloque o baño de agua a 65 °C. Una vez que el LMA se haya derretido, manténgalo a 42 °C hasta que se incruste (Figura 1B). Agregue 50 μL de MS-222 al 0,4 % de MS-222 al 1 mL fundido de alícuota de LMA para lograr una concentración de MS-222 del 0,02 % para anestesia.</li>
	<li>Anestesiar 4 dpf (días después de la fertilización) larvas (o larvas más viejas) en medio MS-222 E3 al 0,02%.</li>
	<li>Transfiera las larvas anestesiadas a una placa de micropocillos con fondo de vidrio utilizando una pipeta Pasteur de plástico de 3 mL y elimine el exceso de medios E3 con la misma pipeta (Figura 1B). Evite la desecación de las larvas. NOTA: Más de una larva puede estar incrustada en un plato simultáneamente; Se recomienda incrustar de 3 a 5 larvas para permitir tiempo suficiente para la colocación.</li>
	<li>Tome la agarosa LMA derretida del baño de agua/termobloque y agregue una gota (refrescante) de LMA al plato, cubriendo el fondo de vidrio donde se colocaron las larvas. Preste atención a que el LMA no esté demasiado caliente, sino que aún esté líquido.</li>
	<li>Luego, coloque las larvas en la posición lateral deseada antes de que la agarosa se solidifique. En este caso, asegúrese de que el opérculo esté lo más cerca posible del fondo de vidrio de la placa como preparación para la configuración del microscopio inverso (Figura 1B).</li>
	<li>Deje que la agarosa se solidifique y luego agregue medios E3 (que contengan un máximo de 0.02% MS-222) al plato para evitar que la agarosa se seque (Figura 1B).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática del procedimiento de incrustación. (A) Tg(osterix:nGFP) transgénico doble; Se utilizaron larvas de pez cebra con osteoblastos operculares marcados en verde y macrófagos marcados en rojo. (B) El flujo de trabajo del procedimiento de incrustación, como se describe en el paso 3 del protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
4. Imagen in vivo de las larvas y ablación con láser
<ol><li>Para ablacionar con láser osteoblastos en el opérculo en desarrollo de pez cebra transgénico Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, utilice un microscopio de barrido láser de dos fotones invertido con un objetivo de agua de 25x/0,95 o una configuración equivalente.</li>
	<li>Coloque la placa con las larvas incrustadas en la etapa microscópica del microscopio invertido y coloque la región deseada para la ablación en el centro del campo de visión. El opérculo se puede identificar fácilmente con la ayuda de la señal de fluorescencia GFP.</li>
	<li>Una vez que el opérculo esté enfocado y centrado en el campo de visión del microscopio, elija la configuración de la pila z (a menudo se utilizan intervalos z de 1-2 μm) para obtener una imagen de toda la anchura del opérculo. Al mismo tiempo, elija el área en un plano z específico que se va a ablacionar (generalmente en la zona posterior del opérculo). La ablación con láser de dos fotones solo se ejerce en este plano. NOTA: Una resolución más alta en la dimensión z conducirá a tiempos de imagen más largos, pero permitirá análisis volumétricos de los datos adquiridos más adelante.</li>
	<li>Obtener una imagen del área de interés del opérculo antes de la ablación. Para la detección de GFP, utilice un láser de luz blanca a 488 nm y un detector híbrido que vaya de 495 nm a 550 nm o equivalente. Obtenga imágenes de los macrófagos mediante excitación de 555 nm (láser de luz blanca), con un rango de detección de mCherry de 595 a 780 nm en un detector híbrido (o equivalente).<ol><li>Utilice el formato de imagen 512 x 512 para obtener una buena relación calidad/tiempo (se pueden utilizar otros formatos si se desea una resolución más alta o, alternativamente, una velocidad más alta). NOTA: Se puede utilizar y ajustar una incubadora con control de temperatura instalada en el microscopio, por ejemplo, a 28 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Dibuje una región circular con un diámetro de 25 μm (se pueden seleccionar otras formas y tamaños según el experimento) en un plano 2D seleccionado, enfocando el opérculo con la herramienta ROI.</li>
	<li>Para realizar la ablación, aplique una potencia de ablación (medida sin objetivo) a 450 mW y exponga el área seleccionada al láser de dos fotones a una velocidad de escaneo de 400 Hz y una duración total de 10 s. Durante la ablación, el área se puede visualizar utilizando un detector híbrido en el rango de 401-443 nm o equivalente.</li>
	<li>Después de la ablación, confirme la ablación estructuralmente mediante la obtención de imágenes de nuevo de la misma pila z con los mismos ajustes que se utilizaron antes de la ablación. El área ablacionada ya no contiene células fluorescentes.</li>
</ol>5. Recuperación de larvas e imágenes para monitorear el reclutamiento de células inmunitarias
<ol><li>Si es necesario realizar la obtención de imágenes del reclutamiento de células inmunitarias con retraso, recupere las larvas de la imagen y la anestesia. Retire las larvas con cuidado de la LMA con pinzas o una aguja de disección.<ol><li>Primero, retire una capa de agarosa que cubre las larvas. En segundo lugar, retire la agarosa en contacto directo con las larvas. Omita este paso si se están llevando a cabo imágenes inmediatas del reclutamiento de células inmunitarias.</li>
	</ol></li>
	<li>Vuelva a colocar las larvas en un plato con medios E3 puros y compruebe su recuperación. La recuperación es evidente por la natación de las larvas.</li>
	<li>A las 4 o 6 hpl (horas después de la lesión), se tomen imágenes del área del opérculo de nuevo utilizando los mismos ajustes en el mismo microscopio para comprobar los efectos de la ablación en el reclutamiento de macrófagos. Para ello, repita la incrustación (paso 3) y la creación de imágenes como se realizó antes (paso 4).</li>
	<li>Después de la toma de imágenes, retire las larvas de la LMA. El sacrificio de las larvas puede realizarse mediante incubación en agua helada o con una sobredosis de MS-222 en E3, dependiendo de los requisitos legales. A continuación, las muestras pueden utilizarse para estudios de seguimiento o eliminarse.</li>
</ol>6. Análisis de imágenes y análisis estadístico
<ol><li>Procese las imágenes utilizando un software de procesamiento de imágenes como Fiji32. Dependiendo de la resolución z de los datos adquiridos, los análisis se pueden realizar en 2D o 3D.</li>
	<li>Cuantifique los macrófagos manualmente incluyendo células que estén claramente separadas, por ejemplo, discerniendo los cuerpos celulares principales, o alternativamente cuantificando las células con una etiqueta nuclear o midiendo el área en caso de que las células se superpongan (siguiente paso).</li>
	<li>Para cuantificar el área, cree una máscara que abarque los macrófagos. Para ello, utilice la herramienta Imagen &gt; Ajustar &gt; umbral y cree un ROI (Herramientas de análisis &gt; &gt; Administrador de ROI &gt; agregar) en Fiji. Excluya las partículas pequeñas en el fondo para la cuantificación.<ol><li>A continuación, mida el área (Analizar &gt; medir). Considere si es necesario incluir en la medición áreas de fluorescencia celular superpuesta. NOTA: Aquí, el área de ablación circular se omitió de las mediciones del área, ya que los macrófagos reclutados no se pueden distinguir en esta área.</li>
	</ol></li>
	<li>Genere gráficos que representen los resultados de las mediciones utilizando un software adecuado. Para comparar los datos antes y después de la ablación, realice una prueba estadística adecuada (en este caso, se realizó una prueba t de una cola pareada). NOTA: Las figuras se pueden preparar utilizando software de edición de fotos y diseño gráfico.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Método de ablación láser para estudiar la regeneración ósea en larvas de pez cebra

