Name: Presentación de Proteoformas de Histonas mediante electroforesis en gel 2D-TAU (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Aprende a caracterizar proteoformas de histonas mediante electroforesis 2D-TAU y espectrometría de masas. Este método facilita el análisis de modificaciones epigenéticas para identificar nuevas dianas terapéuticas en cáncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Separación en gel 2D para el enriquecimiento de isoformas de histonas y la caracterización de PTM

<ol><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Cutter, A. R., Hayes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+nucleosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A brief review of nucleosome structure.</a> FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).</li>
<li>Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+post-translational+modifications+-+cause+and+consequence+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function.</a> Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+epigenetic+modifications+on+the+path+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer.</a> Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).</li>
<li>Kinnaird, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+control+of+epigenetics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metabolic control of epigenetics in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (11), 694-707 (2016).</li>
<li>Díaz-Hirashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+signaling+to+chromatin+modifications+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and signaling to chromatin modifications in tumorigenesis.</a> Adv Exp Med Biol. 1219, 225-241 (2020).</li>
<li>Panatta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+by+p53+prevents+R-loop-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation by p53 prevents R-loop-associated genomic instability.</a> Cell Rep. 41 (5), 111568(2022).</li>
<li>Scumaci, D., Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+meets+metabolism%3A+novel+vulnerabilities+to+fight+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Epigenetic meets metabolism: novel vulnerabilities to fight cancer.</a> Cell Commun Signal. 21 (1), 249(2023).</li>
<li>Chiaradonna, F., Scumaci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metabolism+as+a+new+real+target+in+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cancer metabolism as a new real target in tumor therapy.</a> Cells. 10 (6), 1393(2021).</li>
<li>Scumaci, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DJ-1+proteoforms+in+breast+cancer+cells%3A+The+escape+of+metabolic+epigenetic+misregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">DJ-1 proteoforms in breast cancer cells: The escape of metabolic epigenetic misregulation.</a> Cells. 9 (9), 1968(2020).</li>
<li>Olivo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+beyond+the+tip+of+the+iceberg%3A+DJ-1+implications+in+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Moving beyond the tip of the iceberg: DJ-1 implications in cancer metabolism.</a> Cells. 11 (9), 1432(2022).</li>
<li>Zheng, Q., Maksimovic, I., Upad, A., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications%3A+a+new+link+between+metabolism+and+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications: a new link between metabolism and epigenetics.</a> Protein Cell. 11 (6), 401-416 (2020).</li>
<li>Maksimovic, I., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications+as+a+new+chapter+in+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications as a new chapter in the histone code.</a> Trends Biochem Sci. 46 (9), 718-730 (2021).</li>
<li>Lowe, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+mutations%3A+an+updated+view+of+their+role+in+chromatin+deregulation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Histone H3 mutations: an updated view of their role in chromatin deregulation and cancer.</a> Cancers. 11 (5), 660(2019).</li>
<li>Karsli-Ceppioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epigenetic+landscape+of+promoter+genome-wide+analysis+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The epigenetic landscape of promoter genome-wide analysis in breast cancer.</a> Sci Rep. 7 (1), 6597(2017).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+and+drug+resistance+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase and drug resistance in cancers.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 173(2020).</li>
