Name: Ensamblaje y cuantificación de cocultivos que combinan levaduras heterótrofas con cianobacterias fototróficas secretoras de azúcar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Aprenda a ensamblar y cuantificar cocultivos de cianobacterias fototróficas secretoras de azúcar con levaduras heterótrofas. Este protocolo optimiza la producción de sacarosa y permite monitorear interacciones microbianas mediante técnicas de marcaje fluorescente y citometría de flujo.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo para el cocultivo de cianobacterias secretoras de sacarosa con socios fúngicos

<table><tbody><tr><td>Objetivo 10x Ph1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>46 04 01-9904</td><td></td></tr><tr><td>525/40 nm Filtro de paso de banda</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0051</td><td>Filtro FITC (en láser de 488 nm)</td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de 660/10 nm</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0055</td><td>Canal APC (en láser de 638 nm)</td></tr><tr><td>Filtro de paso de banda de 710/50 nm</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B71092</td><td>PC5.5 canal (en láser de 561 nm)</td></tr><tr><td>Accuvettes para Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A35473</td><td>Vasos de muestra con tapa Tubo de</td></tr><tr><td>apertura 30 &mu; M para Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C92760</td><td>Autoclave capilar</td></tr><tr><td></td><td>Lab Associates</td><td>EQM-ARBP</td><td>para la esterilización de material</td></tr><tr><td>Matraces con deflectores ROTILABO&reg;, Cuello recto, 250 ml</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>LY95.1</td><td></td></tr><tr><td>BG11 / CoYBG11 componentes</td><td>diferentes proveedores</td><td></td><td>ver Tabla 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro estéril con tapa de botella</td><td>Sigmaaldrich Z222593</td><td></td><td>a medios estériles si no desea utilizar autoclave</td></tr><tr><td>Capillary 45 &micro; m</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651738</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células CASY Modelo TTC</td><td>Sistemas</td><td></td><td></td>Schaerfe</tr><tr><td>Vasos CASY</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651794</td><td></td></tr><tr><td>CASYclean</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651786</td><td>Solución de limpieza</td></tr><tr><td>CASYon Omni</td><td>Life Science</td><td>OLS 5651808</td><td>Solución isotónica&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga (50 mL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>BOC</td><td>270182-L</td><td>para el suministro de cultivos y cocultivos axénicos de cianobacterias</td></tr><tr><td>CONTRAD&reg; 70</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>81911</td><td>Solución de limpieza profunda</td></tr><tr><td>Cubreobjetos 20 &times; 26 x 0,4 mm</td><td>VWR International GmbH</td><td>631-1190</td><td>Cubridores para cámara de recuento</td></tr><tr><td>Cubetas</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Cianobacterias BG-11 Solución de agua dulce</td><td>Merck KGaA</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>CytExpert Software v. 2.6</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>software de aplicación de citómetro</td></tr><tr><td>CytoFLEX Sheath Fluid</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B51503</td><td>Citómetro de fluido de karité</td></tr><tr><td>CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td>BE51180</tr><tr><td>Limpiador DxH para Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>628022</td><td>Solución de limpieza</td></tr><tr><td>Centrífuga de tubo Eppendorf (pequeña)</td><td>Labstac</td><td>CEN16-15</td><td>para centrifugar menos de 2 ml de cultivo</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K928.1</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>2523749</td><td>tubos para modo semiautomático</td></tr><tr><td>Agente de limpieza FlowClean, 500 ml</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C48093</td><td>Solución de limpieza diaria</td></tr><tr><td>Cilindros graduados</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z131121</td><td>para la preparación de medios</td></tr><tr><td>HEPPSO</td><td>Merck KGaA</td><td>R426725</td><td></td></tr><tr><td>Infors MultiTron fotoincubadora</td><td>Infors AG</td><td></td><td>luz LED blanca</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Merck KGaA</td><td>I6758</td><td>Prepare alícuotas, almacene a -20&deg; C, descongelar y mantener en hielo&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoton II para Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>8448011</td><td>Solución isotónica&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaluza v. 2.2</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B16406</td><td>Software de análisis de datos por citometría</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR International GmbH</td><td>115-2221</td><td>Pañuelos sin pelusa</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>KPO3</td><td>Noah Chemicals</td><td>7790-53-6</td><td></td></tr><tr><td>Vasos de medición</td><td>VWR</td><td>213-3747</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de ensayo, 96 pocillos, tapa deslizante, base plana, PS, transparente</td><td>SARSTEDT AG & Co. KG</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Base de microscopio</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 09 18-9902/16</td><td></td></tr><tr><td>Cabezal de microscopio</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 30 14</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de purificación de agua Milli-Q</td><td>Merck Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Mulitisizer 4e contador de partículas</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B23005</td><td>Alternativa al contador de celdas CASY</td></tr><tr><td>Neubauer mejorado, profundidad 0,02 mm</td><td>Assistent Alemania</td><td></td><td>Cámara de recuento</td></tr><tr><td>Neubauer mejorada, profundidad 0,1 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>640010</td><td>Cámara de recuento</td></tr><tr><td>Lista para usar Control de calidad diario Fluorosferas</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C65719</td><td>Referencia para botellas QC</td></tr><tr><td>SCHOTT</td><td>Dutscher</td><td>90347</td><td>para almacenamiento</td></tr><tr><td>Specord&reg; 200 Plus Espectrofotómetro</td><td>Analytic Jena GmbH</td><td></td><td>OD600/750</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Merck KGaA</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa (grande)</td><td>Labstac</td><td>CEN18-06R</td><td>colector de biomasa</td></tr><tr><td>de cultivo Levadura Base de nitrógeno, sin aminoácidos, sin sulfato de amonio</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>11743014</tr></tbody></table>

