Aislamiento y registro de microglía del hipocampo de ratones adultos

Nuestra investigación se centra en aislar agudamente la microglía para grabaciones de células completas, incluidas las corrientes de potasio para comprender la actividad del canal iónico. El protocolo también es adaptable para aislar la microglía de varias regiones del cerebro, lo que proporciona información sobre el cero en diferentes condiciones neurológicas.

Los desarrollos más recientes en nuestro campo de investigación incluyen el uso de la digestión enzimática tradicional de la pancreatitis, combinada con la purificación de la microglía a través de la clasificación celular activa por fluorescencia. Estos avances han mejorado la precisión y la eficiencia del aislamiento de poblaciones específicas de microglía para su posterior estudio.

Nuestro protocolo investiga las propiedades electrofisiológicas de la microglía directamente del hipocampo del ratón adulto, en lugar de depender del CS cultivado primario. Este enfoque permite un análisis más preciso de las funciones de la microglía en su entorno nativo.

Nuestros resultados han allanado el camino para nuevas preguntas científicas sobre la propiedad bioquímica y funcional de la microglía tanto en condiciones fisiológicas como de enfermedad, ofreciendo a los investigadores una valiosa guía para explorar más a fondo estos aspectos.

[Presentador] Para comenzar, coloque al animal anestesiado en decúbito supino sobre una mesa de disección y sujete sus extremidades. Exponga el tórax y perfunda el corazón con PBS estéril y helado para eliminar las células sanguíneas circulantes intravasculares. Luego sostenga la cabeza y corte la piel a lo largo de la línea media del cerebro con unas tijeras para exponer el cráneo. A continuación, corte la parte posterior del cráneo bilateralmente y entre las cuencas de los ojos con unas tijeras pequeñas. Corta el cráneo a lo largo de la sutura sagital y retira el cráneo con unas pinzas. Después de eso, extraiga el tejido cerebral rápidamente. Ahora, coloque el tejido cerebral en placas de cultivo de 10 centímetros que contengan PBS helado. Diseccionar la corteza cerebral bilateralmente con pinzas. Aísle el tejido del hipocampo y córtelo en trozos más pequeños. Transfiera las piezas a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Luego, vuelva a suspender los pequeños trozos de tejido del hipocampo en dos mililitros de solución salina equilibrada de Hanks o HBSS helada. Y centrifugar a 300 G durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, agregue 1,950 microlitros de la mezcla de enzimas uno al tubo de centrífuga de 15 mililitros que contiene las piezas de tejido del hipocampo. Agite el tubo de centrífuga continuamente en un baño de agua a 37 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, agregue 30 microlitros de la mezcla de enzimas dos recién preparada al tubo de centrífuga de 15 mililitros. Pipetee los fragmentos de tejido hacia arriba y hacia abajo 20 veces con una punta de pipeta de un mililitro e incube en un baño de agua durante cinco minutos con agitación continua a 37 grados centígrados. Después de retirar el tubo de centrífuga, pipetee la suspensión hacia arriba y hacia abajo varias veces con una pipeta de un mililitro hasta que no queden trozos grandes de tejido. Luego filtre la suspensión celular a través de un filtro de detección celular de 70 micrómetros y recoja el filtrado en un tubo de centrífuga limpio de 50 mililitros. Transfiera el filtrado a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros y centrifugue a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Luego deseche el sobrenadante con una pipeta de un mililitro. Ahora, pipeteamos la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo 20 veces con 15 mililitros de HBSS para lavarla y centrifugamos a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento celular en un mililitro de tampón de clasificación celular activado magnéticamente. Para comenzar, transfiera un mililitro de la suspensión unicelular preparada a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros y centrifugue a 300 G durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Una vez que se retira el sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento unicelular en 90 microlitros de clasificación de células activadas magnéticamente o tampón máximo. Añadir 10 microlitros de microperlas CD11b o c e incubar la suspensión a cuatro grados centígrados durante 15 minutos en un agitador horizontal. Luego agregue un mililitro de tampón máximo directamente al tubo para lavar la suspensión unicelular. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el sedimento celular en 500 microlitros de tampón máximo. Con una pipeta de un mililitro, transfiera la suspensión celular resuspendida a la columna de clasificación en el campo magnético. Mientras permanece en el campo magnético, lave la columna tres veces con 500 microlitros de tampón máximo. A continuación, retire la columna de clasificación del campo magnético. Agregue un mililitro de amortiguador máximo a la columna y empújelo lentamente con el pistón. Recoge el flujo a través. Ahora, siembre las células seleccionadas en una placa de 24 pocillos que contenga un cubreobjetos recubierto con poli-L-lisina. Agregue 200 microlitros de medio de cultivo e incube durante 20 minutos en una incubadora de 37 grados Celsius con 95% de oxígeno, 5% de dióxido de carbono y 60 a 80% de humedad. Para comenzar, tome la microglía cultivada aislada del tejido cerebral de ratones. Localice la microglía esférica bajo un microscopio de agua utilizando el objetivo de 40x. A continuación, llene el electrodo con solución intracelular y conéctelo a la etapa del cabezal amplificador de la configuración electrofisiológica. Aplique presión positiva. Cambie al objetivo 4x y localice el electrodo. Luego baje el electrodo en la solución de baño. Configure el amplificador en modo de pinza de voltaje para realizar la prueba de membrana en modo baño. Después de eso, vuelva al objetivo 40x y acerque la punta del electrodo a la microglía. A continuación, aplique una pequeña presión negativa para sujetar la célula. Cuando la resistencia alcance los 100 megaohmios, cambie del modo de baño al modo de parche en la prueba de membrana. Cuando la resistencia alcance los 300 megaohmios, libere la presión negativa. Cuando la resistencia indica la formación de un sello de giga-ohmios entre el electrodo y la membrana microglial. Cambie del modo parche al modo celular en la prueba de membrana. Luego aplique una pequeña cantidad de succión e inicie una descarga eléctrica para romper la membrana. Después de eso, cambie al modo de pinza de voltaje, abra el programa de grabación y registre las corrientes de potasio durante 200 milisegundos.