In vivo Imágenes de fluorescencia confocal de la actividad neuronal inducida por estimulación sensorial en larvas de pez cebra parcialmente restringidas

[Instructor] Para comenzar, prepare agros de bajo punto de fusión al 3% en medio embrionario, caliente los agros a una temperatura segura para manipular peces cebra sin causar daños. Antes de que el agros se enfríe y solidifique, coloque las larvas que están de dos a siete días después de la fertilización con el lado dorsal hacia arriba en una placa de Petri con fondo de vidrio. Una vez que el agro se haya solidificado con las larvas en su lugar, agregue cinco mililitros de medio embrionario al plato. Con un bisturí, corte los agros según sea necesario alrededor de las larvas. Transfiera la placa de Petri con el pez cebra a la platina del microscopio confocal. Después de aclimatarse durante 20 minutos, use imágenes de campo claro para centrar a los peces debajo del objetivo de inmersión en agua 40 veces a temperatura ambiente. Establezca los parámetros de adquisición del microscopio confocal en función de las cualidades y los niveles de expresión de la molécula fluorescente, así como de la profundidad y las propiedades ópticas del tejido. Ajuste la potencia del láser y la configuración de ganancia maestra para capturar la luz fluorescente correctamente en el rango óptimo y evitar la pérdida innecesaria de fluorescencia dependiente del éxito del campamento G. Luego, centre el campo de visión en un grupo neuronal ubicado en la porción rostral de la médula espinal. Realice un escaneo de series temporales con un campo de visión de 79,86 micrómetros cuadrados a una velocidad de fotogramas de 1,20 fotogramas por segundo con una resolución espacial de 0,119 micrómetros cuadrados por píxel. Ajuste el campo de visión, el tamaño y la velocidad de adquisición en función de los objetivos del experimento. Dos minutos después del inicio de las imágenes, agregue 41,67 microlitros de solución madre de isotiocianato de aloe o medio embrionario al plato, y continúe grabando durante aproximadamente 30 segundos para observar los cambios en la actividad de G Camp 6 en la región de interés a través de imágenes de lapso de tiempo. Si la salida grabada no está en el formato de archivo TIF de puntos, exporte los archivos de imagen como archivos TIF de puntos desde el paquete de software del microscopio para el análisis posterior de Fiji. Después de descargar el software Fiji para el análisis de trazas neuronales, abra Fiji, importe los archivos CZI de puntos al programa. Use las herramientas de círculo o mano alzada en Fiji para resaltar un área o neurona de interés haciendo clic en los íconos respectivos. Después de seleccionar la región de interés o el ROI, haga clic en analizar, herramientas y administrador de ROI en la barra de herramientas de Fiji. Haga clic en agregar T para agregar el ROI seleccionado a la ventana del administrador de ROI. En el administrador de ROI, haga clic en más y multimedida para analizar el ROI. Deje la configuración predeterminada y haga clic en Aceptar para generar datos sin procesar. A continuación, guarde la salida como un archivo CSV para su posterior manipulación mediante Python u hojas de cálculo. Ahora normalice los datos sin procesar para representarlos como un rastro neuronal promediando los últimos 30 segundos del preestímulo de dos minutos y genere una intensidad de fluorescencia normalizada utilizando la fórmula dada y trace los datos normalizados como trazas neuronales. La administración de isotiocianato de aloe causó un aumento en la fluorescencia de G CAMP 6S dentro de una región cerebral localizada de larvas de pez cebra, lo que indica una mayor actividad neuronal. A una velocidad de captura lenta de 0,10 fotogramas por segundo, las neuronas en el cerebro posterior y la médula espinal eran claramente visibles con alta resolución. El aumento de la velocidad de captura a 0,79 fotogramas por segundo resultó en una ligera pérdida de resolución espacial, pero mejoró la resolución temporal. A 3,16 fotogramas por segundo, las neuronas parecían menos distintas mientras capturaban más dinámicas temporales.