Name: Un ensayo toxicológico y ecotoxicológico basado en la motilidad de los hemocitos del mejillón (Mytilus galloprovincialis) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Aprende a evaluar la toxicidad de contaminantes mediante la motilidad de hemocitos de Mytilus galloprovincialis. Este método in vitro ofrece una alternativa ética para el monitoreo ambiental y la evaluación de riesgos ecológicos.

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<ol><li>Di Paolo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioassay+battery+interlaboratory+investigation+of+emerging+contaminants+in+spiked+water+extracts+-+Towards+the+implementation+of+bioanalytical+monitoring+tools+in+water+quality+assessment+and+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Bioassay battery interlaboratory investigation of emerging contaminants in spiked water extracts - Towards the implementation of bioanalytical monitoring tools in water quality assessment and monitoring.</a> Water Res. 104, 473-484 (2016).</li>
<li>Brack, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect-based+methods+are+key.+The+European+Collaborative+Project+SOLUTIONS+recommends+integrating+effect-based+methods+for+diagnosis+and+monitoring+of+water+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Eur%22%5BJournal%5D)">Effect-based methods are key. The European Collaborative Project SOLUTIONS recommends integrating effect-based methods for diagnosis and monitoring of water quality.</a> Environ Sci Eur. 31 (1), 10(2019).</li>
<li>Lionetto, M. G., Caricato, R., Erroi, E., Giordano, M. E., Schettino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+application+of+carbonic+anhydrase+activity+in+bioassay+and+biomarker+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Ecol%22%5BJournal%5D)">Potential application of carbonic anhydrase activity in bioassay and biomarker studies.</a> Chem Ecol. 22 (sup1), S119-S125 (2006).</li>
<li>Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollution+biomarkers+in+the+framework+of+marine+biodiversity+conservation%3A+State+of+art+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Water%22%5BJournal%5D)">Pollution biomarkers in the framework of marine biodiversity conservation: State of art and perspectives.</a> Water. 13 (13), 1847(2021).</li>
<li>Connon, R. E., Geist, J., Werner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect-based+tools+for+monitoring+and+predicting+the+ecotoxicological+effects+of+chemicals+in+the+aquatic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Effect-based tools for monitoring and predicting the ecotoxicological effects of chemicals in the aquatic environment.</a> Sensors. 12 (9), 12741-12771 (2012).</li>
<li>Fabbri, E., Valbonesi, P., Moon, T. W. Pharmaceuticals in the marine environment: Occurrence, fate, and biological effects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFabbri%2C+E+%22Contaminants+of+Emerging+Concern+in+the+Marine+Environment%22">Contaminants of Emerging Concern in the Marine Environment</a>. León, V. M., Bellas, J. Chapter 2, Elsevier. Amsterdam. 11-71 (2023).</li>
<li>Lionetto, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+of+model+polyethylene+terephthalate+nanoplastics+for+cell+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence of model polyethylene terephthalate nanoplastics for cell interaction studies.</a> Nanomaterials. 12 (9), 1560(2022).</li>
<li>Damiens, G., Gnassia-Barelli, M., Loquès, F., Roméo, M., Salbert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+biomarker+response+index+as+a+useful+tool+for+environmental+assessment+evaluated+using+transplanted+mussels%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Integrated biomarker response index as a useful tool for environmental assessment evaluated using transplanted mussels.</a> Chemosphere. 66 (3), 574-583 (2007).</li>
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<li>Caricato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrase+integrated+into+a+multimarker+approach+for+the+detection+of+the+stress+status+induced+by+pollution+exposure+in+Mytilus+galloprovincialis%3A+A+field+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrase integrated into a multimarker approach for the detection of the stress status induced by pollution exposure in Mytilus galloprovincialis: A field case study.</a> Sci Total Environ. 690, 140-150 (2019).</li>
<li>Calisi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+alterations+in+hemocytes+of+Mytilus+galloprovincialis+exposed+in+high-impact+anthropogenic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Environ+Res%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional alterations in hemocytes of Mytilus galloprovincialis exposed in high-impact anthropogenic sites.</a> Mar Environ Res. 188, 105988(2023).</li>
