Diseños microfluídicos de laminación de tereftalato de polietileno de bajo costo para imágenes multiplexadas de pez cebra

Nuestro laboratorio está interesado en los mecanismos que regulan la migración y activación de neutrófilos en lesiones tisulares, infecciones y cáncer, con un enfoque en las características y la importancia biológica de la señalización intracelular del calcio en la cicatrización de heridas.

[Shelly] Los métodos convencionales de diseño microfluídico son costosos y complejos, lo que ralentiza el progreso en campos como la biología del desarrollo que requieren entornos diversos. Vimos un enfoque más rápido y eficiente para desarrollar y probar diseños individuales. Por lo tanto, este método de construcción proporciona una mayor flexibilidad de diseño y resolución espacial que los protocolos igualmente simples, al tiempo que permite una iteración más rápida y fácil que los dispositivos PDMS estándar. Usándolo, desarrollamos el RADISH para obtener imágenes simultáneas de múltiples embriones de pez cebra dentro de un solo campo de visión.

Con este dispositivo de atrapamiento que admite imágenes de alta resolución de la vida, estamos listos para comprender cómo las diversas señales, incluidos los estímulos químicos y mecánicos, se integran para coordinar la inflamación y la cicatrización de heridas.

[Instructor] Para comenzar, diseñe el patrón para el dispositivo utilizando el software de su elección. Dependiendo de la edad y el tamaño del embrión, ajuste el ancho del canal y el tamaño de la cámara central de imágenes para obtener el mejor ajuste. Guarde cada capa como un archivo de imagen individual con dimensiones idénticas. Ahora, inicialice la máquina de corte de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En el espacio de trabajo de diseño, seleccione los diseños recién cargados. Agrupe patrones destinados al mismo grosor de lámina de PET en el mismo corte. Confirme el número y el tipo de patrones en el corte, luego seleccione el material cortado. A continuación, coloque la lámina de PET en la alfombrilla de corte con el grosor deseado presionando firmemente para eliminar las burbujas de aire y cargue la alfombrilla en la máquina de corte. Siga las instrucciones en pantalla para indicar a la máquina de corte que comience el corte. Luego, retire los cortes terminados del tapete de corte. Ahora, alinee las capas en un vidrio de cubreobjetos, ya sea sin ayuda o con marcas de registro precortadas. Asegure las capas con cinta de oficina para evitar que se muevan durante la laminación. Dependiendo del tamaño del dispositivo y la capacidad de la laminadora, monte diseños pequeños en un respaldo más grande con más cinta para evitar atascar u obstruir la alimentación de la laminadora. Luego, encienda el laminador y lamine de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Retire la cinta de oficina antes de alinear la siguiente capa. Con pegamento de cianoacrilato, asegure el dispositivo a un plato de 35 milímetros perforado con un orificio de tres cuartos de pulgada. Luego, impermeabilice el laminado cubriendo completamente los bordes exteriores del dispositivo con pegamento de cianoacrilato. Use suficiente pegamento para cubrir completamente los bordes exteriores sin espacios. Para comenzar, criar embriones de pez cebra hasta al menos dos días después de la fertilización en E3 u otro medio de cría de embriones adecuado. Luego, anestesiar los embriones usando 164 miligramos por litro de MS-222. A continuación, llene el plato de retención que contiene el dispositivo montado con cinco mililitros de E3 u otro medio embrionario que contenga 164 miligramos por litro de MS-222. Con una pipeta de transferencia, deposite un embrión anestesiado en cada cámara de retención del dispositivo. Luego, usando un bucle de cabello, oriente los embriones con la cola de cada embrión sobresaliendo en la cámara de imágenes central y la yema inmovilizada en el canal en forma de cuña. Si lo desea, asegure la cabeza del embrión añadiendo agarosa de bajo punto de fusión al 1,5 % en la cámara de retención con una micropipeta. Finalmente, mueva el dispositivo con embriones al sistema de imágenes de su elección para comenzar la obtención de imágenes, seleccione el sistema de imágenes y el objetivo apropiados para el experimento. Ajuste el enfoque de la muestra y los parámetros de imagen para obtener una relación señal/ruido y una velocidad de adquisición óptimas. Para herir el embrión mediante transección manual, aplique presión con una hoja de bisturí a través del tejido de la aleta caudal en la punta de la notocorda bajo un microscopio estereoscópico. Luego, regrese el dispositivo al escenario. Para herir el embrión mediante estimulación láser, defina una región de interés cerca del borde del pliegue de la aleta caudal y estimule de acuerdo con la potencia láser disponible. Obtenga imágenes del embrión a temperatura ambiente utilizando el canal GFP y RFP con un intervalo de fotogramas de un minuto durante un total de una hora. Si es necesario, libere los embriones después de la obtención de imágenes succionando suavemente cerca de la cabeza con una pipeta de transferencia o girando la placa.