Identificación y cuantificación de metabolitos alterados en pacientes críticos mediante metabolómica basada en RMN

Nuestra investigación utiliza metabolómica basada en RMN para identificar metabolitos desregulados y vías bioquímicas que se alteran en pacientes críticos de la UCI, y también hemos incluido pacientes con SDRA, que es una afección pulmonar grave. Mediante el perfil y la comparación de las firmas metabólicas, nuestro objetivo es descubrir las alteraciones bioquímicas que están relacionadas con la progresión de la enfermedad y personalizar los tratamientos para mejorar los resultados. En realidad, estamos tratando de abordar la brecha en la comprensión de la desregulación metabólica en todas las categorías de pacientes con SDRA, que incluyen pacientes con SDRA leve, moderada y grave.

Mejorar nuestros conocimientos, para una mejor comprensión de la enfermedad, su progresión, con el objetivo general de mejorar el resultado del paciente proporcionando una medicina de precisión y personalizada. La RMN ofrece una fácil preparación de muestras, preservando la integridad del suero para el reanálisis y detectando metabolitos conocidos y desconocidos sin derivatización química. Proporciona datos cuantitativos reproducibles, lo que garantiza una medición fiable de los metabolitos.

A diferencia de los enfoques dirigidos, la RMN permite una exploración sensible e imparcial de los cambios metabólicos, lo que la hace ideal para descubrir firmas y vías en la progresión de la enfermedad. Nuestro hallazgo mejorará la investigación del SDRA al descubrir cambios metabólicos en diferentes etapas, que no se han estudiado lo suficiente. Mediante el uso de metabolómica basada en RMN, nuestro objetivo es identificar metabolitos y vías desregulados, lo que conduce a posibles firmas para el diagnóstico temprano, el pronóstico, la predicción más oportuna y los tratamientos.

Este enfoque avanza en el manejo personalizado y profundiza el conocimiento en el perfil metabólico multiestado. Nuestros resultados allanaron el camino para nuevas preguntas científicas, tales como: ¿Cómo influyen los metabolitos específicos identificados en diferentes etapas del SDRA en la progresión de la enfermedad? ¿Pueden estas vías desreguladas ser objeto de intervenciones terapéuticas tempranas?

Además, ¿cómo varían estos cambios metabólicos en otras afecciones respiratorias o inflamatorias? Para empezar, con una aguja estéril, recoja dos mililitros de sangre de las arterias de un paciente diagnosticado con síndrome de dificultad respiratoria aguda leve o moderada o SDRA. Transfiera la sangre a un frasco estéril y deje que coagule durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Centrifugar la sangre coagulada a 3,100 g durante 15 minutos para separar el suero. Transfiera el suero a tubos de microcentrífuga estériles, haciendo alícuotas de 400 a 500 microlitros. Etiquete los tubos con los datos del paciente y guárdelos a 80 grados centígrados.

Para los experimentos de RMN, mezcle 250 microlitros de la alícuota sérica con 250 microlitros de tampón de fosfato salino para minimizar la variación del pH. Agite la mezcla durante aproximadamente 15 segundos para asegurar una mezcla homogénea. Transfiera la muestra preparada a un tubo de RMN limpio con un inserto coaxial que contenga TSP a una concentración de 0,05 milimolares.

A continuación, coloque el tubo de RMN en el imán. Escriba WRPA y seleccione el número de experimento adecuado para configurar un experimento de protones con el programa de pulsos CPMG. Haga clic en la opción Título para ingresar el nombre del paciente y otros detalles necesarios.

Escriba lock y pulse Intro para bloquear el campo magnético. A continuación, seleccione las opciones 90% de agua y 10% de óxido de deuterio. A continuación, escriba ATMM y pulse Intro para realizar el ajuste y la coincidencia de la sonda.

A continuación, en la opción Parámetros de adquisición, seleccione los parámetros como 64.000 puntos en 128 escaneos para recopilar datos de optimización. Establezca el retardo de relajación de cinco segundos, un ancho de barrido espectral de 12 PPM y un tiempo de eco de 200 microsegundos, repetido 300 veces. Aplique un ensanchamiento de línea de 0,3 hercios mediante una función de ventana exponencial.

A continuación, utilizando las herramientas de procesamiento y análisis de RMN, adquiera los espectros de RMN. Una vez obtenidos los espectros finales, escriba APK y ABSN para realizar la corrección de fase y la corrección de línea de base respectivamente. A continuación, haga clic en la opción Calibrar eje en el panel superior y calibre el pico TSP a 0 PPM, ya sea de forma automática o manual.