<li>Viarengo, A., Burlando, B., Evangelisti, V., Mozzone, S., Dondero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+specificity+of+metallothionein+as+a+biomarker+for+aquatic+environment+biomonitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers+in+Marine+Organisms%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and specificity of metallothionein as a biomarker for aquatic environment biomonitoring.</a> Biomarkers in Marine Organisms. Garrigues, F., Barth, H., Walker, C. H., Narbonne, J. F. , Elsevier Science. Amsterdam. 29-43 (2001).</li>
<li>Bocchetti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contaminant+accumulation+and+biomarker+responses+in+caged+mussels%2C+Mytilus+galloprovincialis%2C+to+evaluate+bioavailability+and+toxicological+effects+of+remobilized+chemicals+during+dredging+and+disposal+operations+in+harbor+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Contaminant accumulation and biomarker responses in caged mussels, Mytilus galloprovincialis, to evaluate bioavailability and toxicological effects of remobilized chemicals during dredging and disposal operations in harbor areas.</a> Aquat Toxicol. 89 (3), 257-266 (2008).</li>
<li>Calisi, A., Lionetto, M. G., Caricato, R., Giordano, M. E., Schettino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+alterations+in+Mytilus+galloprovincialis+granulocytes%3A+A+new+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Toxicol+Chem%22%5BJournal%5D)">Morphometric alterations in Mytilus galloprovincialis granulocytes: A new biomarker.</a> Environ Toxicol Chem. 26 (6), 1435-1441 (2007).</li>
<li>Burgos-Aceves, M. A., Faggio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+the+study+of+the+immunity+functions+of+bivalve+haemocytes%3A+Physiology+and+molecular+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">An approach to the study of the immunity functions of bivalve haemocytes: Physiology and molecular aspects.</a> Fish Shellfish Immunol. 67 (6), 513-517 (2017).</li>
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<li>Novas, A., Barcia, R., Ramos-Martínez, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+production+by+hemocytes+from+Mytilus+galloprovincialis+shows+seasonal+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide production by hemocytes from Mytilus galloprovincialis shows seasonal variations.</a> Fish Shellfish Immunol. 23 (4), 886-891 (2007).</li>
<li>Pruzzo, C., Gallo, G., Canesi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+vibrios+in+marine+bivalves%3A+The+role+of+interactions+with+hemolymph+components%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persistence of vibrios in marine bivalves: The role of interactions with hemolymph components.</a> Environ Microbiol. 7 (5), 761-772 (2005).</li>
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<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li>
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<li>Furukawa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemocyte+migration+and+expression+of+four+Sox+genes+during+wound+healing+in+Pacific+abalone%2C+Haliotis+discus+hannai%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hemocyte migration and expression of four Sox genes during wound healing in Pacific abalone, Haliotis discus hannai.</a> Fish Shellfish Immunol. 117, 24-35 (2021).</li>
<li>Lau, Y., Gambino, L., Santos, B., Espinosa, E., Allam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+oyster+%28Crassostrea+virginica%29+hemocyte+motility+by+the+intracellular+parasite+Perkinsus+marinus%3A+A+possible+mechanism+for+host+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of oyster (Crassostrea virginica) hemocyte motility by the intracellular parasite Perkinsus marinus: A possible mechanism for host infection.</a> Fish Shellfish Immunol. 78, 18-25 (2018).</li>
<li>Gendre, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+hemocyte+motility+by+chemical+and+biological+stresses+in+Mytilus+edulis+and+Dreissena+polymorpha%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Modulation of hemocyte motility by chemical and biological stresses in Mytilus edulis and Dreissena polymorpha.</a> Fish Shellfish Immunol. 139, 108919(2023).</li>