<li>Vardabasso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+variants%3A+emerging+players+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Histone variants: emerging players in cancer biology.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (3), 379-404 (2014).</li>
<li>Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+alterations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic alterations in cancer.</a> Front Biosci. 25 (6), 1058-1109 (2020).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2AX+promotes+metastatic+progression+by+preserving+glycolysis+via+hexokinase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Histone H2AX promotes metastatic progression by preserving glycolysis via hexokinase-2.</a> Sci Rep. 12 (1), 3758(2022).</li>
<li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF506-dependent+positive+feedback+loop+regulates+H2AX+signaling+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZNF506-dependent positive feedback loop regulates H2AX signaling after DNA damage.</a> Nat Commun. 9 (1), 2736(2018).</li>
<li>Ribeiro-Silva, C., Vermeulen, W., Lans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF%3A+Complex+complexes+in+genome+stability+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF: Complex complexes in genome stability and cancer.</a> DNA Repair. 77, 87-95 (2019).</li>
<li>Yang, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epigenetic+regulation+in+plasticity+of+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of epigenetic regulation in plasticity of tumor immune microenvironment.</a> Front Immunol. 12, 640369(2021).</li>
<li>Miranda Furtado, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidrugs%3A+targeting+epigenetic+marks+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epidrugs: targeting epigenetic marks in cancer treatment.</a> Epigenetics. 14 (12), 1164-1176 (2019).</li>
<li>Thomas, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%3A+best+practices+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: best practices and pitfalls.</a> Methods. 184, 53-60 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Kwak, H. G., Dohmae, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+histone+variants+in+the+mouse+testis+by+mass+spectrometry-based+top-down+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Trends%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of histone variants in the mouse testis by mass spectrometry-based top-down analysis.</a> Biosci Trends. 10, 357-364 (2016).</li>
<li>Sidoli, S., Simithy, J., Karch, K. R., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resolution+data-independent+acquisition+in+an+LTQ-Orbitrap+allows+for+simplified+and+fully+untargeted+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-Orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications.</a> Anal Chem. 87, 11448-11454 (2015).</li>
<li>Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification+and+analysis+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification and analysis of histones.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).</li>
<li>Basak, S. K., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophoretic+mobilities+of+proteins+and+peptides+with+their+physicochemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophoretic mobilities of proteins and peptides with their physicochemical properties.</a> Anal Biochem. 226 (1), 51-58 (1995).</li>
<li>Nuccio, A. G., Bui, M., Dalal, Y., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+methodology+for+identification+of+native+histone+variant+modifications+from+mammalian+tissues+and+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based methodology for identification of native histone variant modifications from mammalian tissues and solid tumors.</a> Methods Enzymol. 586, 275-290 (2017).</li>
<li>Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H. P., Lowndes, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+histones+by+sugar+%CE%B2-N-acetylglucosamine+%28GlcNAc%29+occurs+on+multiple+residues%2C+including+histone+H3+serine+10%2C+and+is+cell+cycle-regulated%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modification of histones by sugar β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated.</a> J Biol Chem. 286 (43), 37483-37495 (2011).</li>
