Name: Identificación y cuantificación de metabolitos alterados en pacientes críticos mediante metabolómica basada en RMN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprende a identificar metabolitos alterados mediante metabolómica basada en RMN en pacientes críticos con síndrome de distrés respiratorio agudo. Este método permite descubrir firmas metabólicas para diagnóstico temprano y tratamientos personalizados.

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La aprobación ética (código IEC: 2022-71-PhD-126) se obtuvo del IEC del Instituto de Postgrado de Ciencias Médicas Sanjay Gandhi (SGPGIMS), Lucknow. Se obtuvieron los consentimientos escritos e informados de los pacientes o sus familiares para realizar el estudio y publicar los datos con fines de investigación. Además, la investigación se llevó a cabo siguiendo los lineamientos institucionales.
1. Diseño del estudio y autorización ética
<ol>
	<li>Determine el tamaño de la muestra para cada grupo. Revisar cuidadosamente y establecer los criterios de selección de los participantes. Además, si el diseño del estudio requiere la inclusión de muestras humanas o animales, obtenga la autorización ética del comité de ética institucional (IEC) correspondiente antes de comenzar la recolección de muestras.</li>
	<li>Seleccionar pacientes con SDRA categorizados como leves, moderados y graves, según los criterios diagnósticos de la definición de Berlín 2012 basada en la presión parcial de oxígeno en la sangre arterial (PaO2) a la relación entre la fracción de oxígeno inspirado (FiO2) (P/F). Los pacientes con SDRA con un rango de P/F de 300-200 se consideran leves, los de 200-100 como moderados y por debajo de 100 como graves38. En este caso, nos hemos centrado en dos grupos: pacientes con SDRA leve y moderado (ver Tabla 1). NOTA: El estudio implica el uso de suero obtenido de muestras de sangre para realizar metabolómica basada en RMN. En este estudio, los participantes incluidos como referencia tenían una edad media de 42 años (± 10,9 años), con una distribución por sexo de 2 hombres y 6 mujeres.</li>
</ol>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Categoría</td>
			<td>Relación P/F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leve</td>
			<td>300-200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moderado</td>
			<td>200-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muy fuerte</td>
			<td>100-0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Categorización de los pacientes con SDRA.
2. Selección, recolección y procesamiento de muestras
<ol>
	<li>Realice el aislamiento del suero siguiendo los pasos que se describen a continuación.<ol>
		<li>Para experimentar, recoja 2 ml de muestras de sangre de las arterias utilizando una aguja estéril en un vial simple (sin aditivos) y estéril. Deje que la muestra se coagule durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para este estudio, se seleccionaron 4 pacientes diagnosticados con SDRA leve y 4 pacientes con SDRA moderado.</li>
		<li>Centrifugar la muestra a 3100 x g durante 15 min para separar el suero25. Transfiera el suero a tubos de microcentrífuga estériles, haciendo alícuotas de menor volumen (es decir, 400-500 μL), etiquételos adecuadamente (nombre del paciente, número de RC, punto de día, etc.) y guárdelos a -80 °C para análisis futuros. NOTA: En este punto, el experimento se puede pausar y reanudar en un momento conveniente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procese la muestra de suero antes de los experimentos de RMN siguiendo los siguientes pasos.<ol>
		<li>Descongele la muestra antes de realizar los experimentos de RMN. Mezclar 250 μL de alícuota del suero con 250 μL de solución tampón de fosfato salino (que contiene 100%D2O, 0,9% NaCl, 50 mM tampón fosfato sódico, pH 7,4) para minimizar la variación del pH.</li>
		<li>Agite la mezcla durante unos segundos (~15 s) para asegurarse de que se mezcle homogéneamente. Finalmente, transfiera la muestra preparada a un tubo de RMN limpio con un inserto coaxial que contenga propionato de trimetilsilil (TSP) a una concentración de 0,05 mM, que sirve como patrón externo para la calibración y cuantificación41. NOTA: Como referencia, se utiliza un compuesto inerte y no reactivo que no interactúa con los analitos. Otros compuestos de referencia comúnmente utilizados incluyen tetrametilsilano (TMS) y trimetilsililpropanosulfonato de sodio (DSS).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Experimentación con RMN
NOTA: La atención se centra en la identificación de moléculas pequeñas en las muestras de suero, por lo tanto, utilizamos la secuencia de pulso Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG), que suprime las señales de las macromoléculas. Todas las muestras de suero de este estudio se registraron utilizando un espectrómetro de RMN de 800 MHz equipado con un cabezal de sonda inversa de banda ancha TCI de 5 mm de triple resonancia refrigerado criogénicamente y un gradiente z blindado.
