Name: Deleción génica mediada por CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: Aprende a realizar deleción génica con CRISPR-Cas9 en células madre embrionarias humanas H9 cultivadas sin alimentadores. Este método establece un sistema de entrega lentiviral eficaz para investigación en biología del desarrollo y medicina regenerativa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Jiang, F., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+structures+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 structures and mechanisms.</a> Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Xue, C., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathway+choices+in+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing.</a> Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+genome-editing+system+in+human+stem+cells%3A+Current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 genome-editing system in human stem cells: Current status and future prospects.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 9, 230-241 (2017).</li>
<li>Qiu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYC+regulation+of+D2HGDH+and+L2HGDH+influences+the+epigenome+and+epitranscriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">MYC regulation of D2HGDH and L2HGDH influences the epigenome and epitranscriptome.</a> Cell Chem Biol. 27 (5), 538-550.e537 (2020).</li>
<li>Sheikh, M. A., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+mediated+delivery+of+shRNAs+to+hESCs+and+NPCs+using+low-cost+cationic+polymer+polyethylenimine+%28PEI%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentiviral mediated delivery of shRNAs to hESCs and NPCs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (PEI).</a> J Vis Exp. (183), e63953(2022).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+cost-effective+method+for+screening+of+CRISPR%2FCas9-induced+homozygous%2Fbiallelic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and cost-effective method for screening of CRISPR/Cas9-induced homozygous/biallelic mutants.</a> Plant Methods. 14 (1), 40(2018).</li>
<li>Ardah, M. T., Parween, S., Varghese, D. S., Emerald, B. S., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saturated+fatty+acid+alters+embryonic+cortical+neurogenesis+through+modulation+of+gene+expression+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Saturated fatty acid alters embryonic cortical neurogenesis through modulation of gene expression in neural stem cells.</a> J Nutr Biochem. 62, 230-246 (2018).</li>
<li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation.</a> Front Cell Neurosci. 11, 415(2017).</li>
<li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient-sensitive+protein+O-GlcNAcylation+modulates+the+transcriptome+through+epigenetic+mechanisms+during+embryonic+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Nutrient-sensitive protein O-GlcNAcylation modulates the transcriptome through epigenetic mechanisms during embryonic neurogenesis.</a> Life Sci Alliance. 5 (8), e202201385(2022).</li>
<li>Varghese, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+modeling+of+hepatogenesis+using+obese+iPSCs-hepatocyte+differentiation+uncovers+pathological+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Developmental modeling of hepatogenesis using obese iPSCs-hepatocyte differentiation uncovers pathological features.</a> Cell Death Dis. 13 (7), 670(2022).</li>
<li>Varghese, D. S., Alawathugoda, T. T., Ansari, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+hepatocyte+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells%3A+Growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of hepatocyte differentiation from human embryonic stem cells: Growth factor.</a> Stem Cells Int. 2019 (5), 5968236(2019).</li>
<li>Jacobs, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+na%C3%AFve+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in naïve human embryonic stem cells.</a> Sci Rep. 7 (1), 16650(2017).</li>
<li>Cuevas-Ocaña, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+optimized+approach+for+rapid+and+efficient+gene+editing+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">A cell-based optimized approach for rapid and efficient gene editing of human pluripotent stem cells.</a> Int J Mol Sci. 24 (3), 12345(2023).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+incidence+of+off-target+mutations+in+individual+CRISPR-Cas9+and+TALEN-targeted+human+stem+cell+clones+detected+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN-targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).</li>
