Name: Diseños microfluídicos de laminación de tereftalato de polietileno de bajo costo para imágenes multiplexadas de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Aprende a fabricar dispositivos microfluídicos de bajo costo mediante laminación de PET para imagen simultánea de múltiples embriones de pez cebra. Este método permite estudiar señales químicas y mecánicas en inflamación y cicatrización de heridas.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Vidrio de cubierta redondo de 25 mm de diámetro #1 espesor</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1760-025 Material de</td><td>montaje de la base. El grosor se eligió en función de las especificaciones de la lente del microscopio.</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator v28.5</td><td>Editor</td> vectorial <td>Adobe N/A</td><td>para diseñar el patrón del dispositivo.</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td>Para hacer medio E3.</td></tr><tr><td>Archivos PNG de diseño (espejo en línea)</td><td>N/A</td><td>N/A</td> https://i.ibb.co/QPYj7BL/multipositionalv7-1.png<<td>br/> https://i.ibb.co/FDpQYXc/multipositionalv7-2.png https://i.ibb.co/5TG4SB6/multipositionalv7-3.png</td></tr><tr><td>Design Space for Desktop v8.39</td><td>Cricut</td><td>N/A</td><td>Software patentado para manejar el cortador de manualidades.</td></tr><tr><td>Fusion Plus 7000L</td><td>GBC</td><td>1703098</td><td>Laminadora térmica. Este modelo específico se seleccionó por sus características de calidad de vida, como el tamaño máximo de la pila de hojas.</td></tr><tr><td>Cuchilla de repuesto Cricut 10396595</td><td></td><td></td> de <td>carburo alemán para cortador de manualidades.</td></tr><tr><td>Juego de herramientas básicas grises</td><td>Cricut</td><td>10307854</td><td>Juego de herramientas para deshierbar cortes, limpiar tapetes y montar láminas de PET. Opcional.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Acros 223211000 orgánico</td><td></td><td>Para hacer medio E3.</td></tr><tr><td>Cortador</td> de manualidades <td>Cricut 10669040</td><td>Maker</td> 3<td>. La Cricut Maker 3 fue seleccionada sobre la Silhouette Cameo 4 por su facilidad de uso del software, pero cualquier cortadora de manualidades capaz de leer imágenes en blanco y negro funcionará.</td></tr><tr><td>MemGlow 560</td><td>Cytoskeleton</td><td>MG02-10</td><td>Colorante rojo de células vivas para membranas celulares. No es necesario lavar. Utilizado en la Figura 3.</td></tr><tr><td>Hoja de bisturí de carbono No. 22</td><td>Diseño quirúrgico</td><td> 22-079-697 Hoja de</td><td>bisturí para ajustes de corte manuales. Cualquier cuchillo artesanal similar (por ejemplo, el cuchillo X-acto #2) también funcionará.</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher</td><td>BP366</td><td>Para hacer medio E3.</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>Para hacer medio E3.</td></tr><tr><td>Tapete de corte adhesivo StandardGrip</td><td>Cricut</td><td>10138842</td><td>Tapete de montaje para cortador de manualidades. La alfombrilla de corte LightGrip también funcionará, pero evite las alfombrillas de corte StrongGrip y FabricGrip, ya que la fuerza del adhesivo puede deformar el corte final durante el deshierbe y la eliminación. El adhesivo en las alfombrillas eventualmente se desgastará con el uso continuo; Reemplace las alfombrillas según sea necesario.</td></tr><tr><td>Cinta de papelería 12 mm</td><td>Deli</td><td>30014</td><td>Cinta de oficina. La marca Deli fue elegida a través de pruebas para facilitar la extracción después de la laminación.</td></tr><tr><td>Superpegamento, pegamento líquido</td><td>Loctite</td><td>1364076</td><td>Cianoacrilato. <fuerte>El pegamento utilizado debe ser líquido.</fuerte> Las formulaciones de gel no sellarán ni impermeabilizarán suficientemente los bordes del dispositivo.</td></tr><tr><td>Bolsas de laminación térmica de PET, láminas de</td> PET <td>Scotch</td><td>TP3854</td> de 3 mil <td>con adhesivo térmico. Las sábanas llegan como pares intercalados y deben separarse antes de su uso. Cortar con el lado adhesivo hacia abajo.</td></tr><tr><td>Bolsas de laminación térmica de PET,</td> láminas de PET <td>Scotch</td><td>TP5854</td> de 5 mil <td>con adhesivo térmico. Las sábanas llegan como pares intercalados y deben separarse antes de su uso. Cortar con el lado adhesivo hacia abajo.</td></tr><tr><td>Tricaína (MS-222)</td><td>Syndel</td><td>IC10310680</td><td>Anestésico para peces.</td></tr></tbody></table>

diseños microfluídicos de laminación de tereftalato de polietileno de bajo costo para imágenes multiplexadas de pez cebra

Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics Designs for Multiplexed Zebrafish Imaging

Para comparar la calidad de imagen producida por un confocal de escaneo láser con y sin la ayuda del RADISH, los embriones que expresan el biosensor de calcio intensivo GCaMP6f22,24 en la capa epitelial externa se tiñeron con MemGlow 560 y se obtuvieron imágenes con un confocal de escaneo láser invertido que cubre todo el espesor del pliegue de la aleta caudal en un intervalo de tiempo de 1 minuto por fotograma (Video 2). Sin el dispositivo (Figura 3A), las muestras se desviaron significativamente y mostraron artefactos de bandas, como resultado de limitar la pila Z a 25 cortes para que se ajusten a la resolución temporal especificada en comparación con las imágenes con el dispositivo (Figura 3B). El rábano se utilizó además para examinar los transitorios de calcio inmediatamente después de la herida en embriones que expresaban Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt1821, destacando la E-cadherina endógena en rojo y el calcio citoplasmático en el epitelio apical en verde. Los embriones fueron heridos paralelos a los lados de la cámara central utilizando una hoja de bisturí (Figura 4A y Video 3) o mediante ablación directa con láser IR (Figura 4B), luego se obtuvieron imágenes a través de todo el espesor del pliegue de la aleta caudal. 
Para demostrar la eficacia del rábano para la obtención de imágenes a largo plazo, investigamos el reclutamiento de células inmunitarias en el borde de la herida durante 24 horas después de la herida. Cuatro embriones de pez cebra a 3 dpf que expresan Tol2 (mpx:Dendra2) para marcar neutrófilos enverde 23 fueron heridos por transección de cola y se les tomaron imágenes durante 24 horas consecutivas (Figura 5). Los artefactos de imagen típicamente asociados con los embriones tardíos de 3 a 4 dpf, como la inclinación y la flotación, estaban notablemente ausentes (Video 4), y el recrecimiento del tejido continuó sin obstáculos para el experimento. El reclutamiento de neutrófilos hacia el borde de la herida continúa a lo largo de la imagen (Figura 5B), y la mayoría de las células migratorias se van a las 24 h después de la herida (Figura 5C), lo que es consistente con la resolución de inflamación esperada25,26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig01.jpg"> 
Figura 1: Diseño y uso del dispositivo de microfluídica laminado de PET (RADISH). (A) Esquema que ilustra la disposición y el espesor de las capas individuales de PET, el ensamblaje y el montaje y uso del dispositivo. (B) Producto final, montado en un recorte de 3/4" en un plato de 35 mm. (C) embriones de 3 dpf, (D) embriones de 5 dpf, (E) embriones de 14 dpf alojados dentro del dispositivo. Barras de escala = 1.000 μm (C,D,E). Abreviaturas: PET = tereftalato de polietileno; RADISH = Asistente de rotación para la obtención de imágenes Danio de la curación posterior; DPF = días después de la fecundación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig02.jpg"> 
Figura 2: Ilustración fotográfica paso a paso del montaje del dispositivo de PET. (A) Capas individuales de PET antes de la laminación. (B) Capa de PET asegurada a un cubreobjetos de 25 mm con cinta de oficina. (C) Dispositivo en progreso asegurado a un soporte de plástico para laminación. (D) Dispositivo de laminado de PET completo. (E) Antena modificada de 35 mm antes del montaje del dispositivo. (F) Dispositivo completado. Abreviatura: PET = tereftalato de polietileno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig03.jpg"> 
Figura 3: Mejora de la calidad de las imágenes confocales de escaneo láser de embriones de 3 dpf en el diseño RADISH. (A) Imagen representativa de un embrión de 3 dpf Tg (krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) teñido con MemGlow 560 sin usar el RADISH. (B) Imagen representativa del embrión Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) teñido con MemGlow 560 montado en el RÁBANO. Barra de escala = 100 μm. Abreviaturas: RADISH = Asistente de rotación para la obtención de imágenes Danio de la curación posterior; DPF = días después de la fecundación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig04.jpg"> 
Figura 4: Compatibilidad del diseño RADISH con múltiples técnicas de herido. (A) 3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 embrión herido mediante transección manual de la aleta caudal. (B) Embrión herido mediante ablación láser. (C,D) Los mismos embriones 4 min después, mostrando la progresión de los transitorios de calcio después de la herida. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: RADISH = Asistente de rotación para la obtención de imágenes Danio de la curación posterior; DPF = días después de la fecundación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig05.jpg"> 
Figura 5: Atrapamiento a largo plazo de embriones para obtener imágenes de la migración de fagocitos. (A) embriones de Tol2(mpx:Dendra2) inmediatamente después de la herida, y los mismos embriones (B) 25 min, (C) 12 h y (D) 24 h después. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo complementario 1: Archivos vectoriales y PNG para el diseño de dispositivos RADISH como se muestra en la Figura 1A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313_Supp%20File%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Video 1: Vídeo de campo claro de la transección manual de la aleta caudal utilizando el diseño de un dispositivo RADISH. Abreviatura: RADISH = Asistente de rotación para la obtención de imágenes Danio de la curación posterior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%201.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Vídeo 2: Comparación de embriones Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) no montados frente a embriones de 3 dpf montados de la Figura 3, adquiridos a 1 fotograma/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%202.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Vídeo 3: Transitorios de calcio en embriones Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 heridos mediante transección con bisturí o ablación láser de la Figura 4, adquiridos a 1 fotograma/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%203.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 4: Imágenes a largo plazo del reclutamiento de leucocitos y la regeneración de la aleta caudal en embriones Tol2(mpx:Dendra2). Abreviaturas: RADISH = Asistente de rotación para la obtención de imágenes Danio de la curación posterior; HPW = horas después de la herida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%204.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>