<ol>
	<li>Coloque la muestra en el imán. Escriba el comando wrpa (mencione el número de experimento) y presione enter para configurar un experimento de protones con el programa de pulso cpmg. Mencione el nombre del paciente y otros detalles necesarios haciendo clic en la opción Título.</li>
	<li>Bloquee el campo magnético escribiendo el comando Bloquear , presione enter y seleccione la opción 90% H2O y 10% D2O más. Ajuste y adapte la sonda manualmente por ATMM para optimizar la eficiencia de los pulsos de radiofrecuencia y maximizar la sensibilidad. Realice calzas degradadas 1D haciendo clic en topshim.</li>
	<li>Establezca los siguientes parámetros de adquisición, incluido un retardo de relajación de 5 s, un ancho de barrido espectral de 12 partes por millón (ppm) y un tiempo de eco de 300 μs. Todos estos parámetros se pueden modificar fácilmente seleccionando la opción Parámetros de adquisición en el panel superior.</li>
	<li>Aplique un ensanchamiento de línea de 0,3 Hz mediante una función de ventana exponencial, recopilando datos en 64.000 puntos a lo largo de 128 escaneos. Estos parámetros se pueden modificar de manera similar seleccionando la opción Parámetros de adquisición en el panel superior. Al hacer clic en Parámetros de adquisición, aparecerá una lista de especificaciones y los atributos mencionados, junto con otros parámetros, se pueden modificar durante la optimización.</li>
	<li>Adquiera los espectros de RMN utilizando herramientas de procesamiento y análisis de RMN. Una vez obtenidos los espectros finales, escriba el comando apk y absn y presione enter para realizar la corrección de fase y la corrección de línea base, respectivamente. Haga clic en la opción Calibrar eje presente en el panel superior y luego calibre el pico TSP a 0 ppm de forma automática o manual.</li>
	<li>Transfiera los datos adquiridos del sistema a la estación de trabajo, donde se realizan los procesamientos y análisis posteriores. NOTA: La fase experimental ya se ha completado y se puede pausar. El preprocesamiento, el análisis y la interpretación de datos se pueden realizar cómodamente.</li>
</ol>
4. Preprocesamiento de datos
<ol>
	<li>Llevar a cabo el preprocesamiento de datos utilizando herramientas de procesamiento y análisis de RMN y software de cuantificación de metabolitos de RMN.<ol>
		<li>A veces, solo la corrección automática no es suficiente, y en ese caso, también es necesaria la corrección manual. Para realizar la corrección de fase manualmente, haga clic en la opción Procesar en la barra de menú superior de las herramientas de procesamiento y análisis de RMN. A continuación, haga clic en Ajustar fase, arrastre el ratón y observe hasta que los espectros se corrijan de fase. Una vez hecho esto, haga clic en la opción Guardar y volver (presente en forma de icono) disponible en la misma barra de menú.</li>
		<li>Para realizar la corrección manual de la línea de base (método de Whittaker), abra el archivo espectral en el módulo del procesador del software de cuantificación de metabolitos de RMN. Seleccione la opción Corrección de línea base. A continuación, seleccione la opción Método Whittaker. Ahora coloque los puntos en la base de los picos en todo el espectro (de 0,0 a 10 ppm, generalmente en el caso del suero o según la disponibilidad del metabolito en los espectros) para ajustar la base. Una vez que se haya corregido la línea de base de todos los archivos espectrales, guárdelos en una sola carpeta. El procesamiento posterior, ya sea utilizando el procesador o el módulo de perfil del software de cuantificación de metabolitos de RMN, se puede realizar utilizando el mismo archivo guardado en el formato específico.</li>
		<li>Realice la agrupación utilizando el módulo de generación de perfiles del mismo software. Seleccione la opción Herramientas, luego Proceso por lotes y, a continuación, Agrupación espectral.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para generar la hoja de agrupación final que se utilizará para el análisis estadístico, seleccione la carpeta que contiene todos los archivos espectrales corregidos de línea base después de hacer clic en Agrupación espectral.</li>
	<li>Divida los espectros en un número determinado de bins de igual tamaño con un ancho espectral definido, que oscila entre 0,01 y 0,04 ppm (se puede optimizar según el estudio). Este proceso simplifica y organiza los datos espectrales, lo que facilita un análisis más coherente. Especifique el tamaño del cubo junto con los valores de ppm inicial y final, y designe la carpeta en la que se guardarán las hojas de discretización de salida.</li>
	<li>Excluir las regiones de desplazamiento químico correspondientes al agua y al disolvente TSP (4,8-5,2 y 0,0-0,7 ppm) para evitar interferencias espectrales 42,43,44.</li>
	<li>Esta hoja de cálculo contiene los nombres de las muestras en una fila y los diferentes valores de bin junto con ppm en las otras filas. Antes de utilizar esta hoja para el análisis estadístico, modifíquela organizando las muestras en grupos para el análisis y guardándola solo en formato delimitado por comas (CSV). NOTA: Por ejemplo, al comparar el grupo leve con el grupo moderado de pacientes con SDRA, organizamos los datos con etiquetas leves y moderadas, agregamos un número de serie y guardamos el archivo en formato CSV.</li>
</ol>
5. Análisis estadístico
NOTA: La hoja de agrupación obtenida del paso anterior sirve como archivo de entrada para el análisis estadístico. En este estudio se utilizó el módulo de análisis estadístico (un factor) del software de análisis estadístico metabolómico.