<li>Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+sequencing+analysis+reveals+high+specificity+of+CRISPR%2FCas9+and+TALEN-based+genome+editing+in+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 12-13 (2014).</li>
<li>Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+effects+in+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 4 (7), e264(2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-MERCAPTOETANOL&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38,5 mL, estéril + Libre Certificado Tubos Ultratransparentes de pared delgada abiertos </td><td>Beckman Coulter</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Invitrogen</td> humano recombinante <td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury Rabbit mAb</td><td>Abclonal</td><td>A5078</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI-v2</td><td>NEB</td><td>R0739S</td><td></td></tr><tr><td>chir99021</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matriz de membrana basal, sin LDEV</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopamine</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM media</td><td>Invitrogen 11995073</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM NUTRIENT MIX F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DPBS sin: Ca y Mg</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovie</td><td>Invitrogen 10270106</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FoxA2/HNF3&beta; &nbsp;</td><td>CST</td><td>8186</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Anticuerpo mAb de conejo</td><td>CST</td><td>2118S</td> Reactivo de <td></td></tr><tr><td>disociación celular suave</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Aminoácidos no esenciales (NEAA) Solución 100x GE</td><td>healthcare</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 (D3B5) mAb de conejo</td><td>CST</td><td>9129</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Reemplazo</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L GLUTAMINA, 100x</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2H-BMSBSP-F1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH Anticuerpo policlonal</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA1-R</td><td>Macrogen</td><td></td><td>AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG</td></tr><tr><td>L2HGDH-SgRNA2-R</td><td>Macrogen</td><td></td><td>AAACCCGGCGAA AAGCCCGGGGGC</td></tr><tr><td>L2H-SeqF1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG</td></tr><tr><td>L2H-SeqR1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>L2H-UMSBSP-R1</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG</td></tr><tr><td>LentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 medios completos</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Nanog Anticuerpo</td><td>CST</td><td>3580</td><td></td></tr><tr><td>MEDIO NEUROBASAL 1x CTS</td><td>Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 Suplemento 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 Suplemento 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 Anticuerpo</td><td>CST</td><td>2750</td><td></td></tr><tr><td>Pax6 (D3A9V) XP Conejo mAb</td><td>CST</td><td>60433</td><td></td></tr><tr><td>PENICILINA ESTREPTOMICINA SOL</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo para infección por polibreno</td><td>Sigma</td><td>TR1003- G</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina, ramificada</td><td>Sigma</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Kit de titulación de lentivirus</td><td>Abm</td><td>LV900</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de rocas Y-27632 diclorhidrato&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>Sox2 Anticuerpo</td><td>CST</td><td>2748</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>TRIPSINA .05% EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>U6-459F</td><td>Macrogen</td><td></td><td>GAGGGCCTATT TCCCATGATTC</td></tr><tr><td>Wizard Kit de purificación de ADN genómico&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