<li>Perri, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+proteomics+reveals+novel+post-translational+modifications+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Histone proteomics reveals novel post-translational modifications in breast cancer.</a> Aging. 11, 11722-11755 (2019).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Omenn, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+human+proteome+reaches+a+major+milestone%3A+%3E90%25+of+predicted+human+proteins+now+credibly+detected%2C+according+to+the+HUPO+human+proteome+project%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Research on the human proteome reaches a major milestone: >90% of predicted human proteins now credibly detected, according to the HUPO human proteome project.</a> J Proteome Res. 19 (12), 4735-4746 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Starkova, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+profile+of+post-translational+modifications+of+histone+H1+in+chromatin+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">The profile of post-translational modifications of histone H1 in chromatin of mouse embryonic stem cells.</a> Acta Naturae. 11 (2), 82-91 (2019).</li>
<li>García-Giménez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+carbonylation+occurs+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Histone carbonylation occurs in proliferating cells.</a> Free Radic Biol Med. 52 (8), 1453-1464 (2012).</li>
<li>García-Saura, A. G., Schüler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP10+multi-site+auto-+and+histone+MARylation+visualized+by+acid-urea+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">PARP10 multi-site auto- and histone MARylation visualized by acid-urea gel electrophoresis.</a> Cells. 10, 654(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditioeritritol</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>D8255&nbsp;</td><td>Reactivo para el mantenimiento &menos; grupos SH en el estado reducido; reduce cuantitativamente los disulfuros.</td></tr><tr><td>Tampón Tris-HCL de 1,5 M, pH 8,8</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0798</td><td>Tampón de gel resolutivo</td></tr><tr><td>10x Tris/Glicina/SDS&nbsp;</td><td>BIO-RAD&nbsp;</td><td>1610772</td><td>Utilice este tampón de ejecución premezclado 10x Tris/glycine/SDS para separar muestras de proteínas mediante SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33539</td><td>El 2-Propanol (Isopropanol) es un alcohol secundario. Se ha probado como sustituto del combustible para su uso en diversas pilas de combustible. El polvo de CuO disuelto en 2-propanol se ha utilizado para la síntesis asistida por ablación láser de coloides de Cu. La suspensión de 2-propanol con Zn(NO3)2 se ha empleado para la fabricación de fotoánodo de acero inoxidable (P25-TiO2/SS) recubierto de dióxido de titanio recubierto con una capa uniformemente gruesa de P25-TiO2. Este fotoánodo se utilizó para el proceso de degradación fotocatalítica electroquímica (ECPC).</td></tr><tr><td>30% Acrilamida/Solución Bis&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1610158</td><td>reticulante al 2,6%. Reactivo de pureza de electroforesis&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido acético Glacial</td><td>Carlo Erba Reagennts</td><td>401392</td><td>El ácido acético es un importante reactivo químico con muchas aplicaciones industriales.</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Panreac Applichem</td><td>211007.1214</td><td>Acetona&nbsp; es un solvente, reconocido por su versatilidad en diversas aplicaciones de laboratorio, fabricación y limpieza.</td></tr><tr><td>Acetonitile</td><td>VWR</td><td>83640320</td><td>para HPLC&nbsp; &nbsp; Agarosa grado LC-MS</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td>Agarosa&nbsp; es a&nbsp; heteropolisacárido&nbsp; De uso frecuente en biología molecular.</td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A6141</td><td>mínimo 99,0%</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3678</td><td>Para biología molecular, para electroforesis, &ge; 98%&nbsp;</td></tr><tr><td>Bioruptor plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001 - B01020002- B01020003</td><td>sonicador</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>D9163-5G</td><td>Agente reductor utilizado para reducir los enlaces disulfuro en proteínas.</td></tr><tr><td>Kit de tinte de plata Dodeca &nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0480</td><td>El kit de tinción de plata Dodeca es fácil de usar para la detección de niveles no agramáticos de proteínas en geles de poliacrilamida.