ensamblaje y cuantificación de cocultivos que combinan levaduras heterótrofas con cianobacterias fototróficas secretoras de azúcar

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

Establecimiento de cocultivos de S. elongatus fototrófico y levaduras heterótrofas Anteriormente hemos reportado resultados detallados del co-cultivo de Synechococcus elongatus PCC 7942 con una variedad de subcepas de S. cerevisiae. Para una descripción completa de los resultados del cocultivo con este par de cianobacterias/levaduras, véaseel punto 8. En aras de la brevedad y la precisión, estos resultados no se reproducen aquí. Brevemente, los resultados anteriores indican una serie de consideraciones que son importantes para el establecimiento de cocultivos de levaduras cianobacterianas a largo plazo. La capacidad de la levadura para sobrevivir en condiciones en las que las cianobacterias proporcionan las únicas formas de carbono fijo depende en gran medida de la eficiencia con la que la cepa de levadura puede utilizar la sacarosa. Las cepas de S. cerevisiae que evolucionaron o se diseñaron para metabolizar la sacarosa de manera más eficiente27,28 tuvieron más probabilidades de sobrevivir a la transición al modo de crecimiento de cocultivo, lograron densidades celulares más altas y exhibieron una mayor robustez en experimentos de cocultivo de cianobacterias a largo plazo (días a semanas)8. La fase inicial de la inoculación de un cocultivo fue especialmente importante para la viabilidad de la levadura, probablemente debido a las tensiones de la dilución del cultivo, el cambio de la composición del medio y/o la retirada de una fuente de carbono más concentrada. Por lo tanto, los esfuerzos para facilitar la transición de un medio de crecimiento más rico a una disponibilidad mínima de carbono al inicio del cocultivo pueden mejorar el rendimiento experimental y la consistencia (véase el paso 1.2.1.1). Además, S. cerevisiae exhibió respuestas al estrés consistentes con hiperoxia cuando se inoculó en cultivos densos de S. elongatus, consistente con la formación deO2 como subproducto primario de la fotosíntesis oxigénica. Por lo tanto, los esfuerzos para prevenir el crecimiento excesivo de la pareja cianobacteriana y/o los ciclos de luz alternos "día/noche" podrían extender sustancialmente la viabilidad de S. cerevisiae en cocultivos a largo plazo. Véase la sección de Discusión para un resumen adicional de los fenómenos comunes en los cocultivos en relación con las muestras de control axénicas.
Seguimiento del crecimiento de los cocultivos utilizando diferentes metodologías En la siguiente sección, se describe la cuantificación ejemplar de un consorcio tripartito mezclado artificialmente de Synechocystis y las dos levaduras S. cerevisiae y U. maydis utilizando tres métodos diferentes. Para la mezcla, se determinaron DO750 (para cianobacterias) y OD600 (para heterótrofos) de cultivos individuales y se ajustaron a DE 0,1. Los cultivos individuales se mezclaron en una proporción de 1:1:1 utilizando densidad óptica (que es distinta de los recuentos de células, ver arriba). Para facilitar la discriminación de las levaduras en el citómetro, se utilizaron cepas indicadoras de S. cerevisiae modificada genéticamente FY1679-O1B29 que producen constitutivamente mKate2 citoplasmática (genotipo: URA3Δ/pTDH3::mKate2; cepa: S. cerevisiae mKate230) y U. maydis cepa AB3331 que produce constitutivamente eGFP (genotipo: pep4Δ/pRpl40::egfp; cepa: U. maydis eGFP32) se utilizaron. Cabe destacar que la cepa de cianobacterias estaba equipada con un plásmido replicativo que promueve la expresión constitutiva y fuerte de la proteína fluorescente amarilla versión mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, cepa Synechocystis mVenus, similar a la33) y además, exhibe la típica autofluorescencia fuerte debido a la presencia de la maquinaria fotosintética.