<ol>
	<li>Antes del análisis estadístico, realice el paso de normalización utilizando suma, registro y Pareto, pero puede variar entre los diferentes estudios45.</li>
	<li>Realizar análisis univariados y multivariados para distinguir los diferentes grupos y determinar la precisión de los metabolitos identificados.<ol>
		<li>Realice el análisis de componentes principales (PCA), el análisis discriminante parcial por mínimos cuadrados (PLS-DA) y el análisis discriminante ortogonal parcial por mínimos cuadrados (OPLS-DA) para observar la discriminación entre los grupos, lo que produce puntuaciones de importancia variable de proyección (VIP) para cada metabolito responsable de la diferencia en el perfil metabólico.</li>
		<li>Realizar métodos univariantes, como la prueba t de Student y el ANOVA, para identificar los metabolitos significativos en función del criterio de tener un valor p inferior a 0,05. Ambas pruebas producen diagramas de bigotes de caja que muestran la diferencia en la concentración relativa de los metabolitos.</li>
		<li>Realice un análisis de biomarcadores, que arroja un gráfico de área bajo la curva de características operativas del receptor (AUROC). El valor de AUC (área bajo la curva) &gt; 0,8 se considera significativo46.</li>
		<li>Seleccione la lista final de metabolitos significativos utilizando el criterio VIP score&gt;1, p-value corregido de Bonferroni&lt;0.0544 y AUC &gt; 0.846.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Identifique los metabolitos como se describe a continuación.<ol>
		<li>La agrupación proporciona metabolitos significativos en forma de valores de ppm en lugar de nombres. Identificar los metabolitos correspondientes a valores específicos de ppm utilizando bases de datos como el Banco de Resonancia Magnética Biológica (BMRB)47y la Base de Datos de Metaboloma Humano (HMDB).</li>
		<li>Aparte de estos, utilice la literatura publicada previamente42,44 para la identificación y validación.</li>
		<li>Utilice el módulo de perfil del software de cuantificación de metabolitos de RMN para confirmar los metabolitos identificados con sus valores de ppm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Cuantificación de metabolitos mediante software de cuantificación de metabolitos por RMN
NOTA: El módulo de perfilado del software se utiliza ampliamente para cuantificar los metabolitos identificados.
<ol>
	<li>Antes de comenzar la cuantificación, calibrar el compuesto de referencia seleccionado para el estudio (tsp utilizado en este estudio) utilizando el módulo del procesador. Haga clic en la opción Calibrar CSI (indicador de forma química). Mencione la concentración del compuesto de referencia (0,05 mM para este estudio). A continuación, arrastre el pico del software al pico de referencia espectral y ajuste su altura y anchura correctamente. Una vez que los picos de referencia espectral coincidan con el pico del software, haga clic en Aceptar.</li>
	<li>Abra los espectros deseados en el módulo de perfilado y seleccione la biblioteca de compuestos adecuada para el estudio.</li>
	<li>En la parte inferior de la pantalla, se muestra una lista de metabolitos. Seleccione el metabolito de interés de esta lista. Una vez seleccionado, las posibles ppm del metabolito elegido aparecerán en la esquina superior de los espectros.</li>
	<li>Seleccione el valor de ppm en la esquina superior y amplíe los espectros a la escala específica de ppm del metabolito.</li>
	<li>En este punto, aparecerán dos picos en la pantalla: uno que representa los datos registrados y el otro, que se muestra como una línea de puntos, que representa el pico del software. Alinea ambos picos. Arrastre el pico del software y ajuste su altura y posición para que coincida con el pico presente en la muestra.</li>
	<li>Una vez alineados correctamente, la concentración del metabolito puede obtenerse a partir del valor que se muestra en el epígrafe concentración en mM para ese metabolito (Figura 1).</li>
	<li>Siga el mismo procedimiento para todos los metabolitos y muestras y exporte los valores cuantificados en una hoja de cálculo. Para generar el archivo de salida, haga clic en la opción Operaciones por lotes en el menú Herramientas . Especifique la carpeta deseada para guardar el archivo de salida.</li>
</ol>
7. Análisis de la vía
NOTA: Los metabolitos significativos identificados después del análisis se utilizan para determinar las principales vías que influyen directamente en el resultado en los grupos de enfermedades. El módulo de análisis de vías del software de análisis estadístico metabolómico y la base de datos KEGG se emplean generalmente para este propósito.