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>GE - Healthcare Life Sciences</td><td>171325010L</td><td>El glicerol es un compuesto triol simple, que participa para ayudar en la fundición de geles de gradiente, estabilizador de proteínas y componente tampón de almacenamiento.</td></tr><tr><td>Inhibidor de la fosfatasa Halt&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78428</td><td>Thermo Scientific Halt Phosphatasa Inhibid Cocktail conserva el estado de fosforilación de las proteínas durante y después de la lisis celular o la extracción de proteínas tisulares&nbsp; Cóctel de un solo uso (100X).&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Inhibidor de la proteasa Halt&nbsp;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78430</td><td>Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) son soluciones madre concentradas listas para usar de inhibidores de proteasa que se añaden a las muestras para evitar la degradación proteolítica durante la lisis celular y la extracción de proteínas. Cóctel de un solo uso (100X).&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H1758</td><td>BioReactivo, para biología molecular</td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I6125</td><td>&ge; 99% (RMN), cristalino</td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541</td><td>Cloruro de potasio, KCl, is&nbsp; Generalmente se utiliza en rutinas de laboratorio. Su uso como tampón de almacenamiento para electrodos de pH y como solución de referencia para mediciones de conductividad está bien establecido.</td></tr><tr><td>Línea celular MCF10</td><td>atcc</td><td>CRL-10317&nbsp;</td><td>Línea celular epitelial que se aisló en 1984 de la glándula mamaria de una mujer blanca de 36 años con mamas fibroquísticas. Esta línea celular fue depositada por la Fundación del Cáncer de Michigan.</td></tr><tr>El cloruro <td>de magnesio MgCl2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>208337</td><td>es un sólido cristalino incoloro.</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilene-diamina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9281</td><td>Para electroforesis, aprox. 99%</td></tr><tr><td>Tampón salino de fosfato 1X</td><td>Corning</td><td>15373631</td><td>1 X PBS (solución salina tamponada con fosfato) es&nbsp; un búfer&nbsp; solución salina equilibrada &nbsp; Se utiliza para una variedad de aplicaciones biológicas y de cultivo celular, como el lavado de células antes de la disociación, el transporte de células o tejidos, la dilución de células para el recuento y la preparación de reactivos.</td></tr><tr><td>Hexacianoferrato de potasio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>60299</td><td>Aceptor de electrones, empleado en sistemas que involucran transporte de electrones,</td></tr> <tr><td>solución SDS 20% (w/v)&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0418</td><td>Dodecil sulfato de sodio. Reactivo de pureza de electroforesis&nbsp;</td></tr><tr><td>Tiosulfato de sodio, ReactivoPlus 99%</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>21.726-3</td><td>Tiosulfato de sodio, ReactivoPlus 99%</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339741</td><td>Ácido sulfúrico, Reactivo, is&nbsp; Un ácido extremadamente corrosivo que se presenta en forma de líquido amarillento y ligeramente viscoso. Es soluble en agua y es un ácido diprótico. Tiene propiedades corrosivas, deshidratantes y oxidantes muy fuertes, además de ser higroscópico.</td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6399-5G</td><td>El ácido tricloroacético (TCA) es&nbsp; Se utiliza como reactivo para la precipitación de proteínas1,2 y ácidos nucleicos3.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Riedel-de Ha&euml; n</td><td>34957</td><td>Ácido trifluoroacético</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>T9284-1L</td><td>Triton X-100 es un tensioactivo de polioxietileno no iónico que se utiliza con mayor frecuencia para extraer y solubilizar proteínas.</td></tr><tr><td>Tripsina del páncreas porcino</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6567</td><td>Grado proteómico, biorreactivo, dimetilado</td></tr><tr><td>UREA</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33247</td><td>La urea es un agente caotrópico y se utiliza para la desnaturalización de proteínas. Altera los enlaces de hidrógeno en la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas. También puede alterar los enlaces de hidrógeno presentes en la estructura secundaria del ADN</td></tr></tbody></table>