Diseños microfluídicos de laminación de tereftalato de polietileno de bajo costo para imágenes multiplexadas de pez cebra

Zebrafish embryos are transparent and thus uniquely suited for noninvasive intravital imaging of fundamental processes, such as wound healing and immune ...

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Investigación

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Biología

Un dispositivo microfluídico simple ha sido desarrollado para realizar anestésico...

Simples dispositivos de microfluidos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Y pez cebra

El desarrollo de pez cebra se puede seguir durante días con la microscopía de lámina de luz cuando los embriones están inmersos en tubos de polímero ópticamente claros con agarosa de baja concentración.

Multicapa de montaje para microscopía de luz Hoja de largo plazo del pez cebra

Descrito aquí es un protocolo para la formación de imágenes semiautomático de la fluorescencia específica de tejido en embriones de pez cebra.

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Este manuscrito describe la zWEDGI (pez cebra herir y el dispositivo de captura para el crecimiento y la proyección de imagen), que es un dispositivo compartimentado diseñado para orientar y restringir las larvas de pez cebra. El diseño permite el corte transversal de la cola y a largo plazo colección de imágenes de alta resolución microscopia fluorescente de la cicatrización de heridas y regeneración.

Dispositivo de proyección de imagen de vivo a largo plazo para mejor manipulación Experimental de larvas de pez cebra

Microinyección de embriones de pez cebra y larvas es una técnica difícil pero crucial en muchos modelos de pez cebra. Aquí, presentamos una gama de herramientas de microescala para ayudar en la estabilización y la orientación del pez cebra para la microinyección y la proyección de imagen.

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Aquí presentamos un protocolo para diseñar y fabricar dispositivos microfluídicos personalizados con una inversión financiera y de tiempo mínima. El objetivo es facilitar la adopción de tecnologías microfluídicas en laboratorios de investigación biomédica y entornos educativos.

Fabricación rápida de dispositivos microfluídicos personalizados para investigación y aplicaciones educativas

Este artículo describe un método para montar embriones frágiles de pez cebra para microscopía confocal de lapso de tiempo extendido. Este método de bajo costo es fácil de realizar utilizando platos regulares de microscopía de fondo de vidrio para obtener imágenes en cualquier microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones.

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Describimos herramientas optimizadas para estudiar el corazón de pez cebra in vivo con microscopía de fluorescencia de lámina de luz. Específicamente, sugerimos líneas transgénicas cardíacas brillantes y presentamos nuevas técnicas suaves de incrustación e inmovilización que evitan defectos de desarrollo y cardíacos. También se proporciona una posible línea de adquisición y análisis de datos adaptada a las imágenes cardíacas.

Microscopía de hoja de luz de dinámica cardíaca rápida en embriones de pez cebra

Este protocolo utiliza imágenes de láminas de luz para investigar la función contráctil cardíaca en larvas de pez cebra y obtener información sobre la mecánica cardíaca a través del seguimiento celular y el análisis interactivo.

Imágenes de lámina de luz 4D de la contracción cardíaca del pez cebra

Se describe una estrategia de preparación de muestras para obtener imágenes de embriones tempranos de pez cebra dentro de un corion intacto utilizando un microscopio de lámina de luz. Analiza las diferentes orientaciones que adquieren los embriones dentro del corion en las etapas de epibolia y yema del 70% y detalla estrategias de imagen para obtener una resolución a escala celular en todo el embrión utilizando el sistema de lámina de luz.

Imágenes de microscopía de lámina de luz y estrategias de montaje para embriones tempranos de pez cebra

Aprende a fabricar dispositivos microfluídicos de bajo costo mediante laminación de PET para imagen simultánea de múltiples embriones de pez cebra. Este método permite estudiar señales químicas y mecánicas en inflamación y cicatrización de heridas.

Diseños microfluídicos de laminación de tereftalato de polietileno de bajo costo para imágenes multiplexadas de pez cebra

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