<ol>
	<li>Introduzca la lista obtenida de metabolitos significativos en el módulo. Se genera una lista que contiene los nombres de las rutas.</li>
	<li>Seleccione las vías finales en función de un criterio de tener un factor de impacto superior a 0,1. Los valores de impacto significativos indican vías relacionadas con la enfermedad30.</li>
	<li>Analice a fondo las vías resultantes para dilucidar la desregulación asociada con la gravedad de la enfermedad. Uno de los deméritos de este método es su ineficiencia para identificar las vías desreguladas cuando los metabolitos significativos son inferiores a 3.</li>
	<li>Para hacer frente a la misma, el metabolito identificado y su correlación con la gravedad de la enfermedad también se puede determinar utilizando la literatura previamente publicada. Realice un estudio exhaustivo de la literatura y observe si el metabolito identificado también sigue la misma tendencia según su interés.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67319/67319fig01.jpg"> 
Figura 1: Pasos fundamentales en la metabolómica basada en RMN. La figura presenta los pasos clave en la metabolómica basada en RMN: recolección y preparación de muestras, realización de espectroscopia de RMN, preprocesamiento de datos, realización de análisis estadísticos, identificación y cuantificación de metabolitos e interpretación de la importancia biológica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67319/67319fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Metabolómica mediante espectroscopia de RMN para identificar metabolitos desregulados

<table><tbody><tr><td>Centirfuge</td><td>Sigma aldrich</td><td>3-18KS</td><td></td></tr><tr><td>Chenomx NMR suite&nbsp;</td><td>Suite de resonancia magnética, v9, Chenomx Inc., Edmonton, Canadá</td><td></td><td>Software de cuantificación de metabolitos de RMN</td></tr><tr><td>Inserto coaxial</td><td>Sigma aldrich</td><td>Z278513</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de Deuterim</td><td>Sigma aldrich 151882</td><td></td><td></td>Tubos</tr> de <tr><td>Eppendorf</td><td>Tarsons</td><td>500020</td><td></td></tr><tr><td>Metaboanalista</td><td>Grupo</td><td></td> de Investigación Wishart <td>Software de análisis estadístico de metabolómica</td></tr><tr><td>Tubo de RMN</td><td>Wilmad</td><td>Z412007</td><td>5 mm de diámetro</td></tr><tr><td>Pipeta Eppendorf research plus</td><td>3123000039</td><td></td><td>0-100 &mu; l</td></tr><tr><td>Viales de recogida de muestras</td><td>Viales de enfriamiento criogénico Tarsons</td><td>523194</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Sigma aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Cristal de cloruro de sodio</td><td>Sigma aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma aldrich</td><td>567550</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico</td><td>Sigma aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Topspin 3.6.4</td><td>Herramienta de procesamiento y análisis de RMN</td><td>Bruker</td><td></td></tr><tr><td>Tsp salt</td><td>Sigma aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación y cuantificación de metabolitos alterados en pacientes críticos mediante metabolómica basada en rmn

Identification and Quantification of Deranged Metabolites in Critically Ill Patients Using NMR-Based Metabolomics

Para llevar a cabo un estudio de metabolómica, es fundamental determinar el tamaño de la muestra y los grupos específicos que se van a analizar. La selección de un tamaño de muestra adecuado es esencial para obtener resultados significativos que se correlacionen con precisión con la gravedad de la enfermedad48. Sin embargo, en este trabajo en particular, utilizamos un tamaño de muestra pequeño para demostrar los pasos involucrados en la identificación y cuantificación de metabolitos utilizando metabolómica basada en RMN, que estaba destinada principalmente como referencia. En este estudio, examinamos las diferencias metabólicas entre los pacientes en las etapas leve y moderada del SDRA en el día 1 de su ingreso en la UCI, incluyendo un total de 8 sujetos. Siguiendo el protocolo, se adquirieron y procesaron los espectros de RMN de todas las muestras y, finalmente, se creó una hoja de cálculo con los resultados del binning.