Cuantificación microscópica mediante cámaras de recuento: Todos los tipos de células de la mezcla artificial utilizada de tres microorganismos pueden distinguirse fácilmente microscópicamente (Figura 2A): Synechocystis y S. cerevisiae están representadas por células esféricas que, sin embargo, difieren mucho en su diámetro (Synechocystis: diámetro aproximado de 1,5-3 μm, S. cerevisiae: diámetro aproximado de 3-6 μm), mientras que las células de U. maydis tienen una morfología alargada en forma de cigarro y una longitud de al menos 10 μm (Figura 2A). Estos claros rasgos morfológicos permiten la cuantificación exacta de cada socio en la mezcla. Como ejemplo ilustrativo, se cuentan 37, 18, 36 y 21 células de S. cerevisiae en los cuatro cuadrados grandes, respectivamente (Figura 2B). El valor medio es de 28 celdas. Dado que un cuadrado grande del hemocitómetro usado tiene un área de 1mm2 y la profundidad de la cámara era de 0,02 mm, esto da como resultado 28 células por 0,02 μL. Esto corresponde a 1.400 células/μL, lo que equivale a 1,4 x 106 células/mL. Se contaron los otros tipos de células y se determinaron las concentraciones en consecuencia (Figura 2C, Tabla 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig02.jpg"> 
Figura 2: Cuantificación microscópica de un consorcio tripartito formado por Synechocystis y las levaduras S. cerevisiae y U. maydis. (A) Imagen microscópica de contraste diferencial (CID) de una mezcla artificialmente combinada de los microorganismos indicados. Todas las especies se pueden distinguir fácilmente por su morfología. Barra de escala: 10 μm. (B) Resultados de recuento ejemplares para una mezcla ensamblada artificialmente de las cepas indicadas basada en cultivos axénicos con un OD de 0,1. Se analizaron los cuatro cuadrados grandes en los bordes de la cuadrícula (marca roja en la Figura 1D). (C) El valor medio de las diferentes celdas contadas en los cuatro cuadrados se utilizó para calcular la concentración de celdas en la suspensión utilizando la siguiente ecuación: Valor medio/(profundidad de la cámara [0,02 mm] x tamaño del cuadrado contado [1 mm2] x 1.000). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Cuantificación mediante contadores de partículas: Los contadores de partículas determinan el número de partículas en una suspensión en función de su tamaño. En el conjunto de datos de ejemplo, se utilizó un contador de partículas con un capilar de 45 μm. Dado que las células de S. cerevisiae y U. maydis muestran dimensiones similares, no se pueden distinguir en el contador de partículas, mientras que las células más pequeñas de Synechocystis se pueden separar claramente. Por lo tanto, el análisis de cultivos individuales muestra picos en posiciones idénticas que se refieren a 3 a 6 μm para las dos levaduras (Figura 3A). Durante la medición, se aplica una presión negativa, lo que hace que las células entren en el capilar. Esto cambia brevemente la resistencia eléctrica para que el dispositivo pueda determinar el tamaño de partícula en función de la alteración. En el cultivo mixto, se pueden detectar dos picos distintos, uno asociado con las células cianobacterianas más pequeñas y el otro que representa una fracción conjunta de las dos especies de levadura (Figura 3B). Es importante destacar que, además de los picos que reflejan las células vivas, se detectaron picos adicionales a aproximadamente 1 μm (Figura 3), que corresponden a restos celulares y partículas más pequeñas. Las señales que aparecerían a diámetros mayores de lo esperado pueden ser causadas por agregaciones de células. Cabe destacar que la forma de los picos refleja la homogeneidad de las células: un pico agudo muestra células muy homogéneas, lo que es poco probable para un cocultivo. En un co-cultivo, se espera ver un pico muy amplio o incluso dos picos si los socios del co-cultivo son claramente diferentes en tamaño. Para los cultivos axénicos de hongos heterótrofos, el pico podría ser un pico medio ancho.