presentación de proteoformas de histonas mediante electroforesis en gel 2d-tau

Unveiling Histone Proteoforms using 2D-TAU Gel Electrophoresis

En la Figura 1A, es posible observar cómo migran las proteínas histonas en un gel 1D. Este es un paso preliminar importante para comprender el tiempo de ejecución de la primera dimensión. Una vez que se determine el momento correcto de separación, ejecute la segunda dimensión. El mapa 2D de las proteoformas de histonas muestra un patrón topográfico distintivo (Figura 1B). Cada punto de la Figura 1B representa un tipo de histona específico. Observe la región exacta del gel donde se puede encontrar cada proteoforma de histona. La identificación por espectrometría de masas para cada proteoforma de histonas se reporta en Perri et al.32. Por lo tanto, cada mancha en esta condición se asocia con un tipo de histona específico. La presencia de manchas adicionales, junto a las canónicas, puede indicar la existencia de modificaciones novedosas. Las imágenes en gel se pueden adquirir mediante densitometría, y la imagen resultante se puede analizar mediante un software de análisis de imágenes.
La fiabilidad del mapa TAU 2D depende de la rotundidad del lugar. Si la carrera se ha realizado correctamente, los puntos aparecerán como señales distintas y no se verán rayas horizontales y verticales. Por el contrario, las impurezas en la muestra, las soluciones y la capa de agarosa pueden causar rayas y/o rayas en el gel. La calidad del gel influirá en la digitalización de la imagen y en el posterior análisis cuantitativo y cualitativo. Además, podría influir en el éxito del análisis de Western Blot y de las investigaciones de EM. Para verificar la fiabilidad del método, sondeamos la membrana de nitrocelulosa de las proteoformas de histonas resueltas con el anticuerpo primario Acetyladed-Lysine (Ac-K2-100) Rabbit mAb32 (Figura 2). Se utilizó un anticuerpo secundario HRP anti-conejo para detectar las señales de histonas. Como era de esperar, utilizando un densitómetro, es posible cuantificar la peculiar modificación postraduccional en cada variante de histonas presente en el blot.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig01.jpg"> 
Figura 1: TAUgel 1D y 2D. (A) Imagen representativa del patrón topográfico de histonas obtenida con TAUgel 1D. (B) Imagen representativa del patrón topográfico de histonas obtenida mediante TAUgel 2D. Las identificaciones de los datos son reportadas por Perri et al. 32. Como era de esperar, cada mancha representa una proteoforma de histona específica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig02.jpg"> 
Figura 2: Western blot representativo de 2DTAU. En la imagen, es posible observar el nivel de acetilación de lisina en cada proteoforme de histonas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reactivos</td>
			<td>Concentración: 15%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrilamida/Bis</td>
			<td>3.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 M Tris pH 8.8</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agua MilliQ</td>
			<td>3.6 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% SDS</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% APS</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Resolución de la composición de la solución de gel.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paso</td>
			<td>Hora</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fijación 50% metanol / 5% ácido acético</td>
			<td>1 h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lavar 30% etanol</td>
			<td>2 x 20 minutos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lavar el agua desionizada</td>
			<td>1 x 20 minutos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reactivo de tiosulfato sensibilizador</td>
			<td>1 minuto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lavar el agua desionizada</td>
			<td>3 x 20 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plata Nitrato de plata</td>
			<td>30 minutos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lavar el agua desionizada</td>
			<td>3 x 1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desarrollador de Desarrollo</td>
			<td>25-30 min Nota: Desarrollar el gel hasta que las manchas sean visibles (marrón claro)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solución de parada</td>
			<td>1 x 10 minutos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lavar el agua desionizada</td>
			<td>2 x 5 minutos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lavar el agua desionizada</td>
			<td>1 h</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: Método de tinción de plata.

Presentación de Proteoformas de Histonas mediante electroforesis en gel 2D-TAU

Histones undergo various post-translational modifications (PTMs) such as methylation, acetylation, phosphorylation, acylation, and ubiquitination, which ...

unveiling-histone-proteoforms-using-2d-tau-gel-electrophoresis

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video describe un protocolo para evaluar el estado de fosforilación de la proteína tau mediante un ensayo de fosfatasa en células de cáncer colorrectal. La enzima fosfatasa actúa sobre los grupos fosfato presentes en la proteína tau, aumentando la movilidad de la proteína tau en el gel SDS PAGE en comparación con las muestras de proteína tau no tratadas.

Ensayo de fosfatasa en células de CCR: un método para examinar el estado de fosforilación de la proteína tau en células de cáncer colorrectal

Este video demuestra el uso de técnicas de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) para identificar múltiples fosforilaciones en una proteína. La fosforilación de una proteína en un aminoácido específico provoca el desapantallamiento del hidrógeno amida vecino, lo que genera la diferencia espectral.

Espectroscopía de resonancia magnética nuclear para identificar múltiples fosforilaciones en proteínas

Fuente: Bennett, S. A., et al., Caracterización de las alteraciones de la modificación postraduccional de histonas en modelos de proteinopatía neurodegenerativa de levaduras. J. Vis. Exp. (2019). Este video muestra el procedimiento de evaluación de las modificaciones de histonas en células de levadura que sobreexpresan proteínas neurodegenerativas. Los pasos incluyen lisis celular, centrifugación, electroforesis, transferencia de membrana y detección de histonas modificadas basada en...