deleción génica mediada por crispr-cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

Clonación de sgRNAs L2HGDH en lentiCRISPRv2 puro El vector puro lentiCRISPRv2 se obtuvo comercialmente (ver Tabla de Materiales) y se digirió con BsmB1, lo que resultó en la liberación de un fragmento de relleno de 1,8 Kb. Como se muestra en la Figura 2A, se observó una digestión completa del vector. Para cada constructo, se examinaron seis clones para detectar la presencia o ausencia de inserto utilizando una secuencia inversa de sgRNA como cebador y un cebador directo (U6-459F) desde dentro de la secuencia vectorial. Con este enfoque, solo los clones que tenían el inserto produjeron un producto de PCR de 288 pb, y los clones negativos que no contenían la secuencia inversa de sgRNA resultaron en ningún producto de PCR, como se muestra en la Figura 2B.
Infecciones por H9, selecciones estables y Western blot Las hESCs se infectaron con partículas lentivirales que expresan dos sgRNAs diferentes dirigidos al exón 1 del gen L2HGDH y se seleccionaron con puromicina. El análisis de Western blot se realizó a partir de poblaciones heterogéneas de células de sgRNA y Cas9 que coexpresan de forma estable para establecer cuál de los dos sgRNA utilizados era más eficiente para inducir la deleción génica. Como se muestra en la Figura 3A, L2HGDH-sgRNA-1 fue más eficiente que la otra secuencia para reducir la expresión de L2HGDH en poblaciones celulares heterogéneas.
Selección clonal, expansión y análisis de proteínas La selección unicelular y la expansión clonal se realizaron para las células que expresan L2HGDH-sgRNA-1. Los pocillos que produjeron clones individuales se marcaron y crecieron hasta que se alcanzó un tamaño suficiente para que las colonias (generalmente 2 semanas) se expandieran más, criopreservaran y analizaran (Figura 3B). Se analizaron un total de 22 clones mediante el análisis de Western blot, que arrojó cinco knockouts homocigotos (23%) para L2HGDH. Este resultado muestra una alta eficiencia de la eliminación de genes mediante la entrega de genes mediada por lentivirales para la coexpresión estable de sgRNA y Cas9 a partir de un solo casete. La Figura 4 muestra un análisis de Western blot de los cinco clones knockout homocigotos junto con las células de control, mostrando una expresión reducida del 100% en comparación con el control en los clones seleccionados.
Análisis a nivel de ADN Con el fin de mapear el sitio de mutación de CRISPR aguas arriba de la secuencia de reconocimiento de PAM de Cas9, se realizó una reacción en cadena de la polimerasa basada en cebadores específicos basados en sitios de mutación (MS-BSP PCR) utilizando ADN genómico de células de control y de cinco clones diferentes. Como se muestra en la Figura 5, dos clones (A5 y B4) tienen mutaciones inmediatamente cercanas a la secuencia de reconocimiento de PAM, mientras que los otros tres clones (A1, A9 y B12) mostraron que la mutación podría no estar muy cerca del sitio PAM y está más arriba de la secuencia de sgRNA de 20 pb dentro del exón 1 del gen L2HGDH .
Con el fin de encontrar las mutaciones exactas en el ADN, los productos de PCR purificados de células de control (solo vector infectado H9), así como tres clones diferentes de CRISPR, A5, A1 y B4, se sometieron a secuenciación de Sanger, y los sitios de mutación se mapearon utilizando la herramienta de alineaciones múltiples clustalw aguas arriba del sitio PAM8. Los resultados revelaron una mutación de deleción en el clon A5 aguas arriba del sitio PAM. Los otros dos clones, A1 y B4, mostraron una mutación de inserción aguas arriba del sitio PAM, como se destaca en la Figura 6.
Análisis funcional de clones Tras la generación de líneas celulares knockout CRISPR en hESCs, el siguiente paso es confirmar su pluripotencia y potencial de diferenciación. Para ello, probamos diferentes marcadores de pluripotencia para tres clones diferentes, A1, A5 y B4, y comparamos los resultados con células de control (infectadas solo por vectores H9). Los resultados no mostraron cambios en el potencial de pluripotencia de las líneas celulares knockout determinado por inmunotinción para los marcadores OCT4, NANOG y SOX2. A continuación, las líneas celulares de control y knockout también se tiñeron para el marcador de proliferación celular, KI67, que tampoco mostró cambios en las líneas celulares knockout en comparación con el control. Estos resultados muestran que el knockout de CRISPR no afectó a las propiedades de autorrenovación de estas células. Además, la EB y la formación de colonias tampoco se vieron afectadas (Figura 7). Utilizando métodos in vitro establecidos en nuestro laboratorio, todos los clones se diferenciaron con éxito en tres células de la capa germinal, como se confirmó mediante inmunotinción para PAX6 (marcador de neuroectodermo), Brachyury (marcador de mesodermo) y FOXA2 (marcador de endodermo). No se observaron cambios en el potencial de diferenciación de las líneas celulares knockout en comparación con las células de control, lo que demostró que las células knockout conservaron su potencial de diferenciación (Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig01.jpg"> 