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2.jpg"> 
Figura 3: Cuantificación de un consorcio tripartito formado por Synechocystis mVenus y las levaduras S. cerevisiae mKate2 y U. maydis eGFP utilizando un contador de partículas. (A) Salida visual de los análisis de los cultivos axénicos de las tres cepas como se indica en los gráficos (contador de células con capilar de 45 μm). (B) Archivo de salida visual ejemplar para el análisis del consorcio tripartito artificial en condiciones idénticas. El contador de partículas no admite la discriminación de las dos especies de levadura que están representadas por el segundo pico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Cuantificación mediante citometría unicelular: Con el citómetro de flujo de una sola célula, las diferentes poblaciones de células se pueden distinguir fácilmente en función de sus propiedades de (auto)fluorescencia y dispersión de la luz. Las células fototróficas (Synechocystis) se pueden diferenciar de las células heterótrofas (U. maydis y S. cerevisiae) en función de la autofluorescencia roja de los pigmentos fotosintéticos que se mide en el canal APC-H (Figura 4A). Sobre la base de esa separación inicial de células fototróficas y heterótrofas, las dos poblaciones heterótrofas se pueden distinguir en función de sus marcadores fluorescentes eGFP en el canal FITC-H y mKate2 en el canal PC5.5 (Figura 4B, C). En un diagrama de puntos que muestra las propiedades de dispersión de las tres poblaciones (FSC-H y FSC-Width), las poblaciones también se pueden distinguir con solo algunas superposiciones menores de las poblaciones (Figura 4D).
Con este método, se analizaron 10 μL de las muestras diluidas con un caudal de 10 μL/min, lo que permitió una cuantificación de aproximadamente 70.000 células en 1 min. Aproximadamente el 60% de esas células pudieron asignarse a Synechocystis (4,23 x 106 células/mL), mientras que el 40% restante se distribuyó equitativamente entre U. maydis (1,35 x 106 células/mL) y S. cerevisiae (1,36 x 106 células/mL, Figura 4E, Tabla 2).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig04.jpg"> 
Figura 4: Cuantificación de un consorcio tripartito formado por la cianobacteria Synechocystis mVenus y las levaduras U. maydis eGFP y S. cerevisiae mKate2 mediante citometría de flujo unicelular. Ejemplos de gráficos obtenidos después de la medición de un cultivo mixto de Synechocystis mVenus (verde oscuro), U. maydis eGFP (verde claro) y S. cerevisiae mKate2 (rojo) en una proporción de 1/3 OD750 / 1/3 OD600 / 1/3 OD600 en un citómetro (A) que muestra un histograma del recuento de eventos y fluorescencia en el canal APC-H (ej.: 638 nm, EM.: 660/10 nm) de todas las células utilizadas para diferenciar células fototróficas y heterótrofas en función de su autofluorescencia. (B) Un histograma del recuento de eventos y fluorescencia en el canal FITC-H (ej.: 488 nm, em.: 525/40 nm) de todas las células heterótrofas utilizadas para diferenciar las células eGFP de U. maydis y las células mKate2 de S. cerevisiae en función de sus propiedades de fluorescencia verde. (C) Un histograma del recuento de eventos y la fluorescencia en