Name: Extracción y análisis zimográfico de gelatinasas bacterianas en un solo paso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Aprende a extraer y analizar gelatinasas activas de Leptospira mediante zimografía en un solo paso. Este protocolo simplificado facilita el aislamiento de proteínas de membrana para estudios de patogénesis y descubrimiento de vacunas.

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<ol><li>Yue, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Biology of the extracellular matrix.</a> J Glaucoma. 23 (8 Suppl 1), S20-S23 (2014).</li>
<li>Cabral-Pacheco, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The roles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human diseases.</a> Int J Mol Sci. 21 (24), 1-53 (2020).</li>
<li>Ambili, M., Jayasree, K., Sudhakaran, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((60K+gelatinase+involved+in+mammary+gland+involution+is+regulated+by+%CE%B2-oestradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">60K gelatinase involved in mammary gland involution is regulated by β-oestradiol.</a> Biochim Biophys Acta. 1403 (3), 219-231 (1998).</li>
<li>Zhang, Y. -Z., Ran, L. -Y., Li, C. -Y., Chen, X. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+structures%2C+and+collagen-degrading+mechanisms+of+bacterial+collagenolytic+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diversity, structures, and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteases.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li>
<li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+collagenases+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial collagenases - A review.</a> Crit Rev Microbiol. 42 (1), 106-126 (2016).</li>
<li>Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+46+kDa+gelatinase+on+the+outer+membrane+of+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira.</a> Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).</li>
<li>Kramer, R. A., Zandwijken, D., Egmond, M. R., Dekker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+folding%2C+purification+and+characterization+of+Escherichia+coli+outer+membrane+protease+OmpT%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">In vitro folding, purification and characterization of Escherichia coli outer membrane protease OmpT.</a> Eur J Biochem. 267 (3), 885-893 (2000).</li>
<li>Kum, S. L., Ho, J. C. S., Parikh, A. N., Liedberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+membrane+environments+regulate+enzymatic+behaviors+of+Salmonella+outer+membrane+protease%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Bio+Med+Chem+Au%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic membrane environments regulate enzymatic behaviors of Salmonella outer membrane protease.</a> ACS Bio Med Chem Au. 2 (1), 73-83 (2022).</li>
<li>Sarma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+proteome+analysis+shows+the+abundance+of+histidine+kinase+sensor+protein%2C+DNA+helicase%2C+putative+lipoprotein+containing+peptidase+M75+domain+and+peptidase+C39+domain+protein+in+Leptospira+interrogans+grown+in+EMJH+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Extracellular proteome analysis shows the abundance of histidine kinase sensor protein, DNA helicase, putative lipoprotein containing peptidase M75 domain and peptidase C39 domain protein in Leptospira interrogans grown in EMJH medium.</a> Pathogens. 10 (7), 852(2021).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Levy, D., Gulik, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+vesicle+solubilization+and+reconstitution+by+detergents.+Symmetrical+analysis+of+the+two+processes+using+octaethylene+glycol+mono-n-dodecyl+ether%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid vesicle solubilization and reconstitution by detergents. Symmetrical analysis of the two processes using octaethylene glycol mono-n-dodecyl ether.</a> Biochemistry. 29 (40), 9480-9488 (1990).</li>
<li>Lichtenberg, D., Ahyayauch, H., Alonso, A., Goñi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+solubilization+of+lipid+bilayers%3A+a+balance+of+driving+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Detergent solubilization of lipid bilayers: a balance of driving forces.</a> Trends Biochem Sci. 38 (2), 85-93 (2013).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Zeug, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+microscopic+methods+for+the+neural+ECM+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Current microscopic methods for the neural ECM analysis.</a> Prog Brain Res. 214, 287-312 (2014).</li>
<li>Madathiparambil, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zymography+analysis+of+proteinase+activity+present+in+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A zymography analysis of proteinase activity present in Leptospira.</a> Curr Microbiol. 62 (3), 917-922 (2011).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ácido 6-aminocaproico</td><td>Merck</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; 695092</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; 32201</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; A-3553</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; A-3678</td><td></td></tr><tr><td>Bis Acrilamida</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; M7279</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina fracción V (BSA)</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; A-8022</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; B-8026</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie azul brillante</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>1.12553</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Ellinghausen&ndash; McCullough&ndash; Johnson&ndash; Harris (EMJH) medio, Difco</td><td>&nbsp; Difco</td><td>&nbsp; 279410</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Merck</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicina G8790</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; G-8898</td><td></td></tr><tr><td>Leptospira interrogans serovar Copenhageni cepa Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198), mantenida en el biorepositorio de ICMR-RMRC Portblair</td><td>Mantenido en el biorepositorio del ICMR-RMRC Port Blair</td><td></td><td>Temperatura óptima de crecimiento 30 ° C</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio M8266</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; M8266</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; 17995-7</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>P4417&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta de separación de placas</td><td>Wonder Wedgle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Termocientífico</td><td>FIBERLite F15 8x50 cy</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; L-4396</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; T-9281</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma (TRIS)&nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp; Sigma</td><td>&nbsp; T6066</td><td></td></tr></tbody></table>

extracción y análisis zimográfico de gelatinasas bacterianas en un solo paso

One-step Extraction and Zymographic Analysis of Bacterial Gelatinases

El resultado muestra el zimograma de la proteína leptoespiral y las gelatinasas del suero humano. Los resultados, que se muestran en la Figura 1, representan las proteasas como bandas blancas claras sobre un fondo azul. Las bandas representan áreas donde la gelatina copolimerizada se degrada y, por lo tanto, no se tiñe, mientras que otras áreas de todo el gel se tiñen de azul debido a la presencia de gelatina. Además, muestra que, aunque la gelatina también es una proteína, no se eluye en la...