Figura 1: Diagrama esquemático que muestra el diseño del estudio en 5 pasos. Paso 1: Diseño y clonación de sgRNAs en el vector CRISPR V2 digerido por Bsmb1. Paso 2: Generación de partículas lentivirales utilizando vectores de entrada que transportan sgRNA junto con plásmidos de empaquetamiento mediante co-transfección HEK293T células mediante polifecciones y concentración viral mediante ultracentrifugación. Paso 3: Infección de hESCs usando partículas lentivirales a MOI de 10-20 y selección celular estable usando puromicina seguida de análisis de poblaciones celulares heterogéneas para ver la eficiencia de los sgRNAs. Paso 4: Clonación de células individuales mediante el método de dilución limitada de las células que mostraron el máximo derribo en poblaciones heterogéneas y selección de clones individuales. Paso 5: Expansión de clones individuales y análisis a nivel de ADN, proteínas y análisis funcional de clones para determinar su tallo y potencial de diferenciación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig02.jpg"> 
Figura 2: Clonación de sgRNAs en el vector lentiCRISPR V2.puro. (A) Digestión del vector lentiCRISPR V2.puro con la enzima de restricción, BsmB1. La flecha indica un fragmento de relleno de 1,8 Kb liberado tras la digestión del vector. (B) Análisis de PCR de colonias para diferentes clones de las construcciones 1 y 2 de sgRNA de L2HGDH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig03.jpg"> 
Figura 3: Western blots y propagación clonal mediante selección de una sola célula. (A) Análisis de Western blot a partir de dos réplicas biológicas diferentes (S1 y S2) de poblaciones heterogéneas de sgRNA co-expresivo estable (L2H-1 y L2H-2) y Cas9 junto con hESCs de control (C) H9. (B) Selección de una sola célula y expansión clonal de células H9 que expresan de manera estable L2HGDH-sgRNA-1. Las flechas indican pocillos de placas de 96 pocillos que muestran solo clones individuales. Barra de escala = 100 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig04.jpg"> 
Figura 4: Análisis de Western blot de diferentes clones de H9. (A-C) El análisis de Western blot de lisados totales de células de 22 clones arrojó cinco knockouts homocigotos (23%) para L2HGDH. (D) Confirmación de knockouts de L2HGDH a partir de un experimento de réplica biológica diferente utilizando Western blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig05.jpg"> 
Figura 5: Análisis de PCR MSBSP de diferentes clones de H9. (A) Análisis de secuencia del exón 1 de L2HGDH utilizado para el análisis de PCR MSBSP. (B) Optimización de la temperatura de recocido para el análisis de PCR MSBSP utilizando control y H9 V2 L2HGDH KO Clon B4. En 96.8, el control muestra una banda, pero B4 no muestra una banda, como se muestra con flechas. (C) El análisis de todos los clones homocigotos de KO dio como resultado el siguiente mapeo del sitio de mutación dentro del exón 1. A1 = En/Supr no cerca del sitio PAM; A5 = En/Del Cerca del sitio PAM; A9 = En/Del Bastante cerca del sitio PAM; B4 = In/Supr: Muy cerca del sitio PAM B12 = In/Supr, no cerca del sitio PAM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig06.jpg"> 
Figura 6: Alineación de los productos de PCR secuenciados de Sanger con la secuencia del exón 1 de referencia L2HGDH . Se realizaron múltiples alineaciones de productos de PCR secuenciados por Sanger de A1, A5 y B4, y celdas de control, junto con una secuencia de referencia dentro del primer exón de L2HGDH de la base de datos del NCBI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig07.jpg"> 
Figura 7: Caracterización funcional de líneas celulares knockout de CRISPR. (A) Las células fueron inmunoteñidas para marcadores de pluripotencia (OCT4, NANOG, SOX2), autorrenovación (KI67), EBs y formación de colonias con respecto a las hESCs H9 infectadas de control. Barras de escala: 100 μM. (B) Se calculó el porcentaje de células que expresan positivamente (+ve) en relación con la tinción con DAPI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67296/67296fig08.jpg"> 
Figura 8: Potencial de diferenciación de líneas celulares knockout CRISPR. Caracterización funcional de líneas celulares knockout CRISPR en términos de su potencial de diferenciación utilizando marcadores para PAX6 (neuroectodermo), Brachyury (mesodermo) y FOXA2 (endodermo) con respecto a las células H9 infectadas control. Barras de escala: 100 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67296/67296fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paso de protocolo</td>
			<td>Tiempo requerido</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clonación de sgRNAs en LentiCRISPRv2</td>
			<td>4 días</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Producción de lentivirus y determinación de títulos</td>
			<td>5 días</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infecciones por hESCs, selección de células estables y expansión</td>
			<td>2 semanas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selección y expansión clonal de una sola célula</td>
			<td>2 semanas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Análisis funcional de clones</td>
			<td>2 semanas</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Cronograma de los pasos del protocolo y tiempo estimado requerido.