el canal PC5.5-H (por ejemplo: 561 nm, em.: 710/50 nm) de todas las células heterótrofas utilizadas para diferenciar las células eGFP de U. maydis y las células mKate2 de S. cerevisiae en función de sus propiedades de fluorescencia roja. (D) Un diagrama de puntos de las señales de dispersión en el ancho FSC sobre el canal FSC-H utilizado para identificar las poblaciones celulares sin propiedades de fluorescencia. (E) Las estadísticas de población, incluidos los recuentos de eventos, porcentajes y medias aritméticas y desviaciones estándar (DE) de los canales de fluorescencia relevantes. La cantidad total de células, junto con su tamaño y fluorescencia, se determinó en un volumen de 10 μL con un caudal de 10 μL/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para visualizar comparativamente el resultado de los diferentes métodos de cuantificación, los números de celda determinados se presentan en las dos tablas siguientes (Tabla 2 y Tabla 3). Las concentraciones finales de células determinadas utilizando los tres métodos descritos anteriormente se encuentran en un rango similar para todos los métodos. El citómetro proporciona el tamaño de muestra más alto, seguido por el contador de partículas y la cuantificación microscópica, con una disminución de aproximadamente un orden de magnitud entre los métodos.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Co-cultura 1:1:1</td>
			<td>Fotómetro</td>
			<td colspan="2">Citómetro</td>
			<td colspan="2">Contador de partículas</td>
			<td colspan="2">Cámara de recuento de microscopía</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Organismo</td>
			<td>DE750/600</td>
			<td>Recuento de células</td>
			<td>células/mL</td>
			<td>Recuento de células</td>
			<td>células/mL</td>
			<td>Recuento de células</td>
			<td>células/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,618</td>
			<td>1.36 x 106</td>
			<td rowspan="2">1,546*</td>
			<td rowspan="2">2,58 x 106*</td>
			<td>112</td>
			<td>1,40 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,541</td>
			<td>1.35 x 106</td>
			<td>89</td>
			<td>1.11 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>42,330</td>
			<td>4.23 x 106</td>
			<td>3,094</td>
			<td>5.16 x 106</td>
			<td>271</td>
			<td>3.39 x 106</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: Comparación de los diferentes métodos de cuantificación: Cultivo mixto artificial. Nótese que U. maydis y S. cerevisiae no pueden distinguirse utilizando un contador de partículas (*).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Cultura única</td>
			<td>Fotómetro</td>
			<td colspan="2">Citómetro</td>
			<td colspan="2">Contador de partículas</td>
			<td colspan="2">Cámara de recuento de microscopía</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Organismo</td>
			<td>DE750/600</td>
			<td>Recuento de células</td>
			<td>células/mL</td>
			<td>Recuento de células</td>
			<td>células/mL</td>
			<td>Recuento de células</td>
			<td>células/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.1</td>
			<td>38,936</td>
			<td>3.89 x 106</td>
			<td>1,928</td>
			<td>3.21 x 106</td>
			<td>403</td>
			<td>4.03 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.1</td>
			<td>36,927</td>
			<td>3.69 x 106</td>
			<td>2,465</td>
			<td>4.11 x 106</td>
			<td>307</td>
			<td>3.07 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus</td>
			<td>0.1</td>
			<td>127,864</td>
			<td>1,28 x 107</td>
			<td>8,186</td>
			<td>1.36 x 107</td>
			<td>428</td>
			<td>1.07 x 107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 3: Comparación de los diferentes métodos de cuantificación: Calibración con cultivos simples/axénicos.