Detección de modificaciones de histonas en células de levadura con sobreexpresión de proteínas neurodegenerativas

Un protocolo de extracción de proteína común utilizando tampón de urea / tiourea / SDS para el tejido cerebral de ratones humana y permite indentification de proteínas mediante 2D-DIGE y su posterior caracterización en mini inmunotransferencia 2DE. Este método le permite a uno obtener resultados más reproducibles y fiables a partir de biopsias humanas y modelos experimentales.

La proteína obtenida de cerebro de Consenso, protocolo de extracción para el Estudio de los Derechos Humanos y murino cerebro proteoma Uso de ambas 2D-DIGE y Mini 2DE Immunoblotting

Describimos aquí un método para identificar múltiples fosforilaciones de una proteína intrínsecamente desordenada mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), utilizando la proteína Tau como caso de estudio. La Tau recombinante se enriquece isotópicamente y se modifica in vitro mediante una quinasa antes de la adquisición y el análisis de datos.

Nuclear espectroscopía de resonancia magnética para la identificación de múltiples fosforilaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

flexibilidad conformacional desempeña un papel crítico en la función de la proteína. En este documento, se describe el uso de la espectrometría de masas de ionización por electrospray resuelta en el tiempo junto con el intercambio de hidrógeno-deuterio para sondear los rápidos cambios estructurales que impulsan función en proteínas ordenadas y desordenadas.

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Este manuscrito describe protocolos estándar para la medición de la hiperfosforilación de tau, medición de enlace de tau a los microtúbulos y la localización de tau intracelular después de tratamientos con fármacos. Estos protocolos pueden utilizarse repetidamente para la detección de drogas u otros compuestos que enlace la hiperfosforilación o microtúbulos tau.

Ensayo para la fosforilación y Microtubule obligatorios junto con la localización de la proteína Tau en células de cáncer colorrectal

Aquí, presentamos una electroforesis en gel bidimensional (2DE) acoplada con espectrometría de masas (MS) para separar e identificar adenoma pituitario humano tejido proteoma, que presenta un patrón de 2DE buena y reproducible. Muchas proteínas se observan en cada punto de 2DE al analizar el proteoma del complejo del cáncer con el uso de MS de alta sensibilidad.

Electroforesis en Gel bidimensional juntada con métodos de espectrometría de masas para el análisis del proteoma de tejido humano Adenoma pituitario

Este protocolo describe procedimientos experimentales para caracterizar el genoma cambios en los niveles de modificaciones post-traduccionales de las histonas (PTM) que ocurre en relación con la sobreexpresión de proteínas relacionadas con la ELA y la enfermedad de Parkinson en Modelos de Saccharomyces cerevisiae . Después de la separación de SDS-PAGE, se detectan niveles PTM de las histonas individuales con anticuerpos específicos a la modificación mediante Western blot.

Caracterización de la histona modificación post-translacional alteraciones en modelos neurodegenerativos Proteinopathy de levadura

El tau es una proteína neuronal presente tanto en el citoplasma, donde se une a los microtúbulos, como en el núcleo, donde ejerce funciones no convencionales, incluida la modulación de genes relacionados con la enfermedad de Alzheimer. Aquí, describimos un método para investigar la función de Tau nuclear excluyendo cualquier interferencia proveniente de Tau citoplasma.

Modulación de la localización subcelular Tau como herramienta para investigar la expresión de genes relacionados con enfermedades

Aprende a caracterizar proteoformas de histonas mediante electroforesis 2D-TAU y espectrometría de masas. Este método facilita el análisis de modificaciones epigenéticas para identificar nuevas dianas terapéuticas en cáncer.

Presentación de Proteoformas de Histonas mediante electroforesis en gel 2D-TAU

Explorar más videos