Finalmente, transfiera los datos adquiridos del sistema de RMN a la estación de trabajo para su posterior análisis. Después de adquirir los espectros de RMN de pacientes diagnosticados con SDRA leve o moderado, abra el software de cuantificación de metabolitos de RMN para el procesamiento de datos. Para realizar la corrección manual de la línea de base utilizando el método de Whitaker, abra el archivo espectral en el módulo del procesador del software de cuantificación de metabolitos de RMN.

Seleccione la corrección de línea base y, a continuación, elija el método Whitaker. Coloque puntos en la base de los picos en todo el espectro. Una vez completado, guarde los archivos espectrales corregidos de línea base en una sola carpeta.

A continuación, para realizar la agrupación espectral mediante el módulo Generador de perfiles, seleccione Herramientas, luego Proceso por lotes y, a continuación, Agrupación espectral. Para generar la hoja de agrupación final para el análisis estadístico, seleccione la carpeta con todos los archivos espectrales corregidos de línea base. Divida los espectros en bins de igual tamaño con un ancho espectral definido que oscile entre 0,01 y 0,04 partes por millón.

Especifique el tamaño del bucket y los valores de PPM inicial y final. Elija una carpeta para guardar las hojas de discretización de salida. Excluya las regiones de desplazamiento químico correspondientes al agua y al disolvente TSP para evitar interferencias espectrales.

La hoja de cálculo final mostrará los nombres de las muestras en una fila y los valores de bin con los PPM correspondientes en las demás filas. Antes de realizar el análisis estadístico, normalice los datos mediante alguna normalización, transformación de registros y escalado de Pareto. Para el análisis multivariante, realice el análisis de componentes principales, el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales y el análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales para observar la discriminación entre los grupos, lo que arroja la importancia variable de las puntuaciones de proyección para cada metabolito responsable de la diferencia en el perfil metabólico.

Realizar la prueba t de Student para identificar metabolitos significativos con un valor p inferior a 0,05. Las pruebas T producen diagramas de bigotes de caja que muestran diferencias en las concentraciones de metabolitos. Luego, realice un análisis de biomarcadores para generar un área debajo del gráfico de curva de características operativas del receptor.

Seleccione la lista final de metabolitos significativos en función de una variable de importancia de la puntuación de proyección mayor que uno, un valor p corregido por Bonferroni menor que 0.05 y un área bajo la curva mayor que 0.8. Utilizando la Base de Datos de Metaboloma Humano, identifique los metabolitos correspondientes a valores específicos de PPM. Antes de comenzar la cuantificación, utilizando el módulo procesador, calibrar el compuesto de referencia seleccionado para el estudio.

Haga clic en la opción Calibrar indicador de cambio químico e ingrese la concentración del compuesto de referencia. Arrastre el pico del software al pico de referencia espectral y ajuste su altura y anchura. Una vez que los picos de referencia espectral se alineen con el pico del software, haga clic en Aceptar.

A continuación, abra los espectros deseados en el módulo Profiler y seleccione la biblioteca de compuestos adecuada para el estudio. En la parte inferior de la pantalla, se mostrará una lista de metabolitos. Seleccione el metabolito de interés de la lista.

Haga clic en el valor PPM en la esquina superior de la pantalla. Acérquese a los espectros a la escala PPM específica del metabolito. En este punto, aparecen dos picos en la pantalla, uno que representa los datos registrados y el otro, que se muestra como una línea de puntos, que representa el pico del software.

Arrastre el pico del software para alinearlo con el pico registrado, ajustando la altura y la posición para que coincidan. Una vez que los picos estén correctamente alineados, lea la concentración del metabolito a partir del valor que se muestra en el encabezado Concentración en milimolares. Para generar el archivo de salida, en el menú Herramientas, haga clic en la opción Operaciones por lotes y especifique la carpeta deseada para guardar el archivo de salida.

El análisis de componentes principales mostró un agrupamiento distinto entre los grupos de pacientes con SDRA leve y moderado. El análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales reveló una clara separación entre los grupos de SDRA leve y moderado, enfatizando las diferencias metabólicas. La prueba t de Student y el análisis de biomarcadores revelaron metabolitos desregulados clave entre el SDRA leve y moderado.

El lactato y la isoleucina se identificaron como metabolitos significativamente desregulados que se correlacionan con la gravedad del SDRA.