Ensamblaje y cuantificación de cocultivos que combinan levaduras heterótrofas con cianobacterias fototróficas secretoras de azúcar

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

Nuestra investigación tiene como objetivo comprender las redes microbianas en consorcios sintéticos que involucran cianobacterias secretoras de sacarosa y hongos heterótrofos. En el pasado, los microbiólogos solían estudiar cultivos puros de microorganismos individuales. En la naturaleza, sin embargo, los microbios generalmente ocurren en consorcios y, por lo tanto, es esencial comprender también las redes microbianas en culturas mixtas.Uno de los principales desafíos es encontrar condiciones de crecimiento adecuadas, incluido un medio que permita el crecimiento de todos los miembros del consorcio. Aquí nos centramos principalmente en optimizar la mayor producción y secreción de sacarosa por parte del miembro fototrófico, que proporciona la base para el crecimiento de los miembros heterótrofos. Para el seguimiento del crecimiento en cultivos axénicos, se pueden utilizar técnicas comunes como la densidad óptica o las mediciones de retrodispersión.Sin embargo, estas técnicas no se aplican a los cocultivos en los que necesitamos el recuento de células de las especies individuales. En nuestro protocolo, aplicamos una combinación de marcaje fluorescente y recuento de células para distinguir entre diferentes socios de cocultivo. Además, podríamos demostrar que se pueden lograr resultados similares mediante diferentes métodos que van desde los simples y de bajo costo hasta los costosos y de alto rendimiento.Para comenzar, granule las células cianobacterianas después de cultivar el cultivo durante tres días. Vuelva a suspender el pellet en 25 mililitros de medio CoYBG-11 estéril. Centrifugar la muestra a 4.000 g durante 20 minutos a temperatura ambiente.A continuación, deseche el sobrenadante por decantación. Una vez determinada la densidad óptica, se añade la cantidad calculada de CoYBG-11 en un matraz deflector de 250 mililitros en condiciones estériles. A continuación, se añaden los volúmenes calculados de las suspensiones de células cianobacterianas y heterótrofas para conseguir un volumen final de cultivo de 50 mililitros.Utilice 50 microlitros de la culata IPTG de un molar para un cultivo de 50 mililitros. A continuación, coloque el matraz en la fotoincubadora a aproximadamente 200 micromoles de fotones por metro cuadrado por segundo. Complemente el ambiente con 2% de dióxido de carbono a 30 grados Celsius, agitación orbital a 150 RPM y 75% de humedad.Para la toma de muestras, saque el matraz de la incubadora y tome una muestra de un mililitro del cultivo en condiciones estériles. Para prepararse para la cuantificación microscópica, asegúrese de que la cámara de recuento y el cubreobjetos estén libres de polvo y células. Coloque el cubreobjetos correctamente deslizándolo sobre las dos barras de soporte con un poco de presión y evitando roturas.Una vez que el cubreobjetos esté colocado correctamente, observe los anillos de Newton entre las dos superficies de vidrio mientras se asegura de que el cubreobjetos no se deslice. Ahora mezcle bien la suspensión celular y aplique unos microlitros en el borde de la cámara. Deje que la cámara se llene completamente mediante la fuerza capilar.A continuación, utilice un objetivo adecuado de un microscopio óptico y concéntrese en las líneas de la rejilla de la cámara de recuento. Cuente las celdas en los cuadrados apropiados para el tamaño de celda dado. Para la cuantificación mediante el recuento de partículas, ajuste la densidad óptica de la muestra a 0,1.A continuación, añada 10 microlitros de la muestra a 10 mililitros de tampón de medición isotónico. Asegure la tapa del recipiente de muestra y mezcle la muestra suavemente inclinando ligeramente el recipiente. Después de colocar el recipiente de muestra en el contador de partículas, inserte un capilar con el tamaño de poro adecuado para las células utilizadas en el recipiente de muestra y cierre la puerta de la máquina.Inicie la medición y registre en un rango apropiado. Las células con diferentes tamaños de celda se pueden discriminar en esta etapa. Para la cuantificación por citometría de flujo de una sola célula, ajuste la densidad óptica de las muestras para disponerlas adecuadas para la medición de citometría.Aplique la fórmula dada para asegurarse de que el recuento de células permanezca dentro de un rango de 1.000 a 10.000 células por segundo a un caudal de 10 microlitros por minuto. Transfiera 300 microlitros de cada suspensión de celda de muestra a un pocillo individual en una placa de 96 pocillos. A continuación, transfiera la placa de 96 pocillos a la muestra automática del citómetro.Diagramas de puntos abiertos e histogramas para los canales de fluorescencia y dispersión relevantes para las muestras. Para determinar la concentración de células, registre un volumen de muestra definido utilizando la función de registro. Separe las señales para organismos fototróficos y heterótrofos en función de la autofluorescencia roja del organismo fototrófico utilizando el histograma del canal APC-H.A continuación, utilice el histograma del canal FITC-H que muestra solo la población heterótrofa para identificar las células heterótrofas que contienen proteína fluorescente verde. Utilice el histograma del canal PC5.5-H para distinguir entre las células heterótrofas que contienen proteína roja fluorescente y las que no la tienen.