Extracción y análisis zimográfico de gelatinasas bacterianas en un solo paso

Proteinases of pathogenic bacteria contribute to invasion and pathogenesis by actively degrading the host's extracellular matrix (ECM) components and ...

one-step-extraction-and-zymographic-analysis-of-bacterial-gelatinases

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo describe un ensayo basado en actividades para la detección de metaloproteinasas de la matriz en sobrenadantes de cultivo o los fluidos corporales.

La detección de metaloproteinasas de la matriz funcional por Zymography

Un conjunto de straight-forward de los métodos para aislar y determinar la identidad de las proteínas más abundantes se expresa en el músculo esquelético. Cerca de 800 puntos se vislumbran en un gel bidimensional de los músculos de 10 mg, lo que permite la determinación de los específicos de género expresión de la proteína. Estos métodos dan resultados equivalentes en la mayoría de los tejidos.

Músculo Esquelético dimorfismo de género de Proteómica

Recientemente hemos informado de un nuevo enfoque para la generación de sondas fluorogénicos DNAzyme que se pueden aplicar para crear un simple, "mezclar y leer" ensayo de inmunofluorescencia para la detección de bacterias. Estas sondas de ADN especiales catalizar la escisión de un cromóforo modificado con ADN-ARN sustrato quimérico en la presencia de la mezcla bruta extracelular (CEM), producida por una bacteria específica, con lo que la traducción de detección de bacterias en la generación de...

La detección de bacterias mediante ADNzimas fluorogénicos

Se describe el método para producir prototípico cubreobjetos de microscopio recubiertos de gelatina fluorescente para visualizar invadopodios mediada por la degradación de la matriz. Técnicas computacionales utilizando software disponible se presentan para la cuantificación de los niveles resultantes de la proteólisis matriz por las células individuales dentro de una población mixta y para los grupos multicelulares que abarcan todo campos microscópicos.

La medición cuantitativa de invadopodios mediada por proteolisis de la matriz extracelular en contextos simples y multicelulares

En este video, realizamos zimografía, una técnica electroforética, para analizar la actividad proteolítica dentro de muestras biológicas.

Zimografía de péptidos fluorescentes: una técnica modificada para detectar la actividad de la proteasa utilizando sustratos fluorogénicos en geles de zimograma

Este video muestra la técnica de electroforesis en gel de zimografía para evaluar la actividad de las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) presentes en el sobrenadante de cultivo celular. Las MMP activas degradan el sustrato específico de MMP incrustado en un gel de poliacrilamida, que aparece como bandas transparentes sobre un fondo teñido oscuro después de la tinción.

Electroforesis en gel de zimografía: una técnica electroforética para detectar metaloproteinasas de matriz mediante la evaluación de la actividad enzimática

Los miembros del género Burkholderia son patógenos de importancia clínica. Se describe un método para la extracción de proteína total bacteriana, usando disrupción mecánica, y electroforesis en gel 2-D para el análisis proteómico posterior.

Extracción de proteínas totales y 2-D Métodos gel de electroforesis para<em&gt; Burkholderia</em&gt; Especies

Aquí, presentamos un protocolo detallado para una técnica de zymographic modificada en la que se utilizan péptidos fluorescentes como el substrato degradable en lugar de proteínas nativas. Electroforesis de muestras biológicas en isoenzimáticos péptido fluorescente permite la detección de una gama más amplia de las proteasas que las anteriores técnicas de zymographic.

Detección de actividad de la proteasa por Zymography péptido fluorescente

Los análogos de la trehalosa están emergiendo como moléculas importantes para aplicaciones bio(tecnológicas) y biomédicas. Describimos un protocolo optimizado para sintetizar y purificar enzimáticamente análogos de trehalosa que es simple, eficiente, rápido y respetuoso con el medio ambiente. Se demuestra su aplicación a la producción y administración rápida de una sonda para la detección de micobacterias.

Rápida de un solo paso Síntesis enzimática y All-Purificación acuosa de trehalosa Análogos

La composición proteica de la válvula mitral humana sigue siendo parcialmente desconocida, debido a que su análisis se complica por baja celularidad y por lo tanto por biosíntesis baja en proteínas. Este trabajo proporciona un protocolo para la extracción eficiente de proteínas para el análisis del proteoma de la válvula mitral.

Protocolo optimizado para la extracción de proteínas de la válvula mitral humana

Aprende a extraer y analizar gelatinasas activas de Leptospira mediante zimografía en un solo paso. Este protocolo simplificado facilita el aislamiento de proteínas de membrana para estudios de patogénesis y descubrimiento de vacunas.

Extracción y análisis zimográfico de gelatinasas bacterianas en un solo paso

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