<li>Kaloyianni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+effects+of+inorganic+and+organic+contaminants+on+haemolymph+of+mussels%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C%3A+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Oxidative effects of inorganic and organic contaminants on haemolymph of mussels.</a> Comp Biochem Physiol C: Toxicol Pharmacol. 149 (4), 631-639 (2009).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,2 y micro; m filtro (diámetro 25 mm)</td><td>ABLUO&nbsp;</td><td></td><td>material de laboratorio</td></tr><tr><td>jeringa hipodérmica de 2,5 ml needdle 22G</td><td>Rays</td><td>2522CM32</td><td>material</td></tr><tr><td>de laboratorio poliestireno de fondo plano de 96 pocillos Microplaca tratada con TC</td><td>Corning</td><td>3916</td><td>material</td></tr><tr><td>de laboratorio CaCl2.2H2O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>C3881-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Quimiotaxis química y software de la herramienta de migración &nbsp;</td><td>(Ibidi GmbH)</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>Cytation 5&nbsp;</td><td>Equipo de citación Agilent BioTeck</td><td>5</td><td>: Lector multimodo de imágenes celulares Sulfóxido</td></tr><tr><td>de dimetilo (DMSO)&nbsp;</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>472301</td><td>Solvente</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Tubo de fondo cónico</td><td>Corning</td><td>352196</td><td>material</td></tr><tr><td>de laboratorio H3BO3</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>B0394</td><td>Hemocitómetro químico</td></tr><tr><td>de lectura rápida 102</td><td>Biosigma</td><td>BVS100</td><td>material de laboratorio</td></tr><tr><td>HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfónico)</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>H3375-500G</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td></td><td>software</td></tr><tr><td>KBr</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>P9881</td><td>Químico</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk&nbsp;</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td> química <td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>G7513</td><td>Aminoácido esencial para medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio químico Nikon Eclipse E600</td><td>Equipo Nikon</td><td></td><td>: Imágenes celulares&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Riedel-de Haen</td><td>31481</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>31434-1KG-R</td><td>Químico</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fluka</td><td>71519 500g</td><td>Químico</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>S5761-1KG</td><td>Merk rojo químico</td></tr><tr><td>neutro</td><td>(Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>N4638-1G</td><td>Colorante celular vital</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>P0781-100ML</td><td>Antibióticos para cultivos celulares</td></tr><tr><td>SrCl2&middot; 6H2O</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>255521</td><td>Azul de</td></tr><tr><td>tripano químico&nbsp;</td><td>Merk (Sigma - Aldrich)&nbsp;</td><td>T8154</td><td>Tinte celular</td></tr></tbody></table>

un ensayo toxicológico y ecotoxicológico basado en la motilidad de los hemocitos del mejillón (mytilus galloprovincialis)

A Toxicological and Ecotoxicological Assay Based on Mussel (Mytilus galloprovincialis) Hemocytes Motility

El estudio presenta un nuevo método in vitro para evaluar de forma rápida y sensible la toxicidad y ecotoxicidad de los contaminantes, utilizando la motilidad de los hemocitos Mytilus galloprovincialis. La Figura 1A-C muestra imágenes representativas de lapso de tiempo de los hemocitos después de 30 minutos de fijación al fondo del pocillo. Las células de la figura se tiñeron con rojo neutro justo antes de la evaluación de la motilidad. Los movimientos de las células se monitorizaron mediante microscopía óptica a una velocidad de una imagen por minuto durante 10 minutos, con un aumento de 20x, con un lector multimodo. La figura 1A-C muestra tres de los 11 fotogramas capturados de la misma región de interés (ROI) a 0 min, 5 min y 10 min. Las mismas celdas están numeradas en las tres figuras para resaltar su movimiento, y la numeración permanece constante en todas las figuras para ilustrar claramente sus trayectorias.
Las células muestran movimientos unicelulares basados en la actividad de los lamelipodios y cambios rápidos de forma. Las células fueron marcadas con el tinte vital rojo neutro para mejorar su visualización durante el seguimiento. El rojo neutro es un colorante catiónico anfifílico y débil que puede penetrar fácilmente en la membrana celular. Una vez dentro de las células, el tinte queda atrapado en los lisosomas debido a la protonación. Los hemocitos de mejillón, particularmente los granulocitos, muestran un sistema lisosomal bien desarrollado; por lo tanto, se visualizan bien mediante tinción de rojo neutro, con el citoplasma rico en varios lisosomas marcados con rojo y el núcleo (no marcado por el colorante) que aparece como un agujero translúcido.
