Ensamblaje y cuantificación de cocultivos que combinan levaduras heterótrofas con cianobacterias fototróficas secretoras de azúcar

Nuestra investigación tiene como objetivo comprender las redes microbianas en consorcios sintéticos que involucran cianobacterias secretoras de sacarosa y hongos heterótrofos. En el pasado, los microbiólogos solían estudiar cultivos puros de microorganismos individuales. En la naturaleza, sin embargo, los microbios generalmente ocurren en consorcios y, por lo tanto, es esencial comprender también las redes microbianas en culturas mixtas.

Uno de los principales desafíos es encontrar condiciones de crecimiento adecuadas, incluido un medio que permita el crecimiento de todos los miembros del consorcio. Aquí nos centramos principalmente en optimizar la mayor producción y secreción de sacarosa por parte del miembro fototrófico, que proporciona la base para el crecimiento de los miembros heterótrofos. Para el seguimiento del crecimiento en cultivos axénicos, se pueden utilizar técnicas comunes como la densidad óptica o las mediciones de retrodispersión.

Sin embargo, estas técnicas no se aplican a los cocultivos en los que necesitamos el recuento de células de las especies individuales. En nuestro protocolo, aplicamos una combinación de marcaje fluorescente y recuento de células para distinguir entre diferentes socios de cocultivo. Además, podríamos demostrar que se pueden lograr resultados similares mediante diferentes métodos que van desde los simples y de bajo costo hasta los costosos y de alto rendimiento.

Para comenzar, granule las células cianobacterianas después de cultivar el cultivo durante tres días. Vuelva a suspender el pellet en 25 mililitros de medio CoYBG-11 estéril. Centrifugar la muestra a 4.000 g durante 20 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, deseche el sobrenadante por decantación. Una vez determinada la densidad óptica, se añade la cantidad calculada de CoYBG-11 en un matraz deflector de 250 mililitros en condiciones estériles. A continuación, se añaden los volúmenes calculados de las suspensiones de células cianobacterianas y heterótrofas para conseguir un volumen final de cultivo de 50 mililitros.

Utilice 50 microlitros de la culata IPTG de un molar para un cultivo de 50 mililitros. A continuación, coloque el matraz en la fotoincubadora a aproximadamente 200 micromoles de fotones por metro cuadrado por segundo. Complemente el ambiente con 2% de dióxido de carbono a 30 grados Celsius, agitación orbital a 150 RPM y 75% de humedad.

Para la toma de muestras, saque el matraz de la incubadora y tome una muestra de un mililitro del cultivo en condiciones estériles. Para prepararse para la cuantificación microscópica, asegúrese de que la cámara de recuento y el cubreobjetos estén libres de polvo y células. Coloque el cubreobjetos correctamente deslizándolo sobre las dos barras de soporte con un poco de presión y evitando roturas.

Una vez que el cubreobjetos esté colocado correctamente, observe los anillos de Newton entre las dos superficies de vidrio mientras se asegura de que el cubreobjetos no se deslice. Ahora mezcle bien la suspensión celular y aplique unos microlitros en el borde de la cámara. Deje que la cámara se llene completamente mediante la fuerza capilar.

A continuación, utilice un objetivo adecuado de un microscopio óptico y concéntrese en las líneas de la rejilla de la cámara de recuento. Cuente las celdas en los cuadrados apropiados para el tamaño de celda dado. Para la cuantificación mediante el recuento de partículas, ajuste la densidad óptica de la muestra a 0,1.

A continuación, añada 10 microlitros de la muestra a 10 mililitros de tampón de medición isotónico. Asegure la tapa del recipiente de muestra y mezcle la muestra suavemente inclinando ligeramente el recipiente. Después de colocar el recipiente de muestra en el contador de partículas, inserte un capilar con el tamaño de poro adecuado para las células utilizadas en el recipiente de muestra y cierre la puerta de la máquina.

Inicie la medición y registre en un rango apropiado. Las células con diferentes tamaños de celda se pueden discriminar en esta etapa. Para la cuantificación por citometría de flujo de una sola célula, ajuste la densidad óptica de las muestras para disponerlas adecuadas para la medición de citometría.

Aplique la fórmula dada para asegurarse de que el recuento de células permanezca dentro de un rango de 1.000 a 10.000 células por segundo a un caudal de 10 microlitros por minuto. Transfiera 300 microlitros de cada suspensión de celda de muestra a un pocillo individual en una placa de 96 pocillos. A continuación, transfiera la placa de 96 pocillos a la muestra automática del citómetro.

Diagramas de puntos abiertos e histogramas para los canales de fluorescencia y dispersión relevantes para las muestras. Para determinar la concentración de células, registre un volumen de muestra definido utilizando la función de registro. Separe las señales para organismos fototróficos y heterótrofos en función de la autofluorescencia roja del organismo fototrófico utilizando el histograma del canal APC-H.

A continuación, utilice el histograma del canal FITC-H que muestra solo la población heterótrofa para identificar las células heterótrofas que contienen proteína fluorescente verde. Utilice el histograma del canal PC5.5-H para distinguir entre las células heterótrofas que contienen proteína roja fluorescente y las que no la tienen.