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<li>Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+combines+with+planar+polarised+patterning+during+metaphase+to+orient+embryonic+epithelial+cell+divisions%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions.</a> Dev. 151 (10), dev202862(2024).</li>
<li>Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+complexity+of+cell+death%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Diversity and complexity of cell death: A historical review.</a> Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).</li>
<li>O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zones+of+cellular+damage+around+pulsed-laser+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds.</a> PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).</li>
<li>Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+clearance+of+damaged+tissue+following+laser+ablation+in+engineered+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues.</a> APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).</li>
<li>Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-targeted+ablation+of+the+zebrafish+embryonic+ventricle%3A+a+novel+model+of+cardiac+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair.</a> Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado, CaCl2&middot; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular, PS, 100/20 mm</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Foceps</td><td>FST</td><td>11295-51 Forma de</td><td>punta recta, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm</td></tr><tr><td>Placa Falcon de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td></td> 353502 <td></td></tr><tr><td>Plato de micropocillos con fondo de vidrio</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Plato de 35 mm, cubreobjetos n.º 1,5, diámetro de vidrio de 14 mm,</td></tr><tr><td>láser multifotónico Insight X3</td> sin recubrimiento <td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite</td><td>LAS X, Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto de fusión&nbsp;</td><td>Biozyme</td><td>840101</td><td>Biozym Placa Agarosa</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado, MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>Jaulas de</td><td></td><td></td> apareamiento <td>de muchas variedades, p. ej. Tecniplast</td></tr><tr><td>Methyleneblue</td><td>Carl Roth</td><td>A514.1</td><td></td></tr><tr><td>MS-222</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio, KCl</td><td>PanReac AppliChem 131494</td><td>Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de sodio, NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>SP8 HALCÓN&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Equipado con un láser multifotónico Insight X3 y el software Leica Application Suite</td></tr><tr><td>Aguja de disección de acero inoxidable</td><td>Bochem</td><td>12010</td> Sistema de microscopio estereoscópico de <td>140 mm</td></tr><tr><td>SZX16</td><td>Olympus</td><td></td><td>Equipado con una base de iluminación LED SZX2-ILLTQ</td></tr><tr><td>Armarios termostáticos TS - WTW</td><td>xilema</td><td>TS 608/2-i</td><td>Para incubación (embrión)</td></tr><tr><td>Transferencia pipeta, 3,5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>861171</td><td>155 x 15 mm, LD-PE, transparente</td></tr><tr><td>Zeiss SteREO Discovery.V12 versión 4.7.1.0.</td><td>Zeiss</td><td></td><td>equipado con cámara Axiocam MRm y software AxioVision</td></tr></tbody></table>