A continuación, se realizó un riguroso análisis estadístico, donde se utilizaron las hojas de agrupación como archivos de entrada, normalizando los datos mediante suma, registro y Pareto. Se realizó PCA (Figura 2A) y OPLS-DA (Figura 2B), donde el primero mostró agrupamiento, pero el segundo reveló una clara discriminación entre los grupos y resaltó las diferencias metabólicas. El análisis estadístico de la prueba de permutación (20x) arrojó valores de R2Y=0.99 y Q2=0.47. Posteriormente, realizamos una prueba t de student (Figura 2C) y un análisis de biomarcadores (Figura 2D) para identificar metabolitos desregulados. Siguiendo los criterios descritos en el apartado de protocolo, filtramos los resultados a los metabolitos significativos (Tabla 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67319/67319fig02.jpg"> 
Figura 2: Análisis multivariado y univariado. (A) Análisis de componentes principales (PCA) y (B) Análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales (OPLS-DA) de pacientes con SDRA leve (representado por color rojo) y pacientes con SDRA moderado (representado por color verde). (C) Los diagramas de caja y bigotes resaltan las diferencias en la concentración relativa de metabolitos entre los pacientes con SDRA leve y moderado detectados por espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protones en muestras de suero. El eje x representa los grupos de estudio, y el eje y muestra la concentración relativa cuando se compararon los pacientes con SDRA leve (representados por color rojo) y los pacientes con SDRA moderado (representados por color verde) el día 1 de ingreso en la UCI. (D) El diagrama de área bajo la curva (AUC) de metabolitos significativos que predicen la gravedad obtenido después de realizar un análisis de biomarcadores comparando pacientes con SDRA leve y moderado el día 1 de ingreso en la UCI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67319/67319fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>S.No.</td>
			<td>Nombre</td>
			<td>Ubicación espectral (ppm)</td>
			<td>Valor p</td>
			<td>VIP</td>
			<td>Valor de AUC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>Lactato</td>
			<td>1.34</td>
			<td>0.04</td>
			<td>1.99</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>Isoleucina</td>
			<td>1.42</td>
			<td>0.03</td>
			<td>2.01</td>
			<td>0.875</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: Listado de metabolitos significativos obtenidos tras comparar pacientes con SDRA leve y moderado en el día 1 de ingreso en UCI.
Dado que los resultados se obtuvieron en valores de ppm, se asignaron los metabolitos utilizando la literatura previa y se validaron a través del perfilador. Después de la asignación, se obtuvieron lactato e isoleucina como metabolitos significativos, que también han sido reportados en algunos estudios previos sobre el SDRA30,40. Nos aseguramos de la selección de picos bien resueltos y no superpuestos. Después de la identificación, filtramos la lista de los metabolitos significativos utilizando los criterios mencionados en el protocolo. A continuación, cuantificamos los metabolitos de interés utilizando el módulo de perfilado abriendo los espectros, buscando el metabolito de interés y ajustando el pico del software al pico obtenido en los espectros. Esto proporcionó los valores cuantificados de los metabolitos en mM. Se generó una hoja de cálculo que contenía los nombres de las muestras, los nombres de los metabolitos y las concentraciones como referencia. Después de la cuantificación con el software, se puede realizar la validación a través de otros enfoques, como la proteómica.
Además, los metabolitos identificados se analizan a fondo para determinar su correlación con la gravedad de la enfermedad y para identificar las vías bioquímicas en las que estos metabolitos están activamente involucrados. Dado que solo se identificaron dos metabolitos significativos después de utilizar los criterios mencionados en la sección de material y método, no fue posible el análisis de la vía utilizando el software. Por lo tanto, se realizó una revisión exhaustiva de la literatura para resaltar los ciclos metabólicos desquiciados. Los dos metabolitos identificados en este estudio se correlacionaron con éxito con la gravedad del SDRA. El aumento del lactato denotó inflamación pulmonar y respiración anaeróbica, mientras que el aumento de la isoleucina indicó catabolismo proteico asociado con lesión pulmonar, infección y metabolismo energético40. La comprensión de estas vías metabólicas tiene un doble propósito. En primer lugar, revela la complejidad de la enfermedad, proporcionando información sobre sus mecanismos biológicos. En segundo lugar, ayuda a los avances terapéuticos al guiar a los médicos en la adaptación de los tratamientos para los pacientes, mejorando en última instancia los resultados clínicos.

Identificación y cuantificación de metabolitos alterados en pacientes críticos mediante metabolómica basada en RMN

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