Deleción génica mediada por CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical ...

crispr-cas9-mediated-gene-deletion-human-pluripotent-stem-cells

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Describimos un protocolo para derivar células madre pluripotentes inducidas humanas basadas en lentivirales, reprogramadas y caracterizadas, y convertirlas en condiciones putativas de grado clínico.

Derivación y caracterización de un transgen libre Humano madre pluripotentes inducidas Línea Celular y Conversión en condiciones definidas de calidad clínica

La validación experimental de la actividad potenciadora se aborda mejor mediante el análisis de pérdida de función. Aquí se presenta un protocolo eficiente que utiliza la deleción mediada por CRISPR/Cas9 para estudiar la regulación específica de alelos de la transcripción génica en células ES F1 que contienen un genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

La generación de CRISPR / Cas9 mediada monoallelic deleciones para estudiar la función del reforzador en las células madre embrionarias de ratón

La edición del genoma de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) se puede realizar de forma rápida y eficiente. Aquí se presenta un procedimiento experimental robusto para la ingeniería genética de hPSCs, como se ejemplifica mediante la edición del locus de puerto seguro AAVS1 para expresar EGFP e introducir resistencia a los antibióticos.

Establecimiento de editados-Genoma Humano pluripotentes Líneas de Células Madre: De Focalización de Aislamiento

Protocolos para generar HPSC líneas mutantes que utilizan la plataforma iCRISPR y se diferencien en células hPSCs ß-como sensibles a glucosa se describen. La combinación de la tecnología de edición del genoma con la diferenciación dirigida HPSC proporciona una potente plataforma para el análisis sistemático de la función de los factores determinantes del linaje en el desarrollo humano y la progresión de la enfermedad.

Genoma Edición y diferenciación dirigida de hPSCs para interrogar Determinantes linaje en el Desarrollo Humano de páncreas

Este protocolo se describe en detalle la generación de células libres de huella pluripotentes inducidas (iPSCs) de las células pancreáticas humanas en condiciones libres de alimentador, seguido de edición utilizando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 y caracterización de la modificación sola célula clones.

Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9

Un protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediado interrupción de genes en ratón y células hematopoyéticas primarias humanas se describe en este artículo. Cas9 sgRNA ribonucleoproteínas se introducen a través de electroporación con sgRNAs generado a través de transcripción en vitro y Cas9 comercial. Alta eficiencia edición se logra con tiempo limitado y costos financieros.

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Se describe aquí es un protocolo para etiquetar endógeno expresado proteínas con las etiquetas fluorescentes en las células de vástago humanas pluripotentes inducidas mediante CRISPR/Cas9. Células supuestamente editadas se enriquecen con clasificación de celda de fluorescencia activada y se generan líneas de células clonales.

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

Este protocolo proporciona un método para facilitar la generación de cambios de nucleótidos heterocigotos u homocigotos definidos utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas.

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

El siguiente protocolo proporciona instrucciones para la adaptación humana células madre pluripotentes inducidas (iPS) celdas para alimentación libre de la cultura a través del alimentador de Libre completa golpe de gracia suero sustitución medio (KSR-FF). Una vez adaptado, instrucciones para el mantenimiento continuo también se proporcionan.

Alimentador de Libre adaptación, Cultura y pases de células iPS humanas con alimentador de Libre Completa golpe de gracia suero sustitución Media

Aprende a realizar deleción génica con CRISPR-Cas9 en células madre embrionarias humanas H9 cultivadas sin alimentadores. Este método establece un sistema de entrega lentiviral eficaz para investigación en biología del desarrollo y medicina regenerativa.

Deleción génica mediada por CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores (Video) | JoVE Journal

Deleción génica mediada por CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores

Explorar más videos