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Presentamos un protocolo para la identificación y cuantificación de las principales clases de metabolitos solubles en agua en la levadura Saccharomyces cerevisiae. El método descrito es versátil, robusto y sensible. Permite la separación de isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de metabolitos solubles en agua entre sí.

Metabolómica cuantitativa de Saccharomyces cerevisiae mediante cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas en tándem

El control optogenético del metabolismo microbiano ofrece un control dinámico flexible sobre los procesos de fermentación. El protocolo aquí muestra cómo configurar fermentaciones reguladas por luz azul para la producción química y de proteínas a diferentes escalas volumétricas.

Fermentaciones controladas por la luz para la producción química microbiana y de proteínas

El protocolo actual detalla el aislamiento de los ficobilisomas de las cianobacterias por centrifugación a través de un gradiente de densidad de sacarosa discontinuo. Las fracciones de ficobilisomas intactos se confirman mediante el espectro de emisión fluorescente de 77K y el análisis SDS-PAGE. Las fracciones de ficobilisoma resultantes son adecuadas para la tinción negativa de TEM y el análisis de espectrometría de masas.

Aislamiento y caracterización del ficobilisoma intacto en cianobacterias

En este estudio, el objetivo principal fue monitorear la absorción celular y la eventual exocitosis de los nanotubos de carbono (CNTs). Desde esta perspectiva, propusimos aquí un método único que utiliza la citometría de flujo de imágenes multiespectrales que permite la cuantificación y localización de CNTs en un número estadísticamente relevante de células.

Localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo

Un método para obtener nanofibras y nanoestructuras complejas de proteínas de la matriz extracelular individuales o múltiples se describe. Este método utiliza las interacciones proteína-superficie para la creación de materiales a base de proteínas exentas con la composición sintonizable y la arquitectura para el uso en una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos y de biotecnología.

Las nanofibras ECM proteínas y Uso Asamblea Superficie iniciadas Nanoestructuras Engineered

Bicapas lipídicas soportadas y partículas de membrana naturales son sistemas convenientes que pueden aproximarse a las propiedades de las membranas celulares y ser incorporadas en una gran variedad de estrategias de análisis. Aquí se demuestra un método para preparar compuestos de microarrays de soportados de lípidos de la bicapa recubiertos de SiO 2 perlas, vesículas de fosfolípidos o partículas de membrana naturales.

Formación de biomembrana Microarrays con un método basado en la Asamblea Rasero

Este manuscrito presenta un método de moldeo por inyección para diseñar microvasos que recapitular las propiedades fisiológicas de endotelio. El proceso basado en microfluidos crea redes vasculares 3D patente con condiciones tailorable, tales como gradientes bioquímicos de flujo, composición celular, la geometría, y. Se describe el proceso de fabricación y los ejemplos de posibles aplicaciones.

Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D

Aprenda a ensamblar y cuantificar cocultivos de cianobacterias fototróficas secretoras de azúcar con levaduras heterótrofas. Este protocolo optimiza la producción de sacarosa y permite monitorear interacciones microbianas mediante técnicas de marcaje fluorescente y citometría de flujo.

Ensamblaje y cuantificación de cocultivos que combinan levaduras heterótrofas con cianobacterias fototróficas secretoras de azúcar (Video) | JoVE Journal

Ensamblaje y cuantificación de cocultivos que combinan levaduras heterótrofas con cianobacterias fototróficas secretoras de azúcar

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