A través de la aplicación del protocolo, se pueden observar dos morfotipos principales de hemocitos según Udayan et al.23: (1) células diseminadas con forma de frijol bipolar y a veces un contorno ameboide, y células más pequeñas en forma de estrella redonda (células n = 3 y 10). En ambos tipos de células, el movimiento se caracterizó por cambios continuos de forma, con extensión y retracción continuas de seudópodos y filopodios.
La aplicación del protocolo permite evaluar con éxito la motilidad de los hemocitos mediante la construcción de gráficos de trayectoria, como se informa en la Figura 2, y el cálculo de los principales parámetros velocimétricos, como la velocidad media y la dirección. Estos correspondieron respectivamente a 6,46 ± 0,2 μm/min y 0,56 ± 0,02 (media ± SEM) para las células diseminadas y 5,18 ± 0,34 μm/min y 0,37 ± 0,03 para las células pequeñas, respectivamente en condiciones fisiológicas basales después de 30 min de adhesión al fondo del pocillo. Por lo tanto, el protocolo permite la clasificación de diferentes poblaciones de hemocitos en función de parámetros velocimétricos.
A través de la aplicación del protocolo, se pueden detectar alteraciones en el parámetro velocimétrico de la motilidad de los hemocitos tras la exposición a fármacos o contaminantes. En la Figura 3A-D se muestran los resultados representativos de la exposición in vitro de hemocitos de mejillón al paracetamol, que es uno de los fármacos liberados al medio ambiente (PiE) con mayor concentración y mayor frecuencia de detección en ríos de todo el mundo31.
De acuerdo con Udayan et al.23, en las células control se observó un aumento significativo de la velocidad con el tiempo en ambos morfotipos celulares, lo que sugiere la activación de los hemocitos durante el cultivo de 24 h, presumiblemente evocador de la respuesta inflamatoria inducida experimentalmente por la retirada y la siembra en el ambiente de cultivo. Cuando las células se expusieron al fármaco, la activación de la motilidad de los hemocitos se redujo significativamente en las células diseminadas (Figura 3A) después de 24 h, pero no en las células redondas pequeñas (Figura 3C), caracterizadas por una velocidad basal media más baja (evaluada en el tiempo 0). Además, el protocolo permitió la detección de alteraciones en la trayectoria celular tras la exposición al fármaco, como lo indica el aumento significativo de la directividad de las células pequeñas después de 24 h y la disminución de la directividad después de 1 h de exposición en las células diseminadas (Figura 3C,D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig01.jpg"> 
Figura 1: Imagen representativa de lapso de tiempo de hemocitos teñidos en rojo neutro después de 30 minutos de fijación al fondo del pocillo. Las células se tiñeron con el colorante vital rojo neutro justo antes de la evaluación de la motilidad. Los movimientos de las células se monitorizaron mediante microscopía óptica a una velocidad de una imagen por minuto durante 10 minutos con un aumento de 20x. En aras de la brevedad, los paneles A, B y C muestran tres de los 11 fotogramas capturados de la misma región de interés (ROI) a 0 min, 5 min y 10 min. Las mismas celdas están numeradas en las tres figuras para ilustrar su movimiento, y las flechas indican los intervalos de tiempo. Las barras de escala representan 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig02.jpg"> 
Figura 2: Gráfico representativo de la trayectoria de los hemocitos M. galloprovincialis . Las trayectorias mostradas provienen de un solo pozo. Se muestran las trayectorias de 25 celdas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67285/67285fig03v2.jpg"> 
Figura 3: Efecto de la exposición al paracetamol (24 h) sobre la velocidad y la directividad de las células diseminadas (A,B) y de las pequeñas células redondas en forma de estrella (C,D). Los datos se expresan como media ± SEM. La significancia estadística de los datos se evaluó mediante ANOVA de un factor y postest de Tukey. *p &lt; 0.05 vs. control (p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67285/67285fig03largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Un ensayo toxicológico y ecotoxicológico basado en la motilidad de los hemocitos del mejillón (Mytilus galloprovincialis)

Hemocytes are the circulating immune-competent cells in bivalve mollusks and play a key role in several important functions of cell-mediated innate ...

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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