ablación de osteoblastos mediada por láser de dos fotones en larvas de pez cebra en desarrollo

Two-Photon Laser-Mediated Ablation of Osteoblasts in Developing Zebrafish Larvae

La ablación con láser se realizó como se indica en el protocolo anterior. La señal GFP de los osteoblastos en el área ablacionada desapareció instantáneamente después de la ablación. Para estudiar la respuesta de la ablación osteoblástica en términos de respuesta inmune, se visualizó la presencia de macrófagos en larvas de 6 dpf antes y a 6 hpl. Antes de la ablación, se observaron muy pocos macrófagos en el área del opérculo10 (Figura 2). A 6 hpl, se detectó una fuerte acumulación de macrófagos en la región del opérculo ablacionado y un mayor número de macrófagos en el campo de visión, incluyendo el opérculo y el área que rodea al opérculo10 (Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig02v2.jpg"> Figura 2: Reclutamiento de macrófagos a 6 hpl en larvas de pez cebra de 6 dpf. Área del opérculo sin ablación y a 6 hpl. Los osteoblastos operculares están marcados en verde, los macrófagos en magenta y el círculo discontinuo indica el área ablacionada con láser. Barra de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
También se analizó el reclutamiento de macrófagos en larvas de 4 dpf con opérculos mucho más pequeños a 4 hpl, observándose resultados similares (Figura 3). La cuantificación del número de macrófagos (fuera del sitio de ablación inmediata con láser) mostró un aumento dentro del marco de tiempo investigado (4,00 ± 2,37 macrófagos antes de la ablación frente a 7,00 ± 2,76 macrófagos a 4 hpl ) (Figura 3B). Asimismo, el área de macrófagos (medida en μm2, 785,8 μm2 ± 723,1 μm2 antes de la ablación frente a 1553 μm2 ± 869,9 μm2 a 4 hpl) aumentó (Figura 3C). Como los macrófagos a veces son difíciles de distinguir, se recomienda medir el área de los macrófagos en lugar del número de macrófagos, como se hizo aquí.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67279/67279fig03.jpg"> Figura 3: Reclutamiento de macrófagos a 4 hpl en larvas de pez cebra de 4 dpf. (A) Área del opérculo sin ablación y a 4 hpl. Los osteoblastos operculares están marcados en verde, los macrófagos en magenta y el círculo discontinuo indica el área ablacionada con láser. Barra de escala: 50 μm. (B) Cuantificación del número de macrófagos en el área del opérculo directamente antes (0 hpl) y después de la ablación (4 hpl). (C) Cuantificación del área de macrófagos (excluido el sitio de ablación láser). Pruebas t pareadas de una cola. Cada punto representa los datos de una larva, y se muestra la media ± SD, n = 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67279/67279fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Ablación de osteoblastos mediada por láser de dos fotones en larvas de pez cebra en desarrollo

Zebrafish (Danio rerio) have an outstanding capacity to regenerate different organs and appendages. Bone regeneration in zebrafish has been studied using ...

two-photon-laser-mediated-ablation-osteoblasts-developing-zebrafish

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Aquí se describe un método para el montaje de embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes, de dos fotones de imágenes y técnicas de daño a los tejidos, y de lapso de tiempo de imagen confocal.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

La lesión renal aguda (IRA) en los seres humanos es un problema clínico común causada por el daño a las células epiteliales que forman nefronas del riñón, y la lesión renal aguda se asocia con altas tasas de mortalidad del 50-70% 1. Tras la destrucción de las células epiteliales, las nefronas tienen una capacidad limitada de regeneración, aunque los mecanismos y las limitaciones que rigen este fenómeno se conoce bien. En este artículo de vídeo, describimos nuestra técnica de ablación láser...

La ablación con láser de la pronefros pez cebra para el Estudio de la regeneración epitelial renal

El método que aquí se presenta incluye el daño exacto de embriones de pez cebra en vivo con pulsos láser de alta energía y el posterior análisis de estas lesiones y su recuperación con el tiempo. También mostramos cómo genéticamente etiquetado individual o grupos de células del músculo esquelético se puede seguir durante y después de la luz láser daño inducido.

Laser-infligido lesiones de músculo esquelético embrionario de pez cebra

Este video describe el método para dañar los axones en embriones de pez cebra utilizando axotomía con láser de dos fotones y observando la recuperación axonal de la lesión.

Axotomía láser de dos fotones: un método para dañar los axones en embriones de pez cebra y observar la recuperación axonal

Source: Morsch, M.,  et. al., desencadenando el estrés y la muerte celular utilizando microscopía confocal convencional con láser UV. J. Vis. Exp. (2017) En este video, exploramos la técnica de ablación con láser UV de alta intensidad para apuntar y estudiar con precisión las neuronas individuales en el pez cebra transgénico. Demostramos cómo preparar, inmovilizar y visualizar las respuestas neuronales, destacando la dinámica celular de la lesión y la recuperación.

Ablación selectiva con láser de una sola neurona en una larva de pez cebra utilizando un microscopio confocal

Fuente: Muto, A., et al. Ablación de una población neuronal mediante láser de dos fotones y su evaluación mediante imágenes de calcio y registro de comportamiento en larvas de pez cebra. J. Vis. Exp. (2018) En este video,  Se demuestra un procedimiento de ablación con láser de dos fotones, que permite la destrucción selectiva de neuronas fluorescentes en larvas de pez cebra inmovilizadas con agarosa. Las imágenes de alta resolución antes y después del procedimiento confirman un daño neuronal...

Ablación neuronal dirigida mediante microscopía de dos fotones en un pez cebra Larava

Aquí, presentamos un protocolo para ablación de una subpoblación genéticamente marcada de neuronas por un láser de dos fotones de larvas de pez cebra.

Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra

La ablación láser es una tecnología ampliamente aplicable para el estudio de la regeneración en sistemas biológicos. El protocolo presentado describe el uso de un microscopio confocal de escaneo láser estándar para la ablación láser y la posterior imagen de lapso de tiempo de las células interneuromas regeneradoras en la línea lateral del pez cebra.

Ensayo de regeneración y ablación láser basado en microscopio confocal en células interneuromas de peces cebra

El desarrollo embrionario requiere una coordinación a gran escala del movimiento celular. La ablación láser mediada por excitación de dos fotones permite la ablación tridimensional controlada espacialmente de grandes grupos de células profundas. Además, esta técnica puede sondear la reacción de las células que migran colectivamente in vivo a las perturbaciones en su entorno mecánico.

Ablaciones de volumen profundas y espacialmente controladas utilizando un microscopio de dos fotones en la gastrula del pez cebra

Presentamos un protocolo para capturar la dinámica de la regeneración de la aleta caudal de las larvas de pez cebra a escala de tejido completo utilizando estereomicroscopía basada en campo claro. Esta técnica permite capturar la dinámica de regeneración con resolución de una sola célula. Esta metodología se puede adaptar a cualquier microscopio estereoscópico equipado con una cámara CCD y software de lapso de tiempo.

La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

Aprende la ablación láser de dos fotones en larvas de Danio rerio para estudiar regeneración ósea y respuesta inmune. Este método permite investigar mecanismos de inmunomodulación en regeneración ósea.

Ablación de osteoblastos mediada por láser de dos fotones en larvas de pez cebra en desarrollo

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